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PRACTICA N2 DE MALALTIES INFECCIOSES I

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A AGENTES ANTIMICROBIANOS


Introduccin

La determinacin de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos es una de las
principales funciones de un laboratorio de enfermedades infecciosas. Esta funcin se
vuelve de especial relevancia en una poca como la actual, en la que las resistencias a
los agentes antimicrobianos son elevadas y existe una gran discusin sobre la utilizacin
de antibiticos en los animales. Por ello es fundamental que el laboratorio pueda aportar
la informacin necesaria para llevar a trmino un tratamiento adecuado.

El principal objetivo de cualquier prueba de sensibilidad antimicrobiana es predecir cul
ser el resultado de un tratamiento. En muchas ocasiones los resultados se expresan,
para un patgeno aislado y analizado, de forma cualitativa: como sensible (en cuyo
caso se supone que un tratamiento estndar con aquel compuesto producir la
curacin), resistente (el antimicrobiano examinado no ser eficaz en aquella patologa) o
intermedio (la efectividad de aquel compuesto depender de su localizacin o de la
dosificacin utilizada).

Un segundo objetivo de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana es la de obtener
series histricas que permiten predecir el comportamiento de un tratamiento cuando ste
se hace de forma emprica.


Objetivos de la prctica

Los objetivos de esta prctica son:

a) Aprender las tcnicas ms usuales de determinacin de la sensibilidad antimicrobiana:
mtodo por difusin de microdiscos (Kirby-Bauer) y mtodo de dilucin en caldo (CMI).

b) Aprender los criterios de seleccin de antimicrobianos a testar en una prueba de
sensibilidad antimicrobiana.

c) Conocer los criterios de interpretacin.

Normas generales

La determinacin de la sensibilidad antimicrobiana slo es factible para aquellos
patgenos para los que existen mtodos adecuados y estandarizados de anlisis y para
aquellos en los que es esperable la existencia de resistencias. En algunas ocasiones
puede ser interesante llevar a cabo estos anlisis por laboratorios especializados si los
microorganismos tienen una especial relevancia (Mycobacterium tuberculosis, etc.).
Un estudio de antibiosensibilidad no tiene sentido a partir de microbiota normal o saprofita
dado que los resultados no tendrn relevancia y pueden inducir a tratamientos errneos.
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Mtodos de anlisis de la sensibilidad antimicrobiana

Podemos distinguir diferentes tipos de mtodos en funcin de la tcnica utilizada y de la
informacin que dan (Tabla 1).


MTODO TCNICA INFORMACIN

CUALITATIVO



SEMICUANTITATIVO




CUANTITATIVO

ANTIBIOGRAMA DIFUSION de MICRODISCOS
(KIRBY-BAUER)


GRADIENTE ANTIBIOTICO (E-TEST)




1. DILUCION DE CALDO:
-MACRODILUCION EN TUBO
-MICRODILUCION EN PLACA
2. DILUCION EN AGAR
3. SISTEMAS AUTOMATIZADOS (Vitek...)


RESISTENCIA
VALOR INTERMEDIO
SENSIBILIDAD

APROXIMACION A LA
CONCENTRACION
MINIMA INHIBITORIA
(CMI)

DETERMINACION DE LA
CMI
Tabla 1 Mtodos de deteccin de antibiosensibilidad


Cada sistema tiene sus ventajas y sus inconvenientes:

- El mtodo de Kirby-Bauer es probablemente el ms utilizado por su sencillez y, si se
realiza correctamente, presenta una correlacin muy buena con los mtodos
cuantitativos.
- Algunos laboratorios trabajan con mtodos semicuantitativos como el E-test. Estos
sistemas son una modificacin del mtodo de Kirby-Bauer, en los que en lugar de
discos se utilizan tiras de papel impregnadas con un gradiente del antibitico, lo que
permite una semi-cuantificacin.
- Los sistemas cuantitativos son los ms exactos pero tambin los ms laboriosos.


Establecimiento de los puntos de corte (breakpoints) en una prueba de sensibilidad
antibitica

En definitiva, sea cual sea el mtodo utilizado, el veterinario exige al laboratorio que
clasifique los resultados en funcin del potencial xito que tendr la administracin de un
antibitico en una enfermedad concreta. Por este motivo, es necesario establecer a partir
de qu punto (dimetro de inhibicin en el antibiograma, CMI, etc) clasificamos un
microorganismo como sensible, intermedio o resistente. En el argot de la microbiologa
clnica es lo que se llama un punto de corte. El establecimiento de este punto de corte
puede depender de cuatro factores:

a) Distribucin de la CMI
b) Caractersticas farmacodinmicas y farmacocinticas
c) Respuesta clnica
d) Dimetros de inhibicin (Kirby-Bauer)
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Comparacin de tcnicas


Normalmente, las pruebas cuantitativas clsicas (dilucin en caldo o en agar) se suelen
tomar como patrones de referencia para evaluar otros sistemas de determinacin de
sensibilidad antimicrobiana. Cualquier laboratorio que realice antibiogramas con
regularidad debera comparar peridicamente sus resultados con la determinacin de
CMI como mtodo de control de calidad. A partir de esta comparacin podemos elaborar
un cuadro similar al siguiente, en el que se puede ver la clasificacin de resultados en las
dos tcnicas:





CMI
8

C

A

4
Error menor Error muy
grave

2

1 Error menor Error menor
C

0,5
C




0,25

0,12 Error grave Error menor
0,06

B

C

0,03

<14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42

Dimetros (Kirby-Bauer)


Se consideran errores graves clasificar una cepa resistente como sensible (A) o una cepa
sensible como resistente (B); mientras que se consideran errores menores la clasificacin
de resistentes o sensibles como intermedias (C).



Descripcin de la prctica

En esta prctica haremos una comparacin entre la tcnica de Kirby-Bauer (empleada
mayoritariamente en los laboratorios de diagnstico veterinario) y la de microdilucin en
placa (una de las tcnicas de referencia) utilizando una serie de cepas de E. coli aisladas
de casos clnicos de porcino. En el antibiograma debereis hacer una seleccin de seis
antibiticos a analizar (entre ellos obligatriamente la enrofloxacina) y en la prueba de
microdilucin analizaremos la sensibilidad a la enrofloxacina.





Resistente
Intermedio
Sensible
Resistente Intermedio Sensible
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1.- Fundamentos tericos de la prueba de difusin en disco de Kirby-Bauer

La prueba de difusin en disco se basa en la capacidad de muchos agentes
antimicrobianos de difundir en el agar creando un gradiente continuo de concentracin. Si
el disco que contiene el antibitico se deposita sobre una placa recin inoculada, se
producir la inhibicin del crecimiento del microorganismo analizado en un punto del
gradiente y dar como resultado un rea concntrica al disco de inhibicin del
crecimiento. Esta rea, al ser proporcional a la CMI permitir la distincin de cepas
sensibles, resistentes o intermedias.

Esta prueba est bien estandarizada y se acepta universalmente, si se realiza
adecuadamente con los controles necesarios (Anexo 1)


Puntos crticos

a) Concentracin del inculo. La concentracin ideal del inculo corresponde a una
dilucin de turbidez 0,5 en la escala de McFarland. Concentraciones diferentes
pueden dar lugar a interpretaciones errneas de los resultados.
b) Medio. El medio adecuado para realizar la prueba es el Mueller-Hinton (MH). Para
determinadas bacterias con requerimientos nutricionales especficos se pueden utilizar
el MH-sangre o el MH-chocolate.
c) Concentracin de los discos de antibitico. Para cada antimicrobiano hay fijadas unas
concentraciones estndar. La variacin de estas concentraciones implica variar los
criterios de interpretacin.


2.- Fundamentos tericos de la prueba de microdilucin en placa

sta es probablemente la prueba de determinacin de CMI ms popular. Consiste en
valorar el crecimiento del microorganismo a analizar en una serie de diluciones de caldo
que contienen cantidades decrecientes del antimicrobiano elegido. Habitualmente el
medio utilizado es el caldo de Mueller-Hinton o el Isosensitest. El inculo (cepa
bacteriana) se debe dispensar en los pocillos de una microplaca conteniendo las
diluciones de antibitico para tener una concentracin final de 5x10
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UFC/ml en un
volumen de entre 50 y 200 l. Despus de una incubacin de 20 h a 37C se determina la
capacitat de crecimiento de la bacteria en presencia del antimicrobiano para valoracin de
la turbidez del medio. La CMI se define como la mxima dilucin de antimicrobiano en la
que no hay crecimiento bacteriano. Es necesario incluir un microorganismo de control (ver
lista annexo 1), un control de creixement bacteriano y un control de pureza del inculo.
Adems, se debe validar la densidad del inculo realizando siembras de diluciones
seriadas.


Puntos crticos

a) Cantidad de inculo: inculos excesivos tienden a incrementar la CMI mientras que
inculos deficientes tienden a hacerla disminuir .
b) Pureza del inculo: Un inculo contaminado con un microorganismo diferente al que se
quiere analizar anula la prueba.
c) Incubacin: Incubaciones menores de 16 h o ms de 24 h pueden dar lecturas
errneas. El uso de CO2 puede alterar los resultados.

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Tareas a realizar durante la prctica

a) Seleccin de los antibiticos para el antibiograma
b) Preparar el inculo de la cepa problema para la prueba de Kirby-Bauer
c) Preparar el inculo de la cepa de control (E. coli ATCC 25922)
d) Inocular la placa de Mueller-Hinton
e) Dipositar los discos de los antimicrobianos seleccionados
f) Preparar les dilucions dantibitic per a la prova de microdiluci
g) Preparar el inculo de la prueba de microdilucin (cepa problema)
h) Preparar el inculo de la prueba de microdilucin (E. coli ATCC 25922 )
i) Dispensar el antibitico en las microplacas
j) Dispensar el control de medio
k) Dispensar el control de crecimiento
l) Dispensar la cepa problema
m) Dispensar la cepa de control
n) Incubar las placas
o) Leer los resultados e interpretarlos


METODOLOGA realizar durante la prctica


ANTIBIOGRAMA MTODO Kirby-Bauer


1.- Seleccionar los antibiticos (mximo 6) a probar en el anlisis

2.- Rotular una placa de Mueller-Hinton con la referencia del microorganismo

3.- Preparar una suspensin del microorganismo problema (a partir de una colonia del
TSA o agar-sangre) en solucin salina fisiolgica equivalente al 0,5 en la escala de
McFarland (reservar la suspensin)

4.- Mojar un hisopo estril en la suspensin

5.- Escurrir el exceso de lquido contra las paredes del tubo de ensayo

6.- Tapar el tubo e inocular la placa completamente

7.- Inocular dos veces ms en ngulos de 60

8.- Con la ayuda de unas pinzas que se esterilizan en alcohol y flameando dispensar los
antibiticos elegidos

9.- Dejar la placa en la estufa a 37C

10.- Pasadas 18-24 horas de incubacin, se pasa a medir el dimetro del halo de
inhibicin y se interpreta segn las tablas de estndares, que normalmente proporciona
cada casa comercial expendora de discos de antibiticos.




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MICRODILUCIN EN PLACA

1.- Dispensa 100 l de mediO Isosensitest en todos los pocillos de las 2 primeras filas
(A1B12).

2.- Dispensa 200 l de medio en los tres primeros pocillos de la tercera fila (C1, C2, C3)
(control de esterilidad)

3.- Prepara una dilucin 32g/ml de enrofloxacina mezclando 0,5 ml de medio
isosensitest y 0,5 ml de la dilucin 64g/ml de enrofloxacina (tubos rotulados como stock).

4.- Dispensa 100 l de la dilucin 32 g/ml en los pocillos de la primera columna en las
dos primeres filas de la placa de microdilucin (A1, B1)

5.- Con una pipeta transfiere 100 l de la primera columna a la segunda.

6.- Mezcla y repite la operacin hasta llegar a la ltima columna (n12) (A1A2A3... y
B1B2B3). Descarta los 100 l sobrantes.

7.- Aade 100 l de antibitico (64 g/ml) en los tres segundos pocillos de la tercera fila
(C4, C5, C6). A continuacin aade 100 l de medio sin antibitico (control de antibitico)
a esos mismos pocillos.

Aade 100 l de medio en los pocillos 7, 8, 9, 10, 11, 12 (C7-C12) de la tercera fila.

8.- A partir de la dilucin 0,5 McFarland de la cepa problema (aprox. 10
8
UFC/ml) haz una
dilucin 1:100 (10
-2
) por duplicado (transfiere 100 l de la suspensin a un tubo eppendorf
con 900 l de medio, mezcla y repite la dilucin en dos tubos)

9.- Aade 100 l de la suspensin bacteriana 10
-2
en todos los pocillos de la primera fila
A1 A12) y en los pocillos 7,8 y 9 (C7, C8, C9) de la tercera fila (control de crecimiento)

10.- Repite el paso 8 utilizando la suspensin que has preparado con la cepa de control
de E. coli (ATCC 25922)

11.- Aade 100 l de la cepa de control a todos los pocillos e la segunda fila (B1 B12)

12.- Dispensa 100 l de la cepa de control en C10-C12

13.- Deja la placa en la estufa.




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Annexo I


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