PCR

REACCION EN CADENA DE POLIMERASA

ZONA SUCIA

ZONA LIMPIA

CUIDADOS PARA TRABAJAR

USAR SOLUCIONES Y MATERIAL ESTRIL.
LIMPIE LAS MESADAS Y EL EQUIPO PERIDICAMENTE CON
UNA SOLUCIN DE LAVANDINA AL 10% O DE ALCOHOL 70%.
USAR GUANTES Y CAMBIARLOS FRECUENTEMENTE.
ABRA Y CIERRE LOS TUBOS DE MUESTRAS CON CUIDADO
PROCURE NO PULVERIZAR NI SALPICAR CON MUESTRAS DE
PCR.
USAR PIPETAS Y TIPS CON FILTROS
MANTENGA LAS REACCIONES Y LOS COMPONENTES
TAPADOS TODO EL TIEMPO POSIBLE.
MANTENER EL FLUJO UNIDIRECCIONAL

PROCESAMIENTO DE
MUESTRAS
Establecer los
mtodos apropiados de
muestreo,
conservacin y
transporte.
Procesamiento de
muestras en cmara
de bioseguridad clase
II con filtro HEPA o
Cmaras de flujo
laminar.

PROCESAMIENTO DE
Funcionamiento
MUESTRAS

La tcnica de flujo laminar mas Lmparas

UV
(rango UV-C) permite controlar la
contaminacin microbiolgica en el aire
mediante dos procedimientos bsicos
simultneos.
Uno la introduccin de aire estril por medio
de filtros absolutos HEPA ya que stos
retienen partculas desde 0.3 micras en
adelante y su diseo interno obliga a las
partculas a detenerse en el medio filtrante.
El segundo procedimiento es introducir esa
masa de aire ultrafiltrado en un ambiente
confinado a velocidades muy bajas con lo
cual el aire avanza en una sola direccin
tomando la forma de los objetos que
encuentra a su paso por el rea evitando
contaminacin exterior y aquella que podra
provenir de los objetos dentro de la zona de
trabajo.

Pasos previos a la PCR

EXTRAER
PURIFICAR

EXTRACCIN DE ACIDOS NUCLEICOS

Seleccin del mtodo mas adecuado:
1.- Tipo de Muestra (tejido fresco, suero, sangre total, etc.)
2.- Tipo de A.N. a extraer
3.- Tipo de anlisis a realizar
Etapas Generales:
1.- Romper las clulas por accin mecnica o con
detergentes
2.- Digestin enzimtica de proteinas u otros componentes
celulares
3.- Extraccin propiamente dicha con solventes orgnicos
4.- Purificacin por precipitacin con Etanol

MTODOS DE EXTRACCIN DE CIDOS

NUCLEICOS

METODO DE
PPCION SALINA

CROMATOGRAFIA
DE INTERCAMBIO
IONICO O
ADSORCION

VIRUS
VIRUS ARN DE CADENA POSITIVA:
VIRUS LINFOTROPICOS: PRO VIRUS HIV
HTLV
VIRUS ARN DE CADENA POSITIVA:
DENGUE- ENTEROVIRUS
VIRUS ARN CADENA NEGATIVA: VIRUS
INFLUENZA A
VIRUS ADN BICATERNARIO: HERPES
SIMPLEX-VARICELA ZOSTER-CMV- HPV

LA EXTRACCIN ES EL PRIMER PASO EN CUALQUIER TCNICA

DE DIAGNSTICO MOLECULAR

Mantener integridad de los AN.

No introducir sustancias
contaminantes o inhibidores de la
reaccin.
Estabilizar los AN para que no
acten las nucleasas.

Extraccin y Purificacin

ETAPAS BASICAS DE EXTRACCION Y

PURIFICACION DE AN

--TIOCIANATO DE
GUANIDINA

METODOS DE EXTRACCION Y
PURIFICACION
CROMATOGRAFIA
QIAamp Viral RNA Mini QIAcube Kit
For purification of viral RNA from
plasma
Serum
Cell-free body fluid: LCR

METODOS DE EXTRACCION Y
PURIFICACION

QIAamp Viral RNA Mini QIAcube Kit

El kit combina las propiedades de unin
selectiva de una membrana de silicagel con la
velocidad de microspin o microcentrifuga.

Procedimiento
Lisis: AVL*
Ppcion: etanol 96-100%
Introducir en columna con silica gel-RPM
Adicion de buffer W1 + RPM
Adicion de buffer w2 + RPM

Elucion de AN con buffer AVE

AN VIRAL PURO

CONSERVACION DE LAS
MUESTRAS DE ARN

+ lbiles
Se deben congelar y trabajar en fro
Se conserva bien en alcuotas a 70C.
Se usan inhibidores de RNAsas
No someter a ciclos de frisado y desfrisado

Virus linfotropicos: Extraccin de ADN a

partir del CMT

Extraccin de Clulas Mononucleares Totales

(CMT): SEPARACIN POR GRADIENTES DE
DENSIDAD (FICOLL-HYPAQUE)
Es un sistema que se suele realizar empleando la
ultracentrfuga. Consiste en la separacin de las
partculas en funcin de su densidad de flotacin.
El Ficoll es un polmero de carbohidrato y
metrizamida (compuesto denso que contiene
yodo) y que permite que se hundan los
eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor
densidad = 1.077), y que floten las clulas
mononucleares (linfocitos y monocitos)-

Extraccin de ADN a partir del CMT

Extraccin de Clulas
Mononucleares Totales (CMT):
SEPARACIN POR
GRADIENTES DE DENSIDAD
(FICOLL-HYPAQUE)
Es una tcnica de centrifugacion por gradiente de
densidad para separar Clulas Mononucleares de
Sangre Perifrica (CMSP) de otras clulas de la sangre.
Durante la centrifugacion se van formando varias
capas, el sedimento que esta formado principalmente
por granulocitos y eritrocitos ha migrado a traves de la
gradiente de densidad que es mayor al del ficoll
hypaque, encima estaria otra capa que seria el ficoll
hypaque que es menos denso, y encima estaria otra
capa fina opalecente que serian las CMSP, finalmente
sobre esa capa estaria las plaquetas y el plasma.

Extraccin de ADN a partir del CMT

facilitar

la lisis y adems es para degradar

todas las protenas, las que puedan
degradar el DNA

ARNasa: degrada el ARN

NaCl 5M: Precipita el ADN.
ETANOL: a menor temperatura menor solubilidad.
El ADN es muy poco soluble en eltanol, y menos
aun en etanol fro, por lo que precipita ms rpido

CONSERVACIN DE LAS
MUESTRAS DE ADN
El DNA purificado es relativamente estable si
se encuentra en un buffer libre de DNAsas.
Se ha visto que es estable a 4C por 3 aos.
Los ciclos de congelado-descongelado daan
el DNA por lo cual se recomienda alicuotar las
muestras.

Extraccin de ADN VS ARN

Reaccin en
cadena de
polimerasa
(PCR)

PCR
Polimerase chain
reaction
Es la amplificacin de ADN in vitro por medio
de la polimeracion de cadena de ADN
utilizando un termociclador.
Es propsito del PCR es hacer muchas copias
de un fragmento de ADN
Se realiza la amplificacin de un segmento
especifico de ADN, teniendo poco material
disponible.

Fue diseada por el Dr. Kary Mullis en 1987

Utilizo el PCR para amplificacin del gen de - hemoglobina humana, y el
diagnostico prenatal de anemia falciforme.

PCR: FUNDAMENTO
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural
de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN,
para lo cual emplea ciclos de altas y bajas
temperaturas alternadas para separar las hebras de
ADN recin formadas entre s tras cada fase de
replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a
unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

el proceso de la PCR est automatizado

mediante un aparato llamado termociclador,
que permite calentar y enfriar los tubos de
reaccin para controlar la temperatura
necesaria para cada etapa de la reaccin..

El proceso de PCR
incluye 3 pasos bsicos
que se repite 25 veces o
mas.
1: DESNATURALIZACION: Consiste en separar la
doble hebra de ADN y convertirla en hebra
sencilla.
Tpicamente se usa a una temperatura de 25C
95, Por 15 a 40 segundos
El tiempo depende del tamao del genoma

2: APAREAMIENTO O
ANNELING:
Los cebadores primers previamente
diseados, reaccionan con la hebra sencilla
del ADN y se pega a lugares especficos por
complementariedad de base. Por eso se deja
bajar la temperatura
Ej: 55 C por 30 segundos. La temperatura y
el tiempo puede variar entre cebadores
segn sea el caso.

3. POLIMERACION O EXTENSION.
Una polimerasa de ADN extiende los primers
en el espacio comprendido entre ambos
primers, y coloca dinucleotidos trifosfatados
(dNTPs) de 5a 3leyendo el ADN de 3a 5. de
esta
forma
se
sintetiza
la
secuencia
complementaria de las hebras de ADN molde.

PCR: CICLOS

PCR

PCR es una amplificacin exponencial

COMPONENTES DE LA PCR

COMPONENTES DE LA PCR
MgCl2
Cofactor de la actividad enzimtica de la ADN
polimerasa
Estabiliza el complejo replicativo molde-primer- taq
pol.
Su concentracin es importante en la especificidad y
en la eficiencia de la PCR
dNTPs
Deben utilizarse en concentraciones equivalentes (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP).
Se requiere colocar un exceso de dNTPs pero a una
concentracin menor de 50mM.

Componentes de PCR
Taq ADN Polimerasa
Enzima termoestable, aislada de T. aquaticus
Posee una vida media de aprox. 45 min a 95
Actividad optima a 74C temperatura a la cual
no se forman hbridos indeseados (especificidad)
Altas concentraciones de Taq. Pol. genera la
formacin de productos no especficos.
Bajas concentraciones de Taq. Pol. disminuye el
rendimiento o la cantidad de producto
amplificado.
Se recomienda su uso entre 1 y 5 U.

Tipos de PCR

PCR
PCR
PCR
PCR
PCR

anidada
in situ
mltiplex
con transcriptasa inversa
en tiempo real o cuantitativa (qPCR)

PCR anidada- NESTED PCR

Tcnica muy sensible de PCR en la que
el producto de una amplificacin es
utilizado como molde para realizar una
segunda amplificacin con cebadores
que se ubican dentro de la primera
secuencia
amplificada,
es
decir,
cuando tenemos el primer amplicn se
pueden unir los cebadores y se hace de
nuevo una amplificacin dentro del
amplicn inicial. Este tipo de PCR
tiene la ventaja de brindar alta
sensibilidad y especificidad.
La especificidad aumenta porque como
es amplificacin de un amplicn
obtenido previamente, los cebadores
slo van a hibridar en un sitio dentro
de la molcula y el resultado ser una
nica banda. As, evitamos posibles
hibridaciones inespecficas de los
cebadores.

PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o
clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de
amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En
la tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN
blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con
sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades
pequesimas de genoma.

PCR mltiplex
PCR en la cual se amplifica ms
de una secuencia en una misma
reaccin. Emplea dos o ms
pares de cebadores en un
nico tubo con el fin de
amplificar simultneamente
mltiples segmentos de ADN.
Consiste en combinar en una
nica reaccin todos pares de
cebadores de los sistemas que
queremos amplificar
simultneamente, junto con el
resto de los reactivos de la
reaccin en cantidades
suficientes

PCR con transcriptasa inversa-RTPCR

Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez
de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la
sntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el
desarrollo inicial de una RT-PCR sera:
1er paso: retrotranscripcin a partir del ARN.
2 paso: amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc.

PCR en tiempo real o cuantitativa

(qPCR)
Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar
la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para
identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN especficas a partir de
su temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting
temperature).
Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en las
tcnicas basadas en sondas especficas.
En las tcnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad
con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo
fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real.
Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin pero tiene la ventaja de
utilizar cebadores normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la
que usa sondas especficas.

PCR en tiempo real

En esta tcnica de laboratorio, los procesos de amplificacin
y deteccin se producen simultneamente en el mismo vial
cerrado, sin necesidad de acciones posteriores.
Los termocicladores para llevarla a cabo, incorporan un
lector de fluorescencia y estn diseados para poder medir
en cualquier momento de la amplificacin del material
gentico, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales
donde se realice esta.
Los sistemas de deteccin para la PCR en tiempo real
pueden ser de 2 tipos: agentes intercalantes o sondas
especficas marcadas con fluorocromos.

Agentes intercalantes
Fluorocromos que aumentan notablemente la emisin de
fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hlice.
El ms empleado en PCR en tiempo real es el SYBR Green I.
El incremento de ADN en cada ciclo, se refleja en un
aumento proporcional de fluorescencia emitida en cada vial
donde se realiza la amplificacin.
Uno de los inconvenientes de estos es su baja especificidad,
que se puede mejorar con el empleo de condiciones
ptimas de reaccin y con una seleccin cuidadosa de los
primers o cebadores

Sondas de hibridacin
especficas
Sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un
donador y un aceptor.
El proceso se basa en la transferencia de energa
fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las
dos molculas.
Las ms utilizadas son las sondas de hidrlisis,
Endenominadas
todos estos sistemas,
el incremento
de ADNlas
ensondas
cada ciclo se
tambin
sondas TaqMan,
corresponde
un aumento
de hibridacin
molecular con
beacons
y las sondas
FRET. de las sondas, lo
que conlleva un aumento en la misma proporcin de
fluorescencia emitida.

Sondas de hidrlisis
Son oligonucletidos marcados con
un fluorocromo donador en el
extremo 5 que emite fluorescencia
al ser excitado y un aceptor en el
extremo 3 que absorbe la
fluorescencia liberada por el
donador.
Mientras la sonda este intacta, la
fluorescencia emitida por el donador
es absorbida por el aceptor.
Durante la sntesis de la nueva
cadena por la Taq polimerasa, que
tiene actividad 5 exonucleasa, el
extremo 5 de la sonda es
hidrolizado, producindose la
liberacin del fluorocromo donador.
Una vez que el donador y aceptor
estn espacialmente alejados, la
fluorescencia emitida por el primero
es captada por el lector.

Molecular beacons
Parecidas a las sondas de hidrlisis.
Tienen una molcula donadora en el
extremo 5 y una molcula aceptora
en el extremo 3, adems tienen
una estructura secundaria en forma
de asa, que se pliega y mantiene
unidas ambas molculas.
Al no estar hibridada con el ADN
molde, la fluorescencia emitida por
el donador es absorbida por el
aceptor y no es captada por el lector
del equipo.
Al hibridarse con el ADN diana, la
sonda se abre, alejndose donador y
aceptor, pudiendo detectarse la
fluorescencia emitida por el primero.

Sondas FRET
El sistema se compone de 2 sondas que se unen a
secuencias adyacentes del ADN diana.
Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3 y la
otra un aceptor en el extremo 5.
Cuando las sondas estn hibridadas, los dos fluorocromos
estn prximos. Al ser excitado, el donador transfiere su
energa al aceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que
detecta el lector del equipo.

Lector

Equipo de amplificacin y
deteccin en PCR de tiempo
real
Todos los tubos pasan por el detector
cada 150 milisegundos.

Cada tubo pasa frente la misma

fuente de luz excitatoria, la cual
atraviesa las paredes laterales, y la
fluorescencia emitida retorna al
mismo sistema de deteccin, en este
caso un tubo fotomultiplicador.

La rotacin
garantiza la
uniformidad de
la temperatura
del aire del
sistema.

LEDS y filtros que

determinan rangos de
longitud de onda.

Curvas de amplificacin
Constan de 3 partes
diferentes:
La fase inicial donde no se
puede medir la acumulacin
del producto de PCR pues
hay pocos cambios en la
seal de fluorescencia, lo
que define la lnea basal.
La fase exponencial, donde
la fluorescencia cambia a
medida que se forman ms
productos.
La fase de meseta, donde no
se distinguen cambios en la
fluorescencia a pesar de que
se siguen acumulando
productos.

Fase exponencial

Lnea basal

Meseta

Comparacin de PCR tiempo

real y PCR convencional

PCR convencional
Prueba de deteccin de
punto final.
Deteccin por empleo de
geles de agarosa, aparte de
la reaccin de PCR.
Poder de resolucin
limitado.
Obtencin de resultados en
dos pasos (amplificacin y
deteccin).
Ms tiempo en obtencin
de resultados.

PCR tiempo real

Prueba de deteccin de la
cintica de la reaccin.
Deteccin simultanea
durante el proceso de
amplificacin.
Deteccin de cambios
mnimos en la secuencias y
con cantidades pequeas
del ADN blanco.
Prueba simultanea
(amplificacin y deteccin)
con menor tiempo de
espera.

Aplicaciones
Deteccin de agentes infecciosos como :
hepatitis B y C, papiloma virus, VIH, entre
otros.
Anlisis de ADN de cualquier organismo vivo o
muerto, anlisis de fsiles.
Mutagnesis dirigida (cambios en la
informacin contenida a travs de los
primers con mutaciones)
Investigacin forense
DX PRENATAL
Pruebas de paternidad

Ventajas del
A partir de una muestra pequea de ADN se puede
PCR
obtener una cantidad considerable para el estudio
que se vaya a realizar.

El proceso se puede utilizar para clonar, secuenciar

y anlisis.
Se puede amplificar el ADN de cualquier organismo
vivo o muerto.
Sus aplicaciones son multiples, medicina forense,
diagnostico, anlisis prenatales, etc.

Desventajas del PCR

Se puede reproducir solamente parte del genoma
en donde se conoce por lo menos una mnima
secuencia 20 40 pd
Se necesitan primers especficos que sean
complementarios al fragmento que se desea
sintetizar.
La polimeracion puede tener errores al sintetizar
el ADN.
Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del
mismo investigador o de cualquier otro)

Anlisis del producto amplificado

por PCR convencional
Despus de la amplificacin al obtener el ADN de inters,
este puede ser colocado en un gel de agarosa para realizar
el corrimiento electrofortico, teirlo y observarlo con luz
ultravioleta (UV).
La electroforesis es el movimiento de
partculas cargadas en un campo
elctrico.
Los cidos nucleicos estn cargados de
forma negativa debido a su esqueleto de
grupos fosfato, por lo que migrarn
hacia el polo positivo o nodo.

Anlisis de
muestra
La deteccin del producto de
la PCR se realiza
normalmente mediante
corrido electrofortico.
Dependiendo del tamao de la
amplificacin y la resolucin
que deseamos utilizaremos
diferentes medios (agarosa,
poliacrilamida) a distintas
concentraciones.

La posterior visualizacin se puede

realizar por bromuro de etidio (lmpara
de luz UV) Tincin de plata, fluorescencia,
radioactividad

Gel de agarosa
La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que
tiene la propiedad de mantenerse en estado slido a
temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se
torna lquida.
Gelifica a temperaturas comprendidas entre 32 a 45C y
funde a temperaturas entre 80 a 95C.
La agarosa es un producto natural y no txico, por lo que
puede ser manejado libremente y de forma cmoda en el
trabajo.
La concentracin de agarosa tpicamente utilizada para
electroforesis est entre el 0.5 % y el 2%, dependiendo del
tamao del poro requerido para la corrida electrofortica y
este a su vez del tamao del cido nucleico a analizar.
la concentracin de agarosa define el tamao de los poros
de la matriz, a mayor concentracin, menor el tamao de
los poros y viceversa.

Bromuro de etidio
Es un colorante fluorescente que tiene la capacidad de
intercalarse entre las bases nitrogenadas de ADN y ARN.
Debido a esta propiedad, es un agente mutagnico y debe
manejarse con cuidado, usando equipo de proteccin y las
buenas prcticas de laboratorio establecidas.
Bromuro de etidio

Bases
nitrogenadas

Bases
nitrogenadas

Radiacin UV
Los efectos biolgicos de esta radiacin se inician por una
absorcin fotoqumica a nivel de molculas de importancia
biolgica, las ms importantes en este sentido son los
cidos nucleicos, seguidos por las protenas.
Es importante tomar las medidas necesarias para no
exponerse a este tipo de radiacin durante la revelacin de
los productos amplificados en el gel de agarosa.

PCR!