Protocolo Ensayo B-galactosidasa

1. Inocular una colonia aislada de cada cepa de E. coli (vase Tabla 2) en tubos de ensaye
largos con 5 mL de medio LB, se dejan incubando O.N. a temperatura ambiente (25 C) a 225
rpm.
2. Preparar dos matraces de 250 mL con un volumen de 50 mL de medio LB para cada cepa (6
matraces totales), uno de ellos se ajusta a pH 5.8 y el otro a pH 8.0.
3. Medir la OD600 de los cultivos O.N. realizando diluciones 1:10 en medio LB estril y calcular el
volumen requerido de cada cepa para inocular (Tabla 3) en los matraces del paso anterior a
una absorbancia final de 0.1. (usar frmula de equilibrio de concentraciones: C1V1=C2V2).
4. Tomar una lectura inicial para comprobar la absorbancia aproximada de la OD600 a 0.1 e
incubar los cultivos a 25 C y 225 rpm hasta obtener una OD600 deseada de 0.4. Mientras se
preparan tubos de ensaye con 0.9 mL de buffer Z. Al llegar a la OD deseada, se toman
alcuotas de 0.1 mL y se vierten en los tubos, aadiendo posteriormente 10 uL de SDS al 10%
y 20 uL de cloroformo. (En caso de que no se pudiera tomar la alcuota en el momento, se
detiene el crecimiento al sumergirse en una cubeta con hielo y agua por 20 minutos). Se
someten al vrtex por 10 s, y se deja permeabilizando 10 min a 28 C en el termoblock. Se
aaden 0.2 mL de ONPG y se deja en reposo hasta que aparece una coloracin amarilla.
Enseguida se aaden 0.5 mL de Na2CO3 y se da vrtex por 10 s. Se dejan 10 minutos antes de
medir la absorbancia.
Debido a que el cloroformo se precipita, se toman posteriormente 0.8 mL de la reaccin, cuidando de no
tocar el cloroformo. Se vierten en la celda y se procede a hacer la medicin a 420 nm y a 550 nm. Se
realizan 3 repeticiones de cada una de las muestras. Los datos se registran en la tabla 1.
Tabla 1. Registro de tiempo, volumen y abs a las diferentes longitudes de onda y su correspondiente clculo de
unidades Miller.
cepa
R26

R36

R40

Repeticin

tiempo
1
2
3
1
2
3
1
2
3

volumen

OD600

OD420

OD550

Unidades Miller

Anexos
MATERIAL BIOLOGICO

Tabla 2. Lista de cepas a evaluar.

Nombre
R26
R36
R40

Descripcin
TR50
CpxAY123
CpxAY144A

Tabla 3. Volumen de ajuste a 0.1 OD600.

Cepas bacterianas
TR50
CpxAY123
CpxAY144A

EQUIPO

Incubadora
Vrtex
Espectrofotmetro UV/VIS
Micropipeta
Termoblock

MATERIALES

Matraces de 50 mL
Tubos de ensaye
Gradilla
Puntas azules usadas
Celdas de cuarzo
Pizeta con agua destilada

Volumen del inculo necesario para el

ajuste de la OD600 a 0.1

SOLUCIONES

Buffer Z
SDS 10%
Cloroformo
ONPG 4mg/ml de buffer Z
Na2CO3

PREPARACION DE SOLUCIONES
Buffer Z 1L
En un vaso de precipitados en agitacin se vierten los siguientes reactivos.
Tabla 3. Cantidades necesarias para preparar 1 L de buffer Z.
16.1 g

Na2HPO-7H2O

0.06 M

4.8 g

NaH2PO

0.04 M

0.75 g

KCl

0.01 M

0.246 g

MgSO4-7H2O

0.001 M

2.7 ml

b-mercaptoetanol

0.05 M

El b-mercaptoetanol no se vierte hasta el momento de uso. La disolucin sin el b-mercaptoetanol se

puede conservar a temperatura ambiente. Las cantidades en gramos se ajustan para que correspondan
a la molaridad indicada, en caso de que los reactivos de fosfato tengan diferente nivel de hidratacin
SDS 10% - 100 mL
Se pesan 10 g de SDS y se vierten en un vaso de ppt. con 60 mL de agua esterilizada en agitacin. Se
disuelve calentando un poco. Finalmente se vierte en una probeta y se afora a 100 mL, sin tomar en
cuenta la espuma al llenar a la marca del aforo.
Se emplean 10 mL de SDS por 100 mL de agua esterilizada.
ONPG 4mg/ml de buffer Z 10 mL
Se depositan 40 mg de ONPG en 10 mL de buffer Z, agitando vigorosamente.

Na2CO3 1 M 250 mL
Se pesan 26.5g y se depositan en 200 mL de agua destilada en agitacin. Se aplica calor para facilitar la
disolucin. Enseguida se vierte en una probeta y se afora a 250 mL.

Para el correspondiente clculo de la unidades Miller se emplea la siguiente formula, sustituyendo los
correspondientes datos de tiempo, volumen y absorbancias.

OD420 1.75 x OD550)

Unidades Miller= 1000 x
t x v x OD600