Genotipificacin del Virus Papiloma Humano (HPV)

por PCR-RFLP en alteraciones cervicales

Deluca, Gerardo D. - Alonso, Jos M. - Lucero, Ral H.
Martn de Civetta, Mara T. - Zibelman de Gorodner, Ofelia L.
Area de Biologa Molecular - Instituto de Medicina Regional - UNNE.
Av. Las Heras 727 - (3500) Resistencia - Chaco - Argentina.
Tel./Fax: +54 (03722) 428213 / 422793
E-mail: rhlucero@bib.unne.edu.ar
ANTECEDENTES

Los virus papiloma humanos (HPV) son virus a ADN capaces de generar lesiones verrugosas mediante la induccin de
la proliferacin celular, durante el curso de una infeccin productiva .
El cncer de crvix es la segunda o tercer causa ms comn de cncer en las mujeres en todo el mundo. En Argentina
no se cuenta con suficientes datos epidemiolgicos para evaluar con exactitud la situacin global de esta patologa, pero
los estudios regionales realizados hasta el momento muestran una amplia variacin en la incidencia que va desde 1-3
casos por cada 100.000 mujeres residentes en reas metropolitanas, hasta 4 casos por cada 1000 mujeres en la regin
Nordeste del pas. Adems, est perfectamente reconocida la asociacin entre esta patologa y la infeccin persistente
por ciertos genotipos de HPV.
El HPV infecta las clulas germinales de los epitelios, a las cuales llega a travs de microlesiones o abrasiones,
pudiendo la infeccin ser transitoria o persistente. Las primeras se caracterizan por ser autolimitadas y en un lapso de
tiempo que depende de las condiciones inmunolgicas del hospedador remiten espontneamente; en tanto que en las
segundas el sistema de control inmunolgico no responde adecuadamente y el virus no es depurado del organismo,
convirtindose en un factor favorecedor para el desarrollo de cncer cervical, particularmente si la infeccin es causada
por un genotipo de alto riesgo. Se ha podido observar que en todos los cnceres cervicales hay integracin del genoma
viral en clulas neoplsicas, por lo que se piensa que esto es una condicin necesaria para su desarrollo.
Se han identificado hasta el presente alrededor de 80 genotipos virales de HPV, de los cuales ms de 30 infectan la
regin anogenital y al menos 10 de ellos estn asociados con el cncer cervical. De esto resulta que la asociacin entre
la infeccin por HPV y las lesiones anogenitales es un fenmeno ms complicado de lo esperado.
Los genotipos HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59 y 68 son considerados de alto riesgo
porque fueron identificados en pacientes que desarrollaron neoplasias cervicales; los genotipos HPV-6, -11, -40, -42, 43, -44 y 55 son considerados de bajo riesgo2 y a los HPV 6, -11 y -42 se los relaciona a las verrugas genitales
(condilomas).
En el Nordeste Argentino, a pesar de ser una zona de alta prevalencia de cncer cervical, se realizaron pocos estudios
epidemiolgicos y en la mayora de ellos slo se evalu la presencia de los genotipos ms comunes, es decir el 6, 11,
16 y 18. Sin embargo, es necesario estudiar la presencia de otros genotipos de HPV tambin asociados con el cncer
cervical, debido a que se han encontrado diferencias geogrficas en la prevalencia de los distintos tipos virales.
El objetivo del presente trabajo fue determinar los genotipos circulantes de HPV, presentes en mujeres con alteraciones
ginecolgicas compatibles con infeccin por este virus en el Nordeste de Argentina.
MATERIAL Y METODOS

La deteccin y tipificacin del virus papiloma humano en clulas o tejidos se efectu mediante amplificacin por PCR
de un fragmento genmico y posterior anlisis por restriccin enzimtica (RFLP)
Productos utilizados en la presente tcnica:

Primers consenso My09 y My11.

Enzimas de restriccin Bam HI, DdeI, Hae III, HinfI, PstI y RsaI
Control positivo: DNA de la lnea celular CaSki que contiene integrado genoma de HPV-16

Material de muestra
Los materiales de estudio consistieron en:
Clulas obtenidas por cepillado cervico-vaginal de las lesiones observadas en el tracto genital.
Tejido fresco de biopsia obtenido para estudios histolgicos.

Fuentes del material estudiado

Material recibido del Servicio de Ginecologa del Hospital Vidal de la ciudad de Corrientes.
Material cedido por distintos centros ginecolgicos privados de las ciudades de Resistencia y Corrientes.

Pacientes
Se estudiaron un total de 60 mujeres, con edades comprendidas entre los 18 y 60 aos de edad y distribuidas de la
siguiente manera: 39 que presentaban lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (LG-SIL), 6 de alto grado (HGSIL), 3 que presentaban clulas escamosas atpicas de significado indeterminado (ASCUS), y 12 mujeres que
presentaban cncer cervical en distintos estados, de acuerdo a la clasificacin de Bethesda.
RESULTADOS

En las 60 mujeres estudiadas, se encontr en 37 la presencia de ADN viral (62%), con una distribucin segn el tipo de
alteracin citolgica que se presenta en la Tabla 1.
Los distintos genotipos de HPV identificados y su distribucin segn los patrones histopatolgicos se presenta en la
Tabla 2.
Se encontraron 5 casos de infecciones virales producidas por ms de un genotipo viral. Tabla 3
Tabla 1: Resultados de deteccin del virus papiloma humano (HPV) en funcin del diagnstico citohistolgico.
ASCUS

LSIL

HSIL

CANCER

TOTALES

Positivos

2 (66%)

20 (51%)

5 (83%)

10 (83%)

37 (62%)

Negativos

1 (34%)

19 (49%)

1 (17)

2 (17%)

23 (38%)

TOTALES

39

12

60

Tabla 2: Genotipos de HPV identificados y su relacin con los patrones histopatolgicos

Genotipos

ASCUS

LSIL

HSIL

CANCER

Totales (%)
N = 37

16

18

2 (5,4)

33

1 (2,7)

45

52

1 (2,7)

53

1 (2,7)

54

1 (2,7)

56

1 (2,7)

58

66

1 (2,7)

MM4

1 (2,7)

LVX100

No determinados*

Indeterminados
* RFLP no realizada

2 (5,4)
3

12 (32,4)

2 (5,4)

5 (13,5)

1 (2,7)
3

6 (16,2)
4 (10,8)

Tabla 3: Genotipos de virus papiloma humano (HPV) identificados y patrones histopatolgicos correspondientes a
casos de infecciones mixtas.
Genotipos

LSIL

58 45

6 33

HSIL

16 58
16 66

Indeterminado

DISCUSION

La alta frecuencia de infeccin por HPV reportada en el Norte Argentino en publicaciones previas, es comparable con la
importante prevalencia de casos de cncer de crvix que se presentan en la regin. En este trabajo se analizaron
muestras provenientes de pacientes con evidentes alteraciones citolgicas que hacan prever la posible infeccin por
HPV, hallndose efectivamente una alta incidencia, particularmente entre los HSIL y entre los casos de cncer, mientras
que en los LSIL la presencia del ADN viral fue confirmada slo en el 51% de los casos. Presumimos que esto puede
estar directamente relacionado con el nmero de casos estudiados por lo que se podra tener una mejor estimacin si se
considerase un mayor nmero de pacientes con LSIL.
La tcnica de PCR-RFLP tiene la caracterstica de poder determinar ms de 30 genotipos virales anogenitales con una
nica reaccin de amplificacin y sta es su mayor ventaja frente las metodologas que emplean primers especficos,
pero su mayor desventaja es justamente no poder definir en ciertos casos los genotipos asociados cuando se presentan
infecciones mixtas que frecuentemente producen patrones de restriccin confusos. En estos casos se puede optar por
otras metodologas moleculares de identificacin como son la PCR con posterior hibridacin por dot blot, PCR con
primers especficos, o la secuenciacin.
En este estudio se presentaron 5 muestras con infecciones virales mixtas y en 4 de ellas se pudieron identificar los virus
coinfectantes en base a la restriccin enzimtica. En la muestra restante se deber optar por otra metodologa de
identificacin molecular segn lo dicho en el prrafo anterior.
Seis muestras positivas no pudieron someterse a la restriccin enzimtica debido a la escasa cantidad de material
amplificado, insuficiente para generar un patrn de bandas claro para ser analizado. Suponemos que estos casos pueden
corresponder a aquellos en los que la cantidad inicial de material genmico viral en la muestra obtenida se encuentra en
el lmite de la sensibilidad de la tcnica.
Tambin pudo verse que 4 muestras presentaron patrones que no pudieron ser asociados con ninguno de los HPVs
identificables por la metodologa empleada. Ser entonces necesario realizar la secuenciacin de estos DNAs virales
amplificados para verificar si se trata de variantes intratpicas, subtipos o nuevos genotipos de HPV.
En esta serie el HPV-16 fue el genotipo ms frecuente. Sin embargo, resulta importante la presencia del HPV-58 como
segundo genotipo de mayor frecuencia, debido a que gran parte de las referencias bibliogrficas describen al 18, al
45, al 31 y al -33 como los genotipos ms prevalentes, luego del HPV-16. No obstante, la existencia de divergencias
epidemiolgicas en cuanto a la frecuencia de los HPVs circulantes en distintas regiones del mundo es ya un hecho
conocido.
CONCLUSIONES

Podemos concluir que en el Nordeste Argentino estn presentes los genotipos virales epidemiolgicamente ms
importantes y los resultados del presente estudio demuestran que adems de los HPV-16 y 18, que son los de mayor
prevalencia a nivel mundial, se debe prestar atencin a otros genotipos que pudieran ser de importancia epidemiolgica
local, como ser el HPV-58.
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