ANLISIS DE LIPIDOS POR HPLC

HPLC: anlisis de TGs y fosfolpidos. Molculas pequeas como FA y

esteroles: GC.
Preparacin muestra: lquida (inyeccin directa de aceites). Slidos:
extraccin con solvente apolar (aislar TGs) y clean-up.
Triglicridos: inters para procesado y control alimentos
Grasas: mezclas complejas de TGs, esteroles y vitaminas
Formacin hidroperxidos
enranciamiento
HPLC:

- contenido en TGs, esteroles, vitaminas e hidroperxidos

(UV-DAD), para diferenciar entre TGs saturados e insaturados
- perfil de TGs especfico a cada tipo de aceite, permite
detectar adulteraciones
Deteccin: ndice refraccin (isocrtico). Gradiente con detectores UV y
ELSD.

-Separacin lpidos sencillos: determinar fracciones de steress de

esteroles, cidos grasos libres, TG, DG, esteroles libres,
monoacilgliceroles, ceras. Tradicionalmente anlisis cromatografa
adsorcin columnas slice y ELSD.
-Cromatografa reparto: RP y NP. Separacin TGs con RP y fase mvil
no acuosa (acetonitrilo:acetona) permite separacin en funcin nmero
C.

Anlisis de perfil de TGs en aceite de girasol envejecido.

Deteccin entre 200-215 nm: TGs
Deteccin a 240 nm: hidroperxidos
Deteccin a 280 nm: TGs fragmentados

ANLISIS DE VITAMINAS POR HPLC

- Liposolubles: A, D, E
- Hidrosolubles: C, B6, B12, B2, B1
- Importancia: legislativa, etiquetado, asegurar calidad alimentos
suplementados, estudiar cambios durante procesado, almacenamiento,
etc.
Dificultad anlisis:
- bajas concentraciones
- en presencia de otros compuestos en elevadas
concentraciones y con propiedades qumicas similares
- se degradan con luz, O2, elevadas T
HPLC:

- informacin cualitativa y cuantitativa (UV-DAD y

electroqumica)

Vitaminas hidrosolubles: problemas anlisis de estas vitaminas

relacionados con preparacin muestra antes del anlisis por HPLC
debido a que estas vitaminas se encuentran a menudo ligadas a otros
constituyentes como carbohidratos y protenas.
Vitamina C: 2 vitmeros, ac. Ascrbico y dehidroascrbico.
Actan en otras funciones, previniendo cancer, hipertensin, etc.
Problema: baja estabilidad. Extraccin utilizando cidos
(metafosfrico).
Anlisis HPLC fase inversa con agua a bajos pH. Deteccin: UV a 254
nm (AA) y 210-230 nm (DHAA)
Deteccin fluorescencia despus derivatizacin

Vitamina B1 (tiamina): 4 vitmeros, la forma no fosforilada (tiamina)

mayoritaria en plantas y formas fosforiladas mayoritarias en
productos animales. Deficiencia tiamina asociada a beri-beri.
Extraccin: hidrlisis cida para liberar vitmeros de matrices
alimentarias. A veces es necesaria hidrlisis enzimtica para eliminar
exceso de almidn y protenas.
Clean-up con SPE C18 o columnas intercambio inico
Anlisis HPLC: par inico
Deteccin: fluorescencia (excitacin 365-375 nm y emisin 425-435
nm) despus derivatizacin.
Anlisis vitaminas hidrosolubles en una bebida y espectros vitaminas.
Fase inversa, DAD, Fase mvil: A: agua, B: ACN. Gradiente.
Preparacin muestra (reales): extraccin, hidrlisis, oxidacin, clean-up,
etc.

- Vitaminas liposolubles: se pueden dividir en 4 grupos dependiendo de

su actividad biolgica: vitamina A (retinol y carotenoides), vitamina D
(colecalciferol y ergocalciferol), vitamina E (tocoferoles y tocotrienoles)
y vitamina K (filoquinona y menaquinona).
- Vitamina A: esencial visin, crecimiento, sistema inmune. Fuentes
naturales vitamina A derivan de carotenoides (provitamina A)
sintetizados por plantas superiores y organismos fotosintticos
- Vitamina A sinttica se utiliza como suplemento.
-Anlisis: - saponificacin (liberar retinol esterificado)
- extraccin
- o extraccin directa (hexano) p.ej. vitamina A total leches
- anlisis HPLC: fase normal o inversa
- inversa mejor cuando muestra contiene bajas concentraciones de
triglicridos
- deteccin: UV (328 nm) (fluorescencia nativa baja)
- Vitamina D: prevencin raquitismo y osteomalacia (reblandecimiento
seo). Imprescindible organismos no expuestos a luz solar (dietary
intake). Vitamina D esta presente en alimentos solo a niveles traza.
- Estructura parecida a otros lpidos que se encuentran en
concentraciones muy elevadas: exhaustivo tratamiento muestra previo
anlisis.
-Etapas: saponificacin, extraccin con disolventes y purificacin para
eliminar esteroles, carotenoides, etc.
- Vitaminas D2 y D3 slo se pueden separar en fase inversa utilizando
como f. Mvil metanol:agua o acetonitrilo:agua
- Deteccin: 264 nm

-Vitamina E: se encuentra en aceites vegetales y otros alimentos como

frutos secos, semillas y frutas. 8 formas (tocoferoles y tocotrienoles) con
diferente actividad. Vitamina E: antioxidante lipdico.
- Extraccin directa o saponificacin previa (dependiendo matriz).
- Aceites y grasas: disolucin en hexano y anlisis directo por HPLC
fase normal con slice o fases polares. Es posible separar las 8 formas de
vitamina E en isocrtico.

- Deteccin fluorescencia: nativa muy fuerte (elevada sensibilidad y

selectividad)
- Otros sistemas deteccin: UV (280 nm) y electroqumica (mayor
sensibilidad (ha permitido la deteccin de pmoles de vit E en plasma
humano)

Figure 2. HPLC of Vitamin E. (A) Standards of vitamin E vitamers. Column, 5m Supelcosil LC-Si (250 x 4.6 mm ID); mobile phase, isooctane/ethyl acetate
(97.5:2.5), 1.6 ml/min; fluorescence detection, excitation 290 nm, emission 330
nm. Peaks: (1) -tocopherol; (2) -tocotrienol; (3) -tocopherol; (4) tocopherol; (5) -tocotrienol; (6) -tocotrienol; (7) -tocopherol; (8) tocotrienol. (B) Saponified rice bran sample. Chromatographic conditions as in
(A) except for mobile phase: isooctane/ethyl acetate/2,2-dimethoxypropane
(98.15:0.90:0.85:0.1). Reproduced with permission of AOCS Press.

Anlisis vitaminas liposolubles (tocoferoles). Separacin en fase normal.

Fase mvil: hexano/isopropanol. Isocrtico. Concentracin de
tocoferoles en extracto de margarina, deteccin fluorescencia: long. exc.
295 nm, long. em: 330 nm.

Anlisis vitaminas liposolubles (tocoferoles). Fase inversa, deteccin

electroqumica.

-Vitamina K: actividad antihemorrgica.

- Preparacin muestra: hidrlisis enzimtica y clean up. Anlisis HPLC
en fase normal o inversa.
- Detecccin UV a 270 nm.

-Mltiples vitaminas liposolubles: A, E, D2 y D3

- Fase inversa con metanol:agua y deteccin UV a 263 nm despus
saponificacin.
- Fase normal tambin se ha utilizado (aceites semillas).
- A veces es necesario utilizar varios detectores (UV y fluorescencia)

ANLISIS DE AMINOCIDOS, PPTIDOS Y PROTENAS

POR HPLC
- Anlisis importante desde punto vista nutricional, control de calidad y
control en el desarrollo de nuevos productos (fraccin proteica).
Importante para asegurar autenticidad de alimentos (separacin e
identificacin enantimeros).
Aminocidos
-La composicin en aminocidos de protenas puede usarse para
determinar el origen de carnes: detectar adulteraciones.
-Preparacin muestra distinta si AA libres o totales: AA ligados a
protenas, es necesaria hidrlisis cida o digestin cida previa HPLC.
Posterior etapa clean-up para eliminar interferencias/concentrar muestra
(SPE con cartuchos C18 capaces de retener lpidos y proteinas grandes).
-Anlisis HPLC (intercambio inico) o fase inversa previa
derivatizacin con OPA (aumentar hidrofobicidad).
-Habitualmente la deteccin se lleva a cabo despus de la formacin de
derivados (UV y fluorescencia)
-Derivatizacin on-line (OPA) puede ser: precolumna o postcolumna
-Anlisis aminocidos en cerveza despus derivatizacin on-line con
OPA.

-Fase inversa, fluorescencia, Fase mvil: A: acetato sdico, B: ACN.

Gradiente.

Pptidos
-Preparacin muestra 2 etapas: extraccin y eliminacin protenas (UF)
que permite fraccionamiento de pptidos. Clean-up SPE C18.
-Anlisis columnas RP con cromatografa de par inico (cido
trifluoroactico), intercambio inico, exclusin molecular.
-Deteccin: UV (AA aromticos como tirosina y triptfano) y despues
derivatizacin con cloruro de dansilo.
-Avances deteccin y anlisis de pptidos: LC-ESI-MS, permite
identificacin de biopolmeros de elevado PM generando iones de
mltiple carga.
-Tambin MALDI-TOF-MS: permite medida precisa masa de pptidos y
protenas con una gran sensibilidad (subpicomol).
-Bases de datos que permiten caracterizacin pptidos y secuenciacin.

Protenas
-Habitualmente despus de aislamiento utilizando dilisis, UF,
precipitacin con disolventes orgnicos o sales.
-Anlisis RP-LC, IEC, SEC.
-Separacin protenas utilizando rellenos peliculares, rellenos perfusin
y columnas monolticas.
-Diferentes aproximaciones al problema de baja difusividad protenas en
poros de rellenos convencionales: ensanchamiento y prdida de eficacia.
-Rellenos peliculares, de perfusin y columnas monolticas.
-Polymeric monolithic stationary phases offer an alternative to the
classical microparticulate sorbents, bringing important advantages to
sample analysis. In contrast to the traditional stationary phases, which
consist of packed particles, the monolithic separation medium is made of
a continuous, rigid polymeric rod with a porous structure. The lack of
intraparticular void volume improves mass transfer and separation
efficiency, which allows for very fast separations of biopolymers.

Capillary LC/MS separation of 13 digested proteins. Up to 150 peptides separated in less

than 15 min.

ANLISIS DE CARBOHIDRATOS POR HPLC

Inters anlisis carbohidratos:
- relacin carbohidratos-salud
- control productos bajo contenido caloras/dietticos/diabticos
- industria-control calidad y de adulteraciones, ej: contenido lactosa en
alimentos sin lactosa, contenido fructosa siropes, etc.
Anlisis carbohidratos:
- mtodos qumicos
- mtodos enzimticos
- GC (baja volatilidad, derivados cuantitativos)
- HPLC (mnima preparacin muestra, desarrollo nuevos detectores:
amperomtricos, MS, etc.)
- HPLC, detectores ms utilizados:
ndice refraccin
short wavelength UV
fluorescencia despus de
formacin derivados
amperomtrico
Extraccin con agua previa anlisis HPLC, clean-up SPE.
HPLC con fase ligada a slice amino, diol, ciano, C18, etc. intercambio
inico con resinas aninicas y catinicas, SEC
Anlisis de carbohidratos en limonada. Detector ndice refraccin,
Intercambio inico

CONSERVANTES
Autorizados por la CEE 64/54/CEE de 5/11/63 y post.:
ac. srbico, ctrico, actico, propinico, succnico, fosfrico, lctico,
mlico, tartrico, fumrico, etc.
ACIDULANTES: - agentes saborizantes para intensificar ciertos
sabores y enmascarar algunos otros
- control pH (tampn) durante el procesado y
conservacin
- prevenir crecimiento org
- sinergia con antioxidantes para prevenir
enranciamiento y oscurecimiento
- modifican viscosidad
- modifican punto fusin
PREPARACIN MUESTRA: f(matriz)destilacin, SPE

Intercambio inico
Fase mvil: 0.003 M H2SO4
Longitud onda: 192 nm

Intercambio inico
Fase mvil: 0.007 M H2SO4
DAD

ANTIOXIDANTES
Retardan enranciamiento oxidativo (adicin grasas y aceites en 200
ppm)
ac. ascrbico, tocoferoles, galato propilo (PG), galato octilo (OG),
butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), etc.
En los paises donde est permitido su uso debe determinarse el mximo
nivel de estos compuestos en el alimento.
HPLC: tcnica ms idonea para determinacin antioxidantes de
naturaleza fenlica
PREPARACIN MUESTRA: f(matriz)bajas grasa: L/L
complejas: SPE, L/L,
detilacin

Fase inversa. Fase mvil: A: agua, B: ACN gradiente

DAD

COLORANTES
Color: caracterstica influye directamente rechazo o aceptacin
producto
Antigedad: colorantes naturales (clorofilas, carotenoides, flavonoides,
antocianos plantas, minerales como xidos de hierro, etc.)
Actualidad: colores sintticos. Clasificacin segn estructura qumica:
- azo (mono, di, tris)
- indol
- trifenilmetano
Mtodos HPLC: par inico e intercambio inico
Absorcin UV: longitud onda caracterstica

EDULCORANTES
Edulcorantes no nutritivos:

- sustitutivos sacarosa
- ms utilizados: sacarina
aspartamo
ciclamatos
acesulfamo potsico

Investigacin para detectar la toxicidad de estos compuestos (seguridad

para consumo). Regulacin de su concentracin en alimentos y bebidas
para evitar un consumo excesivo
Aspartamo: derivatizacin en columna (OPA) + anlisis HPLC fase
inversa. Fase mvil: A: acetato sdico, B: metanol. Gradiente.
Deteccin UV 338 nm

ANLISIS DE RESIDUOS Y CONTAMINANTES POR HPLC

Eleccin mtodo anltico:
- especificidad
- sensibilidad
- precisin
- reproducibilidad
- rapidez
Residuos productos zoosanitarios: substancias destinadas al
diagnstico, prevencin o tratamiento de las enfermedades de los
animales que pueden dar lugar, por su mal uso o abuso, a repercusiones
desfavorables para aquellos o para la salud pblica
Clasificacin segn finalidad uso:
- promotores crecimiento
- productos para tratamiento teraputico o
profilctico de enfermedades
Tipos de residuos: - anabolizantes (estrgenos, andrgenos, etc.)
- tireostticos
- antibiticos (cloranfenicol, tetraciclinas)
- sulfamidas (bacteriostticos)
- beta-agonistas (clembuterol)
- plaguicidas (carbamatos, piretrinas, herbicidas)
Necesidad anlisis residuos:
- existencia riesgo potencial salud (hormonas producen alteraciones)
- efecto sobre procesos industriales (antibiticos: bacterias resistentes.
Problemas en la elaboracin yogur/queso)
- ventajas comerciales no legales (tireostticos: fraude)
- aspectos toxicolgicos

Caractersticas residuos:
- presencia muestra prohibida: el residuo o sus metabolitos deben
buscarse en el tejido donde se acumula (ej: tireostticos en tiroides)
- concentracin por debajo niveles autorizados: tomar muestra
representativa de la totalidad
Anlisis residuos
bajas concentraciones (ppm, ppb, ppt) en muestras complejas
Esquema operativo:
1) extraccin
2) purificacin y concentracin
3) deteccin e identificacin
4) cuantificacin
Anlisis residuos de frmacos en huevos. Fase inversa, DAD. Fase
mvil: A: acetato sdico, B: ACN/agua. Gradiente.

Anlisis de micotoxinas: compuestos txicos producidos por hongos.

Anlisis esencial para garantizar seguridad de cereales, aceites semillas,
especias, etc.
Deteccin ppb: concentracin muestra y deteccin con suficiente
sensibilidad. Fase inversa, DAD y detector fluorescencia. Fase mvil:
metanol:agua.

Anlisis de plaguicidas en muestras de ensalada. Fase inversa, UV, Fase

mvil: A: agua, B: ACN. Gradiente.