CAPTULO III

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

1.- Hemocitmetro y test de exclusin de colorante Trypan blue

2.- Citometra de flujo

3.- PCR

4.- Electroforesis en gel

5.- Secuenciacin de DNA

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

1.-Hemocitmetro y test de exclusin de colorante trypan blue

El hemocitmetro empleado para contar las clulas consiste en una rejilla

graduada en la que se cuenta individualmente cada clula pegada a la placa. (Figura 3.1)
Cada cuadrado del hemocitmetro representa un volumen total de 0.1 mm3. Por lo tanto,
la concentracin celular por ml se calcula como:
C (cel / ml ) = c f 104

donde c: promedio de nmero de clulas por cuadrado

f: factor de dilucin

y para calcular el porcentaje de clulas viables simplemente bastar con:

V (%) =

n
100
N

n: n total de clulas viables (sin teir)

N: n total de clulas (teidas y no teidas)

El test de exclusin de colorante trypan blue es un procedimiento para contar

clulas viables a travs de la tincin de las mismas. Este mtodo se basa en el hecho de
que las clulas vivas no incorporan el tinte a su interior, mientras que las muertas o no
viables s lo hacen.

85

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

1 mm

Fig. 3.1: Esquema descriptivo de un hemocitmetro

2.- Citometra de flujo

La citometra de flujo es un mtodo analtico que permite estudiar propiedades

celulares a partir de la medida de emisin de fluorescencia y dispersin de luz
producidas por la iluminacin de clulas expuestas individualmente y arrastradas por un
flujo portador. Las clulas deben encontrarse en suspensin para permitir el paso una a
una , lo cual supone una limitacin para el empleo de la tcnica. Asimismo, las clulas
deben ser marcadas con molculas fluorescentes (fluorocromos) capaces de excitarse
con una fuente luminosa de alta energa, habitualmente luz lser.

Las posibilidades analticas de esta tcnica se han incrementado notablemente

con el desarrollo de un amplio nmero de fluorocromos que se unen especficamente a
molculas celulares, se acumulan selectivamente en compartimentos celulares o

86

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

modifican sus propiedades a travs de reacciones bioqumicas especficas. As, la

citometra de flujo es capaz de detectar y cuantificar estructuras y funciones de clulas
individuales partculas biolgicas aisladas de forma rpida y eficaz. La posibilidad de
combinar diferentes molculas fluorescentes permite realizar un anlisis simultneo de
diferentes parmetros, lo cual supone una ventaja frente a otros sistemas de anlisis
celular.

Un citmetro de flujo est compuesto por diferentes sistemas bsicos como se

describe a continuacin:

- Sistema hidrulico: Es el encargado de enfocar la suspensin celular para

permitir el paso individual de clulas frente al haz de luz. Consiste en una cmara por la
que circula un fluido en rgimen laminar (para evitar mezclas) que envuelve a la
suspensin celular y la mueve a velocidad constante a travs de la zona de deteccin
cmara de flujo. La diferencia de presiones entre la suspensin y la vaina o embudo
formado por el fluido envolvente produce un efecto de enfoque hidrodinmico que
reduce la seccin de paso de la suspensin hasta 50-100 m, logrando una cadena lineal
de clulas a su paso frente a la fuente luminosa.

- Sistema de iluminacin: Este sistema produce un haz de luz que ilumina la

muestra. La fuente suele consistir en uno o ms lseres. Aunque algunos sistemas
emplean lmparas de arco (por ejemplo de mercurio o xenon), la luz lser presenta
importantes ventajas. Se trata de una luz coherente, monocromtica, estable y de
intensidad conocida. El tamao de spot o seccin del rayo puede ajustarse al tamao
tpico celular (5-50 m) manteniendo las propiedades mencionadas. Por ello, resulta
crtico el correcto alineamiento entre el haz lser y la cadena celular en el punto de
interseccin de ambos. El centro del haz lser debe estar orientado de forma que se
logre la mxima intensidad de fluorescencia del fluorocromo presente en la clula.

Los citmetros actuales utilizan gran variedad de fuentes lser que recorren
longitudes de onda del rango visible, desde fuentes de Argon (488 nm) hasta HelioNeon (633 nm). La eleccin del lser empleado en un citmetro de flujo depende del
tipo de anlisis que se desee realizar y, en definitiva, del rango de excitacin de los
fluorocromos usados en dicho anlisis.
87

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

- Sistema ptico: Su funcin es orientar y filtrar la fluorescencia y la luz

dispersada por las clulas hacia los sistemas de deteccin para su posterior anlisis. ste
sistema est formado por filtros que seleccionan las longitudes de onda de inters, y por
espejos dicroicos, que seleccionan y orientan la luz hacia los detectores (Fig. 3.2).

Cuando la clula teida con fluorocromos interacciona con el haz lser ocurren
dos fenmenos independientes. Uno es la dispersin de la luz incidente en todas
direcciones y con la misma longitud de onda, y el otro la emisin de fluorescencia
(emisin de luz de menor energa, mayor longitud de onda) debida a la interaccin entre
el lser y los fluorocromos presentes en la clula. De la luz dispersada por la clula
puede obtenerse informacin acerca de su tamao y complejidad (rugosidad de
superficie y estructura interna). La cantidad de luz dispersada en la

direccin de

incidencia del lser (forward scatter) es proporcional al tamao de la clula si se

supone una forma esfrica y homognea. Esta relacin no es exacta ya que las clulas
reales no cumplen estas condiciones. Por otro lado, se ha mostrado empricamente que
la cantidad de luz dispersada a 90 del haz incidente (side scatter) est relacionada con
la rugosidad de la membrana citoplasmtica y la estructura interna de la clula. Estas
propiedades de dispersin que muestra la clula suelen denominarse propiedades
intrnsecas, ya que pueden ser medidas sin necesidad de aadir fluorocromos.

La fluorescencia emitida por los fluorocromos presentes en la clula se debe a la

absorcin por stos de la luz incidente y la posterior emisin de luz de mayor longitud
de onda. Cada fluorocromo presenta un espectro de absorcin/emisin propio, y por ello
el sistema de filtros y espejos dicroicos resultan necesarios para seleccionar las
longitudes de onda especficas segn el tipo de anlisis que se desee realizar.

- Sistema electrnico y de deteccin: Estos sistemas son los responsables de

controlar variables como la intensidad y orientacin del haz lser, y de detectar y
amplificar las seales producidas por la dispersin y la fluorescencia. Los detectores
suelen ser fotomultiplicadores, ya que al contrario de otro tipo de detectores como las
clulas fotovoltaicas, permiten amplificar seales dbiles.

88

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

- Sistema de adquisicin y anlisis de datos: Permite la adquisicin

multiparamtrica de datos y el anlisis en tiempo real, as como el anlisis restringido a
subpoblaciones seleccionadas. Las diferentes presentaciones de los resultados dependen
del tipo de programas informticos empleados, siendo normalmente histogramas
uniparamtricos o representaciones biparamtricas, junto con informacin estadstica de
las distribuciones.

PMT
4

Cmara de flujo

Filtros
dicroicos
PMT
2

Filtros de paso
de banda
PMT
1

Laser

FS

Fig 3.2: Esquema de un citmetro de flujo. Los PMTi son fotomultiplicadores destinados a detectar
diferentes fluorescencias y el FS (forward scatter) detecta la luz no desviada tras atravesar la suspensin
unicelular.

89

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

Anlisis del ciclo celular y apoptosis

Como ya se ha sealado, la gran variedad de fluorocromos actualmente

disponibles permite estudiar diversas caractersticas estructurales y funcionales de
clulas en suspensin. En los experimentos realizados con radn y taxol se utiliz la
citometra de flujo para analizar la cantidad de ADN presente en las clulas, y con ello,
la fase del ciclo celular y el nmero de clulas muertas.

Generalmente, la cantidad de ADN se analiza para determinar la presencia de

clulas aneuploides (con alteracin del contenido en ADN) y el porcentaje de clulas en
cada fase del ciclo celular. En cada una de estas fases, las clulas normales tienen una
cantidad de ADN conocida. En la fase G0 (reposo) y G1 (presinttica), la clula tiene un
contenido diploide (2n) de ADN, correspondiente a 23 pares de cromosomas. Durante la
fase S o de sntesis, la clula duplica su contenido en ADN convirtindose en tetraploide
(paso de 2n a 4n). En la fase G2 o postsinttica, y al inicio de la mitosis M la clula
mantiene este doble contenido de ADN hasta que se divide en dos hijas de contenido
diploide.

Para estudiar la ploidia de una poblacin celular se emplea una poblacin de

referencia, con un contenido de ADN conocido, que sirve para identificar la posicin
del pico diploide en el histograma. En un histograma para estudiar el ciclo celular que
represente la cantidad de ADN en una poblacin celular habr cuatro regiones bien
definidas (Fig. 3.3). La regin que se encuentra en los canales ms bajos del espectro,
llamada subG0, corresponde a clulas con el ADN fragmentado, lo cual puede
correlacionarse con una fase tarda de apoptosis. Al final de esta regin se encuentra el
pico G0/G1 correspondiente a clulas con contenido diploide de ADN. La siguiente
regin no muestra un pico, sino un intervalo de canales que corresponde a una cantidad
de ADN variable entre 2N y 4N. Esta regin se asocia a clulas en diferentes etapas de
la fase de sntesis S. Al final de sta regin se encuentra el pico G2/M, situado en un
canal doble del correspondiente al pico G0/G1, ya que se debe a clulas tetraploides.
Existe una gran variedad de fluorocromos para realizar anlisis de ADN. Y en
todos los casos resulta necesario que la molcula fluorescente se una a la molcula de
DNA estequiomtricamente para poder relacionar directamente la cantidad de
90

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

fluorescencia medida con el contenido celular de ADN. El fluorocromo ms utilizado

para este tipo de estudios es el ioduro de propidio. Sus ventajas principales son la
facilidad de uso, estabilidad y espectro de absorcin/emisin, que le hace vlido para la
mayora de citmetros de flujo. Se excita con luz entorno a los 480 nm (para lo cual
resulta vlido un lser de Argon-ion) y emite fluorescencia roja (entorno a los 620 nm).
Las molculas de ioduro de propidio se intercalan entre los pares de bases de los cidos
nucleicos, tanto del ADN como del ARN, por lo cual es necesario eliminar ste ltimo
por procesos enzimticos si se quiere una determinacin lo ms exacta posible de la
cantidad de ADN.

Control

N de clulas

G0 G1
S
G2M

2n

4n

Fig. 3.3: Anlisis del ciclo celular por citometra de flujo

91

Cantidad ADN

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

3.- PCR

Para llevar a cabo el anlisis de la expresin de genes relacionados con apoptosis

se utilizaron dos tcnicas complementarias: la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) y la electroforesis en gel. A continuacin se describen brevemente los principios
de estas tcnicas, as como los protocolos seguidos para su utilizacin en los
experimentos presentados.

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es un procedimiento de sntesis

enzimtica de ADN in vitro, a partir de un molde cuya secuencia se conoce parcial o
totalmente. La enzima usada es una ADNpolimerasa, que inicia la sntesis a partir de un
primer o cebador de secuencia complementaria a uno de los extremos de la secuencia
que sirve de molde. La PCR se distingue de otras tcnicas de sntesis por la
amplificacin que puede producir, es decir, por la aplicacin de ciclos repetidos que dan
lugar a la sntesis de gran nmero de molculas complementarias al molde. En muchas
de las aplicaciones de la PCR se usan moldes cuya secuencia se conoce previamente.
Partiendo de un molde de ARNm que se desee amplificar, la PCR se desarrolla usando
como cebadores oligonucletidos complementarios a secuencias situadas a ambos
extremos de la secuencia diana. De este modo, la PCR permite sintetizar, a partir de una
mnima cantidad de molde, cantidades relativamente grandes de la secuencia deseada, y
proceder a continuacin al anlisis o uso experimental del producto.

Cuando se estudia la expresin de determinados genes los resultados obtenidos

con PCR permiten un anlisis semicuantitativo. Cuanto ms expresado se encuentra un
gen, mayor es la cantidad de RNAm correspondiente a la informacin codificada por
dicho gen. De este modo, usando el molde adecuado (que contenga la informacin del
gen que se desea estudiar) la magnitud de la expresin del gen vendr indicada por la
amplificacin que la PCR produzca de su secuencia. El anlisis es semicuantitativo en
tanto que necesita el anlisis simultneo de un gen cuya expresin sea conocida, que
actue como control para cuantificar la expresin del resto.

92

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

4.- Electroforesis en gel

Para visualizar las diferencias en la expresin de genes se emplea la

electroforesis en gel. sta es una tcnica por la cual se separan biomolculas segn su
carga elctrica, peso molecular y estructura bajo la accin de un campo elctrico. En
principio, el parmetro esencial que determina la movilidad de la molcula en el campo
elctrico es su carga elctrica. Sin embargo, determinados soportes como el gel de
agarosa o poliacrilamida usados en nuestros experimentos, ofrecen una resistencia
importante al avance de las molculas, por lo cual la movilidad tambin depende del
tamao de la molcula. Las molculas de ADN y ARN son por lo general demasiado
grandes como para avanzar a velocidades notables a travs de estos geles, por lo que la
tcnica se emplea para analizar fragmentos de stas molculas.

La agarosa y la poliacrilamida son polmeros cuyas disoluciones poseen la

propiedad de permanecer lquidos por encima de 50C y formar un gel semislido al
enfriarse. Estos geles estn constituidos por una trama tridimensional de fibras
polimricas dentro de un medio lquido que retarda el paso de molculas de cido
nucleico tanto ms cuanto mayor sea la molcula. Al preparar el gel en un molde
adecuado, se dejan en l unos huecos o pocillos para poder introducir luego en ellos la
muestra. As, esta se ve obligada a introducirse en el seno del gel cuando se aplica el
campo elctrico. Dado que la carga elctrica de un cido nucleico es proporcional a su
longitud en nucletidos, la electroforesis separa los fragmentos de ADN o ARN segn
su tamao o longitud, expresado en nucletidos (en el caso del ARN) o en pares de
bases (en el caso del ADN).

Para visualizar las bandas formadas tras la exposicin al campo elctrico, se

aade bromuro de etidio en la elaboracin del gel. Esta molcula fluorescente se excita
con luz ultravioleta, lo cual facilita el examen de las bandas. El bromuro de etidio se
intercala en la estructura de doble hlice del ADN incrementando su rendimiento de
fluorescencia con respecto a su disposicin libre en el seno del gel. Esto permite
distinguir pequeas cantidades de ADN bajo luz ultravioleta an en presencia de
molculas de bromuro libres en el gel.

93

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

5.- Secuenciacin de ADN

La ltima etapa de los anlisis genticos es la secuenciacin de los fragmentos

correspondientes a los genes que se desean estudiar. Cualquier mtodo de secuenciacin
comienza con una poblacin compuesta por un fragmento definido de ADN marcado en
su extremo. A partir de esta poblacin, se genera un conjunto de molculas cuyo tamao
difiere en una sola base en el extremo no marcado. Posteriormente, estas molculas se
fraccionan mediante electroforesis en geles de acrilamida, tras ser convertidos en
molculas de ADN de cadena sencilla. La movilidad de estas cadenas es inversamente
proporcional al logaritmo de su longitud. Esta tcnica es tan sensible que permite la
separacin de fragmentos cuya longitud difiere en un solo nucletido. Para establecer la
secuencia de nucletidos, se determina la base que ocupa la ltima posicin en el
extremo truncado de las molculas fraccionadas.

Protocolo de secuenciacin

Para secuenciar un producto de PCR es necesario realizar varios pasos previos.

Una vez que se ha amplificado correctamente el gen que estamos estudiando, hay que
purificar el producto de la PCR para retirar el ADN aadido al principio, as como el
resto de reactivos sobrantes (oligos, dideoxinucletidos dNTPs, DNApolimerasa,
etc). Este proceso se lleva acabo utilizando kits comerciales consistentes en una
solucin de resinas que se mezcla con el producto de PCR en una determinada
proporcin. A continuacin, la mezcla se pasa por una columna que contiene una doble
membrana de slica donde la doble hebra de ADN queda atrapada. Los dems reactivos
eliminan mediante varios lavados en una solucin con alto contenido en alcohol.

A continuacin, se realiza una variante de la PCR general llamada PCR de

secuencia. En ella slo se aade un oligo en lugar de dos, quedando uno de los
extremos de la hebra libre. En este caso se aaden dNTPs diferentes , ya que en este
caso son una mezcla de dNTPs normales y dideoxinucletidos marcados con
fuorocromos. As, la DNApolimerasa ir incorporando dNTPs a las cadenas
amplificadas hasta que se aada un dideoxinucletido que, como no dispone de un
extremo OH 3, impide que la polimerasa contine aadiendo ms nucletidos. De esta
94

Metodologa e instrumentacin de anlisis celular

forma, se obtiene un conjunto de cadenas que terminan en un dideoxinucletido

marcado con una molcula fluorescente, el cual al ser ledo por el secuenciador va a
indicar a ste de que base se trata. El programa de la PCR de secuencia es un programa
especial con un primer paso de desnaturalizacin a 96 C durante 10 s, hibridacin a 50
C durante 5 s y extensin a 60 C durante 4 m.

Al terminar la PCR de secuencia es necesario precipitar la muestra para eliminar

restos de reactivos y dideoxinucletidos marcados para que no interfieran en la posterior
lectura. Para ello se precipitan las muestras en presencia de clorura de magnesio y
etanol absoluto. Las muestras se cenrtrifugan durante 20 m y, a continuacin, se decanta
y se lava el exceso de sales con etanol al 75 % y se vuelve a centrifugar durante 5 m a
mxima velocidad.

Finalmente las muestras se preparan para ser analizadas en un secuenciador

automtico. Para ello, se resuspenden en un buffer especfico denominado TSR
(Template Suspension Reagent), recomendado por la casa comercial que distribuye el
secuenciador automtico. Tras una centrifugacin breve, se desnaturalizan las muestras
a 95 C durante 3 m, se vuelve a centrifugar y se trasvasa a los tubos del secuenciador.
En el secuenciador se realiza una electroforesis capilar de manera que es capaz de
separar las cadenas de ADN obtenidas en la PCR de secuencia que se diferencian en una
sola base. El lser va leyendo la secuencia segn la longitud de onda que van emitiendo
los fluorocromos, asociando cada longitud de onda a una determinada base nitrogenada.
Los fluorocromos empleados en este protocolo fueron:

R110 (azul) asociado a Citosina

R6G (verde) asociado a Adenina
TAMRA (amarillo) asociado a Guanina
ROX (rojo) asociado a Timina

95