Prctica N1: Fragilidad osmtica del eritrocito

Objetivo:
a)

Conocer la fragilidad de los eritrocitos frente a diferentes efectos fsicos y

qumicos.

Teora:
El paso del agua hacia dentro o fuera de las clulas es un proceso biolgico de
importancia. Si las concentraciones mol/L de solutos en ambos lados de la membrana celular
son las mismas, la presin osmtica es igual y las soluciones son isotnicas sin que haya paso
neto de lquido en ningn sentido. La concentracin de solutos en la sangre es isotnica con
una solucin de 0,9% de cloruro de sodio. La concentracin de cloruro de sodio 0,85< 0,9%,
se llama solucin salina normal o fisiolgica o suero fisiolgico.
Si los glbulos rojos se colocan en una solucin salina de distinta concentracin ml/L por
ejemplo agua destilada (0 mol/L), el agua entra en el eritrocito que se hincha al lmite de su
capacidad, se rompe la membrana plasmtica y la hemoglobina que contiene se dispersa al
estado molecular de la solucin. El proceso se llama hemlisis y puede producirse por otros
mecanismos diferentes de la accin osmtica, como es el efecto de enzimas, sustancias
qumicas, toxinas, etc.
En una forma hereditaria de anemia, la esferocitosis, la fragilidad osmtica de los
eritrocitos est aumentada y es uno de los elementos de diagnstico. Si los eritrocitos se
colocan en una solucin de mayor concentracin de solutos hipertnica- el agua sale de los
eritrocitos que se arrugan y aparecen al microscopio como ruedas dentadas (crenados).
Algunos de los solutos del plasma sanguneo no son capaces de atravesar las paredes de
los capilares y esto confiere una mayor presin osmtica que la del lquido extracelular y
como resultado una movilizacin de agua hacia dentro de los capilares que mantienen las
venas llenas y previenen el colapso. En algunos casos de desnutricin o de falla renal la
concentracin de solutos (albmina) en el plasma disminuye y el flujo de agua hacia dentro
de las venas disminuye y sta se acumula en los tejidos que se hinchan en la condicin
llamada edema. Los lquidos para uso intravenoso deben ser isotnicos, y el tratamiento del
colapso vascular del shock se hace con transfusin de plasma (albmina) con solutos que no
atraviesan las paredes vasculares.
Material y Reactivos:

1.

Tubos y pipetas

2.

Espectrofotmetro

3.

Centrfuga,

4.

Potencimetro,

5.

Bao de Mara.

Mg. Ana Gutirrez Romn (anaisabelflor@gmail.com)

6.
Muestra biolgica: sangre de
mamfero y ave
7.
Solucin anticoagulante de ethylen
diamine tetra-acetico (EDTA) 0,1%. Usar
500uL por cada 3 mL.
8.
Solucin salina amortiguadora
(fosfato salino) a pH 7,4 de cloruro de sodio
al 1%

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Experimento N1: Fragilidad Osmtica

Procedimiento:
Para cada muestra sangunea realizar el siguiente esquema de evaluacin:
Reactivos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Concentracin de NaCl % 0,00 0,10 0,35 0,45 0,50 0,55
0.6
0,7
0,85
Sol. Fosfato salino (NaCl 0,00 0,50 1,75 2,25 2,50 2,75
3,0
3,5
4,25
1%) pH 7,4 ml.
Agua destilada ml.
5,00 4,50 3,25 2,75 2,50 2,25
2,0
1,5
0,75
Sangre total con EDTA 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
ml.
Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente 30 minutos
Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min.
Leer en espectrofotmetro a 530 nm usando el tubo 9 como blanco (0% de hemlisis)
Haga una grfica de los valores de hemlisis en % contra la concentracin de NaCl

Experimento N2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad osmtica

Procedimiento:
Reactivos
Concentracin de NaCl
Sol. Fosfato salino (NaCl 1%), pH7,4
Agua destilada
Sangre total con EDTA
Mezcla e incubar a C / 30 minutos

%
ml.
ml.
ml.

1
0,00
0,00
5,00
0,05
ambiente

2
0,85
4,25
0,75
0,05
Sobre
hielo

3
0,85
4,25
0,75
0,05
ambiente

4
0,85
4,25
0,75
0,05
37

5
0,85
4,25
0,75
0,05
45

Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min.

Leer el sobrenadante en espectrofotmetro a 530 nm. Usar agua destilada como
blanco.
Expresar el resultado como el porcentaje de hemlisis a cada valor de temperatura de
incubacin. Se calcula utilizando el valor de la absorbancia del sobrenadante del tubo
donde ocurre la mxima hemlisis como el 100%.

Experimento N3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmtica

Procedimiento:
Reactivos
Concentracin de NaCl
pH
Sol. Fosfato salino (NaCl 1%)
Agua destilada
Sangre total con EDTA

1
0,00

ml.
ml.
ml.

0,00
5,00
0,05

2
0,85
5,6
4,25
0,75
0,05

3
0,85
7,4
4,25
0,75
0,05

4
0,85
8,9
4,25
0,75
0,05

Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente 30 minutos

Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min.
Leer el sobrenadante en espectrofotmetro a 530 nm. Usar agua destilada como
blanco.
Expresar el resultado como el porcentaje de hemlisis a cada valor de pH. Se calcula
utilizando el valor de absorbancia del sobrenadante, del tubo donde ocurre la mxima
hemlisis como el 100%.
Mg. Ana Gutirrez Romn (anaisabelflor@gmail.com)

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Cuestionario:
1. Una solucin salina que es isotnica para eritrocitos es necesariamente isotnica para otro
tipo de clulas?
2. Cules son las causas de la hipernatremia?
3. Cmo se comportara el eritrocito en un estado de hipernatremia?

Literatura complementaria:
Michael J. Dewey. Jamie L. Brown, y Ferez S. Nallaseth.1982 Genetic Differences in Red Cell
Osmotic Fragility: Analysis in Allophenic Mice. Blood, 59: 986-989
J. H. BOLTON 1949. The distribution curve of erythrocyte fragility: a different method of
presentation of fragility of erythrocytes to hypotonic saline, with preliminary remarks on
the function of reticulocytes. Blood 4: 172-178

Mg. Ana Gutirrez Romn (anaisabelflor@gmail.com)

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