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Produccion de Amilasas Fungicas
Produccion de Amilasas Fungicas
=
Tubos a Absorbanci
Tubos a Absorbanci Tubos a Absorbanci
dl #A Amilasa
5
Ejemplo&
Absorbancia Fubo '!)"& 8.-/8
Absorbancia Fubo ,!-"& 8.)88
8 -/8 8 )88
8 -/8
'888 ///
. .
.
=
= #A dl
#alcular las Dnidades Amilolticasa por decilitro DA=dl".
Parte IV: INMO$ILI%ACION EN%IMATICA
Da 1: Im!3ili/a(i- e/im4ti(a
El e$tracto enzimtico se inmoviliza con alginato de sodio. El alginato es un polisacrido
producido por algas soluble en agua, en una solucin con iones divalentes como el #a
)?
polimeriza ya que los iones producen entrecruzamiento de los polisacridos. Al polimerizar una
solucin de alginato conteniendo enzimas estas quedan atrapadas dentro de las esferas que se
generan.
3ara la inmovilizacin se colocan '8 ml del e$tracto enzimtico en un vaso de precipitado
y se agregan '88 mg de alginato de sodio '.8 5 final". 1e homogeiniza y se toma con una
jeringa de '8 ml. 1e hace gotear la solucin en un vaso de precipitado conteniendo solucin de
#a#l
)
)88 m7. 1e producen esferas de ,!/ mm de dimetro que polimerizan al entrar en
contacto con la solucin de #a#l
)
. Las esferas se estabilizan durante ' h en la solucin de #a#l
)
a
temperatura ambiente. Las esferas se lavan con buffer acetato 8.' 7, p(& /.
La actividad de la enzima inmovilizada se determina agregando / ml de solucin de
sustrato e incubando / min a ,;:. Luego se e$trae una alcuota de 8./ ml y se agrega a cada tubo
-./ ml de solucin reveladora. 1e mide la absorbancia en espectrofotmetro a 0-8 nm.
Parte V: PRODUCCION DE ETANOL POR ERMENTACION
1e estudiar la capacidad de fermentacin para producir etanol de Sacc$arom%ces
cerevisiae a la vez que se ver su incapacidad para utilizar almidn como fuente de carbono, por
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lo que se hace imprescindible la hidrlisis previa del polisacrido para su utilizacin por la
levadura usando para ello el e$tracto enzimtico obtenido.
Da 1: I!(+la(i-
Las fermentaciones se realizarn en erlenmeyers de /8 ml conteniendo -8 ml de agua
destilada y '.8 g de harina de trigo o maz autoclavadas. A este sustrato se le agrega / ml del
e$tracto enzimtico obtenido o / ml de solucin de 6a#l '.8 5 y '88 Cl de tetraciclina '8
mg=ml. 1e e$trae una alcuota de , ml de cada fermentacin para determinar las condiciones
iniciales. Luego se inocula con 8./ ml de una suspensin de Sacc$arom%ces cerevisiae de /8
mg=ml y se incuba durante / das a temperatura ambiente.
Da 5: Determia(i- *e eta!l
1e cuantificar el etanol producido en las fermentaciones - muestras& antes y despuEs de
incubar s=c e$tracto enzimtico" por el mEtodo de microdifusin. Este mEtodo se basa en que si
una sustancia voltil y un solvente puro se mantienen en compartimientos separados pero en
contacto con la misma atmsfera, el soluto voltil tender a disolverse en el solvente puro. El
soluto voltil pasar de la solucin original hacia la atmsfera para luego disolverse en el solvente
originalmente puro. Binalmente, esto implicar una difusin del soluto desde la solucin original
al solvente. Este proceso ocurrir hasta alcanzar el equilibrio pero, si en lugar del solvente puro
utilizamos una sustancia que convierta al soluto voltil en no voltil, la difusin ocurrir hasta que
la presin de vapor en la atmsfera compartida tienda a cero. El ensayo se realizara en dos tubos
colocados uno dentro del otro. En el compartimiento e$terior tubo ancho" se colocar 8./ ml de
solucin saturada de carbonato de potasio que causar que el alcohol sea menos soluble en la
solucin acuosa. 3or otro lado se prepara el compartimiento interior tubo angosto" que
contendr '.8 ml de solucin de dicromato de potasio 8.'-/ 5 en cido sulf%rico '8 6 y se
coloca dentro del tubo ancho con la ayuda de una pinzaG en presencia de esta solucin el etanol es
o$idado a cido acEtico y el #romo pasa a #r
,?
cambiando su color de amarillo anaranjado a
transparente. Dna vez preparado el dispositivo se agrega al compartimiento e$terior 8.' ml de
solucin standard o muestra y se tapa con un tapn de goma. 1e incuba 08 min a -/:#, se saca el
tubo angosto y se le agrega 8./ ml de agua destilada y se mide la absorbancia a -/8 nm.
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Dis$!siti3! $ara la *etermia(i- *e Eta!l
Fapn de +oma
#ompartimiento e$terior&
Solucin saturada de
Carbonato de &otasio con
Standard o 'uestra
#ompartimiento interior&
Solucin de (icromato de &otasio
El protocolo se detalla a continuacin&
Determia(i- *e Eta!l
Tubo N 'uestra )*"" +l, Absorbancia a !-" nm
'!) Agua destilada !
,!- Et*( 8.)/ 5 !
/!0 Et*( 8./ 5 !
;!9 Et*( '.8 5 !
H!'8
1in e$tracto = 1in incubar
!
8
''!')
1in E$tracto = <ncubado
!
',!'-
#on e$tracto = 1in <ncubar
!
'/!'0
#on e$tracto = <ncubado
!
+raficar la curva de calibracin Absorbancia vs 5 de Etanol" y luego calcular el porcentaje de
etanol producido en cada una de las fermentaciones.