Manual Del Laboratorio de Cultivo de Tejidos

Instituto Politcnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa

Laboratorio de Cultivo de Tejidos
Manual elaborado por Jess Agustn Badillo Corona, Mara del Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,
Vernica Pacheco Gonzlez y Hernn Corts Arroyo
!

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGA

MANUAL DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS

ELABORADO POR:
Dr. Jess Agustn Badillo Corona
Dra. Mara del Carmen Oliver Salvador
IBt. Karen Gisela Moreno Guerrero
Biol. Vernica Pacheco Gonzlez
IBt. Hernn Cortes Arroyo

Mxico D. F. Agosto 2009
#
Relacin de prcticas

No. Titulo Numero de
sesiones*
1 Germinacin de semillas de diversas especies en condiciones de asepsia 4
2 Preparacin de medios de cultivo para la generacin de callos y
micropropagacin
5
3 Establecimiento de un cultivo de callos de explantes de zanahoria
(Daucus carota).
4
4 Micropropagacin de violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi. 5
5 Regeneracin de plantas completas a partir de explantes de hojas de
Nicotiana tabacum
5
*La sesiones necesarias para la realizacin de cada prctica no son necesariamente
continuas.

$
Prctica 1. Germinacin de semillas de diversas especies en condiciones de asepsia.

INTRODUCCION
Durante el desarrollo de una planta los procesos de formacin de semillas y de
germinacin son procesos absolutamente indispensables para la dispersin y perpetuacin
de la especie. Por este motivo, averiguar los mecanismos que gobiernan la germinacin
de semillas ha sido esencial para comprender tanto el papel reproductivo de stas, como
el papel que juegan en un contexto ecolgico que tiene implicaciones de competitividad y
dispersin.
Hasta el da de hoy se han identificado 4 requerimientos abiticos bsicos necesarios para
la germinacin:
1. Agua, mediado principalmente por el potencial hdrico del ambiente y de la
semilla. Se considera que es el factor determinante para que se realice la
germinacin (si no hay agua no hay germinacin).
2. Oxgeno, el cual ingresa a la semilla en forma gaseosa o disuelto en agua.
3. Temperatura, especfica para cada especie.
4. Luz, no es considerada un factor determinante, pero si un promotor de la
germinacin.

La semilla contiene al embrin generado por la fecundacin en la planta madre y
el xito que tenga para su supervivencia depende mucho de su habilidad para germinar en
el lugar y momento apropiado. Esto se asocia a mecanismos adaptativos que previenen la
germinacin en ausencia de un ambiente adecuado, lo que se denomina latencia de
semillas. En estos casos las estructuras de la semilla restringen cualquiera de los factores
antes mencionados, en especial el agua y el oxgeno, con lo cual se limita la germinacin.
Dentro de los procesos y factores reconocidos para la liberacin de las semillas del estado
de latencia se encuentran los siguientes:

Post maduracin (afterrippening): se obtiene cuando la semilla ha reducido el
nivel de humedad por desecacin.
%
Escarificacin natural. Se refiere a la permeabilizacin de la testa producto de la
degradacin de sta por diversos medios naturales (microorganismos, desgaste
mecnico, paso por el tracto digestivo etc.), permitiendo la penetracin de agua y
oxgeno hacia el embrin.
Congelamiento/enfriamiento: existen semillas que requieren perodos de
congelamiento para germinar.
Luz.

OBJETIVOS GENERALES
Inducir la germinacin de semillas de diferentes especies vegetales para la obtencin
de plntulas libres de hongos y bacterias.
Familiarizar al estudiante con las tcnicas de cultivo de vegetales in vitro
OBJETIVOS ESPECFICOS
Propiciar el desarrollo de habilidades cognitivas y procedimentales del alumno en el
empleo adecuado de las tcnicas de asepsia para el cultivo de semillas in vitro.
Preparar medios de cultivo para la germinacin de diferentes especies de semillas y
analizar las diferencias entre ellos.
Analizar las diferencias que existen entre las condiciones que propician la
germinacin de cada especie vegetal empleada.
Obtener plntulas sanas a partir de semillas de diferentes especies vegetales.
Cultivar las plntulas sanas obtenidas en condiciones ptimas para su desarrollo.

MATERIALES POR EQUIPO:
BIOLGICO
Semillas de jitomate, tabaco, lechuga, zanahoria y de una Bromelicea, Bromelia
hemisphaerica.

MATERIAL DE LABORATORIO 2 matraz Erlenmeyer de 500 mL
&
2 vaso de precipitados de 100 o
250 ml
1 piceta de 250 mL
1 agitador de vidrio
rollo de papel aluminio
4cajas de Petri
rollo de algodn
1esponja
10 Frascos tipo Gerber con tapa
de polietilino o Tubos de ensaye
2.5 x 30 cm
Masking-tape
2 Esptulas o cucharas de acero
inoxidable

EQUIPOS
Campana de flujo laminar
Autoclave
Potencimetro
Balanza analtica
REACTIVOS
Etanol al 70%
HCl 1.0 N
NaOH 1.0 N
H
2
SO
4
3.0 M
Sustancias orgnicas e inorgnicas
(ver anexo).

DESARROLLO EXPERIMENTAL:
Esterilizar previamente por equipo:
2 vasos de precipitado de 250 mL
1L de agua destilada
2 esptulas

PROCEDIMIENTO:
Preparacin del medio de cultivo:
1. Conforme a las indicaciones dadas por el profesor segn el nmero de equipos y las
especies vegetales a utilizar, preparar medio de cultivo semislido de Knop o MS
'
segn la formulacin indicada en el Anexo 1. El pH deber ajustarse con NaOH 1.0 N
antes de adicionar el agar a los medios (Medio Knop a pH de 5.5 y Medio MS a
pH.Preparar medio de cultivo en cantidad suficiente para 10 frascos o 10 tubos.
2. Fundir el agar en calor y verter 20 mL en cada frasco (tipo Gerber) o 15 mL en
cada tubo, cubrir con tapa de plstico o doble tapa de papel aluminio y sujetar con
ligas o Masking-tape, esterilizar en autoclave a 121C y 15 psi de presin durante 15
min.

Desinfeccin de semillas:
El siguiente protocolo puede ser utilizado para semillas de zanahoria, jitomate y lechuga.
a. Colocar las semillas en agua con extrn al 2% (o detergente) durante 30-40 minutos,
mantener en agitacin (manual o con un agitador magntico).
b. Enjuagar tres veces con agua estril para eliminar el detergente. A partir de este paso
trabajar en la campana de flujo laminar. Utilizar la esptula estril para retener las
semillas.
c. Sumergir las semillas en una solucin de etanol al 70% por 30 segundos (exactos).
d. Enjuagar tres veces con agua estril para eliminar el etanol.
e. Transferir las semillas a un vaso estril y sumergirlas en una solucin de hipoclorito
de sodio al 1% de cloro libre durante 10 min.
f. Lavar las semillas cinco veces con agua estril para eliminar el hipoclorito de sodio y
decantar, ayudndose con la esptula estril.

Siembra e incubacin de las semillas
g. Del vaso de precipitados, tomar una a una las semillas y colocarlas en los tubos o
frascos que contengan medio de Knop o MS con la ayuda de una esptula estril.
h. Colocar 3-5 semillas en cada tubo o frasco, procurando que queden separadas y en
contacto con el medio de cultivo.
i. Colocar los recipientes con las semillas en un cuarto de cultivo en oscuridad a una
temperatura de incubacin de entre 24 a 26 C.
(
j. Observar cada semana las semillas. Separar los tubos o frascos contaminados y anotar
si se trata de contaminacin bacteriana o fngica. Los frascos o tubos contaminados
debern esterilizarse a la brevedad.
k. A la aparicin del coleptilo, exponer los tubos al fotoperodo natural hasta que la
plntula alcance una altura aproximada de 8-10 cm (dependiendo de la especie).

Protocolo para semillas de B. hemisphaerica:
IMPORTANTE: Durante el seguimiento de este protocolo, debern extremarse
precauciones al manejar el acido sulfrico ( H
2
SO
4
). Es altamente txico y corrosivo.

a. Colocar las semillas en extrn al 2% (o detergente) durante 40 minutos. Mantener
en agitacin de forma manual o con un agitador magntico.
b. Enjuagar varias veces con agua para eliminar el detergente. A partir de este paso
trabajar en la campana de flujo laminar.
c. Transferir las semillas a un vaso estril y sumergir las semillas en una solucin de
H
2
SO
4
3.0 M durante 10 min.
d. Enjuagar varias veces con agua estril para eliminar el H
2
SO
4
. El enjuague debe
realizarse con extremo cuidado a fin de no mermar la cantidad de semillas durante
el proceso.
e. Transferir las semillas enjuagadas a un vaso estril y sumergirlas en una solucin
de etanol al 70% durante 30 segundos.
f. Enjuagar varias veces con agua estril para eliminar el etanol.
g. Transferir las semillas a un vaso estril y dejarlas en el mismo vaso, hidratando
con agua estril aproximadamente 24 horas, en condiciones de asepsia (el vaso
deber permanecer perfectamente tapado).
h. Del vaso de precipitados, tomar una a una las semillas y transferirlas a los frascos
con medio Knop con la ayuda de una esptula estril.
i. Colocar de 3 a 5 semillas por frasco, procurando que queden separadas y en
contacto con el medio de cultivo.
)
j. Coloque los frascos, con las semillas en el cuarto de cultivo en la oscuridad a una
temperatura de incubacin de entre 24 y 26 C.
k. Observar cada semana las semillas. Separar los tubos o frascos contaminados y
anotar si se trata de contaminacin bacteriana o fngica. Los frascos o tubos
contaminados debern esterilizarse a la brevedad
l. A la aparicin del coleptilo, exponer los frascos al fotoperodo natural hasta que
la plntula alcance una altura aproximada de 2-3 cm.

CUESTIONARIO
1. Qu pasa si las semillas se dejan ms tiempo en etanol?
2. Por qu las semillas de B. hemisphaerica son tratadas con H
2
SO
4
?
3. Qu es el coleptilo?
4. Mencionar 3 puntos crticos para la germinacin de semillas de B. hemisphaerica.
5. Por qu algunas semillas requieren de la obscuridad para germinar? Qu tipo de
tratamiento luminoso requieren algunas semillas para poder germinar?

NOTA. Adems de los puntos mnimos que debe incluir el informe escrito de la prctica
(Objetivos, introduccin, desarrollo, resultados, etc.) se debern incluir y discutir los
siguientes puntos:

El tiempo de germinacin de las semillas
El % de germinacin.
Una comparacin de estos resultados con los dems equipos.
Discutir a detalle el papel que juega cada una de la soluciones en el proceso de
desinfeccin.

BIBLIOGRAFA
*
Barrera Badillo G. y Oliver Salvador (2004). III Congreso Internacional y XIV
Congreso Nacional de Ingeniera Bioqumica. Veracruz, Ver. del 31 de marzo al 2
de abril.
Kieran, P.M., Mac Loughlin P.F., Malone D.M. (1997). Plant cell suspension
cultures: some engineering considerations. Journal of Biotechnology. 59, 39-52.
Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.
!+
Prctica 2. Preparacin de medios de cultivo para la generacin de callos y
micropropagacin

INTRODUCCIN

Entre los factores ms importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfolgica
deseada en un cultivo de tejido in vitro, es la composicin del medio de cultivo. El medio
de cultivo est conformado por macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia
de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del
crecimiento y hormonas vegetales, que ayudarn a obtener un callo, una planta completa,
o un rgano vegetal en particular, a partir del explante elegido (en condiciones de
asepsia) y algn agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.). Los principales
componentes de los diferentes medios de cultivo se presentan en el cuadro 1:

Cuadro 1. Principales componentes del medio para cultivos vegetales in vitro.
Componentes Caractersticas

Fuente de carbono
Generalmente, la mayora de los cultivos de clulas vegetales no
son auttrofos y por lo tanto dependen completamente de una
fuente externa de carbono. En muchos casos, se prefiere
sacarosa, y ocasionalmente glucosa (Ej., cultivos de algodn) o
maltosa (Ej., cultivo de anteras).
Sustancias
inorgnicas
Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe,
Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I) en proporciones adecuadas.

Vitaminas
Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, cido flico,
cido nicotnico, entre otras.

Hormonas
reguladores del
crecimiento
Auxinas: promueven la elongacin celular, la formacin de
callos y races adventicias, inhiben la formacin de brotes
axilares adventicios y, en ocasiones, inhiben la embriognesis.
Citocininas: promueven la divisin celular, regulan el
crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales.
Otras: giberelinas, cido abscico, etileno.
Adaptado de Hall (2000).
Las exigencias minerales varan con la especie, la naturaleza del tejido y su estado
fisiolgico, pero, adems, tambin varan con el mtodo de cultivo y el tipo de
!!
organognesis estudiado. Por ejemplo, los meristemos y, en forma general, los tejidos con
actividad metablica elevada, pueden presentar importantes necesidades en potasio.

En 1962, Murashige y Skoog propusieron un medio para la investigacin del crecimiento
ptimo de callos de la planta del tabaco (Nicotiana tabacum). Este medio es netamente
superior a los medios anteriormente usados para iniciar la organognesis y,
particularmente, para la formacin de yemas.

A partir de estos resultados, el medio MS se ha empleado de una manera muy general
para todos los tipos de cultivo in vitro. Adems, puede afirmarse que ha sido la
utilizacin del medio MS junto con el empleo de fitohormonas apropiadas (citocininas y
auxinas), lo que ha permitido el xito de los trabajos sobre organognesis en cultivo in
vitro. El medio MS est caracterizado, principalmente, por un contenido elevado de
nitrgeno del cual 1/3 del total est aportado en forma reducida (NH4+) y por una
concentracin igualmente elevada en potasio.

Los tejidos y clulas cultivadas in vitro son ampliamente hetertrofos con respecto al
carbono debido a la ausencia o insuficiente asimilacin por clorofila. Por lo que resulta
indispensable aadir azcares a los medios de cultivo, siendo los dos ms utilizados la
sacarosa y la glucosa. La concentracin ptima del azcar en los medios de cultivo vara
entre 2080 g/L, en dependencia del tipo de cultivo, material vegetal, etc. Los azcares
presentan una accin metablica y energtica (Hall, 2000).
OBETIVO GENERAL

Preparar medios de cultivo para el cultivo in vitro de tejidos vegetales

DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Preparar medio de cultivo MS semi-slido (ver anexo). Complementarlo con los
reguladores del crecimiento vegetal apropiados. Para cultivos de zanahoria utilizar 1.0
mg/L 2,4-D (2,4 cido diclorofenoxiactico). Para generacin de callos de la planta
del tabaco, adicionar 1.0 mg/L de BAP (Bencil aminopurina) y 0.1 mg/L de ANA.
Para la micropropagacin de violeta utilizar 1.0 mg/L de AIA y 0.08 mg/L de BAP.
2. Adicionar a todos los medios sacarosa 20 g/L y agar-agar 6.0 g/L, mioinositol 0.1
g/L.
3. Utilizar las vitaminas de Gamborg (1976), tambin conocidas como B5. Para violeta
y zanahoria utilizar vitaminas MS.
4. Ajustar el pH a 5.5 con NaOH 1.0 N, antes de agregar el agar.
!#
5. Fundir el agar en calor y verter 25 mL por frasco (tipo Gerber). Cubrir con doble
tapa de papel aluminio y sujetar con una liga o con tapa de plstico, esterilizar en
autoclave a 121C y 15 lb. de presin durante 15 min.
!$

BIBLIOGRAFA

Hall R.D (2000). Plant cell culture initiation. Molecular Biotechnology 16:
161-173.
Gamborg OL, Miller RA and Ojima K. (1968). Nutrient requirements of
suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res. 50:151-8.
Murashige T and Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.

!%
Prctica 3. Establecimiento de un Cultivo de Callos de Explantes de Zanahoria
(Daucus carota)

Adaptada de Dodd and Roberts, 1985.

INTRODUCCION

Los callos de plantas son masas celulares diferenciadas, no organizadas y de rpido
crecimiento que pueden ser producidas en todas las especies de plantas en respuesta a un
suplemento de hormonas endgenas o externas. Los cultivos de callos de plantas (callos
que crecen aspticamente en medios semislidos con agar y hormonas vegetales) y
cultivos de suspensin de callos (callos que crecen aspticamente en medio lquidos en
matraces o biorreactores) han incrementado su uso en Biotecnologa como una
herramienta para la manipulacin gentica de plantas, micropropagacin, estudios del
metabolismo y de desarrollo celular de plantas, as como para la produccin comercial de
productos naturales (metabolitos primarios y secundarios). (Mc Donald, y col. 1995).

OBJETIVO GENERAL
Familiarizar al estudiante con las tcnicas de cultivo de vegetales in vitro y establecer
cultivos de callos.

MATERIALES:

BIOLGICO
Races de Zanahoria (Daucus carota)
sanas y frescas.

MATERIAL DE LABORATORIO (por
cada equipo)
3 vasos de precipitado de 250 ml
2 pipetas de 1 ml
1 piceta de 250 ml
2 cajas de Petri
Hojas de papel blanco o papel kraft
(estril)
Algodn
Bistur, navajas de bistur y pinzas de
diseccin

EQUIPOS
Autoclave
Potencimetro
Balanza analtica
REACTIVOS
Etanol al 70%
Solucin de hipoclorito de sodio:
blanqueador comercial (5.5 % de cloro
libre) al 10 %.
HCl 1.0 N
NaOH 1.0 N
!&
1.0 litro de agua destilada estril.

Frascos Gerber con Medios de Murashige y Skoog (MS) preparados en la Prctica 2 o
(Soluciones patrn de sustancias orgnicas e inorgnicas del Anexo de dicha prctica).

PROCEDIMIENTO
1. Preparar medio de cultivo MS semi-slido, complementarlo con 2,4-D 1.0 mg/L,
sacarosa 20 g/L y agar-agar 6.0 g/L, mioinositol 0.1 g/L y vitaminas. Ajustar el pH a
5.5 con NaOH 1.0 N, antes de agregar el agar.

2. Preparar otro medio de cultivo, MS sin mioinositol. Todo los dems componentes a la
misma concentracin y ajustar el pH del medio a 5.5.

3. Fundir el agar en calor y verter 25 mL por frasco, tapar con doble tapa de papel
aluminio y sujetar con una liga o con tapa de plstico, esterilizar en autoclave a 121C
y 15 lb. de presin durante 15 min.

MATERIAL VEGETAL
Utilizar zanahorias de aproximadamente 20 cm de longitud y 4 cm de dimetro.

a. Lavar las zanahorias con agua corriente y jabn dentro de un recipiente agitando
manualmente.
b. Pelar las zanahorias con un pelador de vegetales, eliminar 2 mm del tejido.
c. Cortar a las zanahorias en rebanadas de un cm de grueso.
d. Sumergir las rebanadas en una solucin de etanol al 70% por 30 seg.
e. Sumergir las rebanadas en una solucin de hipoclorito de sodio al 10%, durante 10
minutos, a partir de este paso trabajar en la campana de flujo laminar.
f. Durante el tiempo de espera, numerar y pesar los frascos en los cuales se van a
colocar los tejidos.
g. Lavar el material vegetal cinco veces con agua destilada y estril, con agitacin
dentro de un vaso de precipitados, durante 30 seg.
h. Del vaso de precipitados, tomar una a una las rebanadas y transferirlas a una caja de
Petri estril y con la ayuda de unas pinzas de diseccin, cortar cubos de la zona del
cambium de un centmetro por lado de acuerdo con lo indicado en la figura 1.
i. Colocar tres cortes (cubos) de cambium por frasco, procurando que la superficie de
uno de los lados del cubo quede en contacto con la superficie del medio de cultivo.
!'
j. Volver a pesar los frascos y calcular el peso de los explantes por diferencia.
k. Coloque los frascos con los explantes en un cuarto de cultivo con fotoperiodo de 16
horas de luz por 8 de oscuridad a una temperatura de 24-26 C.
l. Observar cada tres das el desarrollo de los cultivos, anotar las apariencias y cambios
que van sufriendo los explantes. Separar los frascos con explantes necrosados y
contaminados y describir si se trata de contaminacin bacteriana o fngica. Es de
particular importancia determinar el tiempo de aparicin de los callos.
m. Pesar los frascos cada semana para calcular la tasa de crecimiento del callo.

Requisitos para el informe escrito.
1. Con los datos obtenidos del peso de los frascos, realizar la curva de crecimiento
del cultivo de callos, en peso fresco vs tiempo.
2. El informe de la prctica debe contener los resultados de todos los equipos del
grupo con los que se realizar la discusin y las conclusiones de los experimentos
realizados en la misma.
3. Cual es el papel, en general, del mioinositol en la fisiologa de las plantas?
4. Incluir en su informe (despus de haberlo ledo) una copia de, por lo menos, un
artculo reciente sobre el tpico o el cultivo de clulas y/o tejidos vegetales.

BIBLIOGRAFA.

1. Lebowitz, R. J. 1995. Micropropagation of African Violet. In Plant Biothecnology. A
Laboratory Manual. WCB Wm. C. Brown Publishers. Dubuque, Iowa; Melbourne,
Australia; Oxford, England.
2. Mc Donald, K., Jackman, A., Thorup, J. And Dandekar, A. (1995), Applied
Biochemistry and Biotechnology. 54. 93-108.
3. Dixon, R. A.(1985), Isolation and Maintenance of callus and cell suspension cultures
in plant cell culture. A practical approach. Ed. Dixon R. A. IRL Press, Oxford.
Washington.
4. Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.

!(
Prctica 4. Micropropagacin de violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi.
Adaptada de Franco y Garca, 1995.

INTRODUCCION

La tcnica de micropropagacin de especies vegetales, utiliza diversas porciones de
rganos, tejidos, etc. y proporciona una herramienta capaz de producir un gran nmero de
plantas en cada cultivo; como consecuencia de la totipotencialidad de las clulas
vegetales.
Una planta ornamental de gran inters dentro del comercio y la jardinera, es la violeta
africana Saintpaulia ionantha Wendi, originaria del este de frica. En la actualidad, se
conocen ms de 20 especies y cientos de variedades, las que se propagan por germinacin
de semillas o en forma vegetativa por esquejes. Las violetas son plantas muy apreciadas y
por lo mismo, se encuentran ampliamente distribuidas por todo el mundo a travs de las
asociaciones de floricultores y aficionados. Las violetas africanas presentan gran
diversidad morfolgica y con una amplia gama de tonalidades de flores que van desde
violeta prpura a blancas.
En la literatura encontramos varios autores que desarrollaron diversas tcnicas de cultivo
in vitro para obtener violetas africanas a gran escala, a partir de pequeas porciones de
peciolo y tejido foliar, entre ellos se puede citar a Start y Cumming (1976), Bilkey y
Mc.Cown (1978) y Cooke R. (1977).

OBJETIVOS GENERALES
Demostrar los principios de la micropropagacin y regeneracin de plantas.
Propagar violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi, por cultivo in vitro de
explantes foliares y de peciolo.

MATERIALES
BIOLOGICOS
1 maceta con una planta de violeta africana (Saintpaulia ionantha Wendi.)
EQUIPOS
Autoclave
Potencimetro
!)
Balanza analtica

MATERIAL DE LABORATORIO
1 matraz Erlenmeyer de 2L
1 matraz Erlenmeyer de 1L
2 vasos de precipitados de 250 ml
2 pipetas de 1 ml
1 piceta de 250 ml
1 agitador de vidrio
5 cajas de Petri
rollo de papel aluminio
rollo de algodn
bistur y pinzas de diseccin

REACTIVOS
Etanol al 70%
Solucin de hipoclorito de sodio:
blanqueador comercial (5.5 % de cloro
libre) al 10 %
HCl 1.0 N
NaOH 1.0 N
2.0 litros de agua bidestilada estril.
Soluciones patrn de sustancias
orgnicas e inorgnicas (ver apndice).
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Preparar un litro de medio de cultivo semi-slido de Murashige y Skoog (1962), MS,
complementarlo con cido nicotnico 0.5 mg, piridoxina 0.5 mg, cido indolactico
2.0 mg, 6-bencil aminopurina 0.08 mg, sacarosa 30 g y agar 6.0 g. Ajustar el pH a
5.7.
2. Preparar el medio MS disminuyendo a la cuarta parte la concentracin de las
sustancias inorgnicas y sacarosa 15 g/L. El resto de los componentes se utilizar en
la misma concentracin. Ajustar el pH a 5.7.
3. Fundir el agar en calor y verter 20 mL por frasco, tapar con doble tapa de papel
aluminio y sujete con una liga o con tapa de plstico. Esterilizar en autoclave a 15
libras de presin y 121C durante 15 min.

PREPARACIN DEL MATERIAL VEGETAL.

Utilizar hojas de violeta africana, de la planta patrn o una planta sana. Escoger varias
hojas desarrolladas, jvenes (2-3 cm de dimetro) y sanas, dejar un centmetro de peciolo.

!*
a. Colocar las hojas dentro de un vaso de precipitados, lavar con agua corriente y jabn
agitando manualmente.
b. Sumergirlas en una solucin de etanol al 70% por 30 seg.
c. Sumergir las hojas en una solucin de hipoclorito de sodio al 10%, durante 10
minutos. A partir de este paso trabajar en la campana de flujo laminar.
d. Lavar el material vegetal cinco veces con agua destilada y estril, con agitacin
dentro de un vaso de precipitados, durante 30 seg.
e. Del vaso de precipitados, tomar una a una las hojas, trasnferir a una caja Petri estril y
con la ayuda de unas pinzas de diseccin, cortar en fracciones de un centmetro
cuadrado como se muestra en la figura 1.
f. Colocar dos o tres fracciones foliares por frasco, procurando que el envs foliar quede
en contacto con la superficie del medio de cultivo.
g. Colocar los frascos con los explantes en un cuarto de cultivo, con fotoperiodo de 16
horas luz, por 8 horas de oscuridad, a temperatura de 24C.
h. Observar cada tercer da el desarrollo de sus cultivos. Anotar los cambios en la
apariencia de los explantes. Separar los frascos con explantes necrosados y
contaminados y registrar si se trata de contaminacin bacteriana o fngica

Colocar en diferentes frascos los explantes de: a) peciolo, b) parte central de hoja y c)
parte externa de la hoja (ver figura 1). Deben utilizarse los siguientes medios con los
explantes: 1) MS y 2) MS a un cuarto de sales y 15 g/L de sacarosa.

Discutir en el informe escrito sobre los siguientes puntos:
1. Cul es el significado del trmino totipotencialidad celular?.
2. En la prctica, considera factible el cultivo de una clula aislada y obtener una planta
completa?
3. Escriba el significado del trmino micropropagacin.
4. Qu es una clula somtica?
Incluir en su informe, al menos un artculo, reciente, sobre el tema de la prctica o el
cultivo de callos, clulas y/o tejidos vegetales al que previamente se le ha dado
lectura.
5. El informe de la prctica debe contener los resultados de los todos los equipos ,
discusin y conclusiones sobre los experimentos realizados bien estructuradas y
sustentadas en la literatura consultada.

BIBLIOGRAFIA.
1. Bilkey, P.C. and B.H. Mc Cown 1978. Micropropagation of African Violet from
Petiolo Cross- Section. HortScience 13 (1):37-38.
#+
2. Cooke, R. 1997. Tissue Culture Propagation of African Violets. HortScience
12(6):549
3. Franco Rodrguez Jos y M. T. Garca, 1995. Ensayo demostrativo sobre la
propagacin de violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi por cultivo de tejidos.
An.Esc.Nac.Cienc.Biol.Mxico, 40:107-115.
4. Martin, C. 1985. Cultivo de plantas en probeta. Mundo Cientfico. No.44:160-169.
5. Murashige, T. And Skoog, 1962. A revised medium of rapid growth and bioassays
with tobacco tissue. Physiol.Plantarum. 15:473-497.
6. Pierik, R.L.M.1994. Biotecnologa Vegetal como herramienta en la horticultura
ornamental: Revista Chapingo, serie Horticultura 1:45-57. Mxico.
7. Smith, R.H. and R.E. Noris. 1983. In vitro propagation African Violet chimeras.
HortScience 18(4):436-437.
8. Star, N.D. and B.G. Cumming. 1976. In vitro propagation of Saintpaulia ionantha
Wendl. HortScience 11:204-206.
9. Lebowitz, R. J. 1995. Micropropagation of African Violet. In Plant Biothecnology. A
Laboratory Manual. WCB Wm. C. Brown Publishers. Dubuque, Iowa; Melbourne,
Australia; Oxford, England.
#!
Prctica 5. Regeneracin de plantas completas a partir de explantes de hojas de
Nicotiana tabacum

Introduccin.
Para poder regenerar una planta completa en cultivo de tejido in vitro, es necesario
proveer al tejido de los requerimientos nutricionales y factores ambientales necesarios,
tales como el medio de cultivo, vitaminas, reguladores del crecimiento vegetal, pH,
temperatura, etc. De particular importancia son los reguladores del crecimiento vegetal,
ya que de stos depende la respuesta que tendr el tejido in vitro. En 1962, Murashige y
Skook realizaron experimentos con la planta del tabaco y con ello marcaron la pauta para
determinar los requerimientos para poder regenerar la planta completa del tabaco a partir
de explantes de hojas. Actualmente, la regeneracin de cualquier planta completa en
cultivo de tejidos in vitro es de particular inters para la Ingeniera gentica de plantas ya
que este paso ha sido decisivo para llevar a cabo modificaciones genticas de plantas
utilizando Agrobacterium tumefaciens (Prctica 6) y bombardeo de micropartculas.

OBJETIVO GENERAL
Familiarizar al alumno con las tcnicas utilizadas para el cultivo de explantes de la planta
del tabaco y regenerar la planta completa.

MATERIALES:
BIOLOGICO
Plantas de tabaco crecidas en condiciones de asepsia. Utilizar las obtenidas en la prctica
MATERIAL DE LABORATORIO (por cada equipo)
2 cajas de Petri
Bistur, navajas de bistur y pinzas de diseccin

EQUIPOS
Autoclave
Potencimetro
##
Balanza analtica

REACTIVOS
Etanol al 70%

Frascos Gerber con Medios de Murashige y Skoog (MS) preparados en la Prctica 2.
(Ver Anexo I para la composicin de las soluciones patrn de sustancias orgnicas e
inorgnicas).

PROCEDIMIENTO
1. En una campana de flujo laminar, abrir los frascos en los que se germinaron las
semillas de tabaco.
2. Con un bistur, cortar hojas jvenes de la planta del tabaco. Las hojas que mas
rpido y mejor regeneran son las jvenes pero en teora hojas de cualquier edad
son tiles.
3. Colocar las hojas en una caja de Petri y realizar cortes de 1 x 1 cm. Cortar el
tejido vascular principal y eliminar. Las hojas se manipulan mejor si se colocan
con el envs haca arriba.
4. Colocar los cortes (3-4 por frasco) en medio MS semi-slido suplementado con
1.0 mg/L de BAP y 0.1 mg/L de ANA.
5. Realizar observaciones cada semana. El tejido se expande y luego forma brotes
pasando por un periodo casi imperceptible de callo.
6. Si a las 4 semanas no han surgido brotes, transferir el tejido a medio fresco.
7. Cuando hayan surgido brotes y stos hayan crecido de 2-3 cm, transferirlos a
medio MS semi-slido, con vitaminas B5 y SIN REGULADORES DEL
CREIMIENTO VEGETAL, para que formen races.

Requisitos para el reporte escrito.

Incluir fotos del desarrollo del tejido.
Explicar si es posible utilizar explantes de otros tejidos (tallo, hojas, polen, etc)
Cmo se llama a la regeneracin que no pasa por tejido calloso?
Qu otras especies son capaces de formar una planta completa a partir de
explantes de hojas?

#$

Bibliografa
1. Murashige, T. And Skoog, 1962. A revised medium of rapid growth and bioassays
with tobacco tissue. Physiol.Plantarum. 15:473-497.

#%
Anexo I
Formulacin de medios de cultivo
Medio de Knop
Sustancia mg/L
MgSO
4
7H
2
O 200
KNO
3
200
KH
2
PO
4
200
Ca(NO
3
) 4H
2
O *CaCl
2
800 *374
Agar 6000
pH 5.5

Medio de Murashige y Skoog (1962)
Macronutrientes Concentracin final mg/L g (para un stock 10X en 1L)
NH
4
NO
3
1650 16.5
KNO
3
1900 19.0
CaCl
2
H
2
O 440 4.4
MgSO
4
2H
2
O 370 3.7
KH
2
PO
4
170 1.7
NaH
2
PO
4
H
2
O 85 0.85

Micronutrientes mg/L mg (para un stock 100X en 100 mL)
KI 0.83 83
H
3
BO
3
6.2 620
MnSO
4
4H
2
O 22.3 2203
ZnSO
4
4H
2
O 8.6 860
#&
NaMoO
5
2H
2
O 0.25 25
CuSO
4
5H
2
O 0.025 25
CoCl
2
6H
2
O 0.025 25
Na
2
EDTA 2H
2
O 37.2 3720
FeSO
2
7H
2
O 27.8 2780
Murashige y Skoog (micronutrientes) No cat. Sigma M0519 1L (Stock 10X)

Se recomienda preparar por separado los stocks para macronutrientes, micronutrientes y
Na
2
EDTA 2H
2
O y FeSO
2
7H
2
O. Es importante verificar la cantidad de molculas de
agua que contiene el compuesto, en caso de tener ms o menos molculas de agua, es
necesario hacer el ajuste.

Compuestos
Orgnicos
Murashige & Skoog
(1962) mg/L
*MS Vitaminas
1000X mg/mL
cido nicotnico 0.5 0.5
PiridoxinaHCl 0.5 0.5
TiaminaHCl 0.1 0.1
Glicina 2.0 2.0
Mioinositol 100
*MS Vitamin solution (1000X) 50 ml No cat Sigma M3900

Sacarosa 20 g/L
Agar-agar o agar bacteriolgico 6.0 g/L
pH 5.8

#'

ANEXO II

GLOSARIO

Apical: zona extrema del tallo que le proporciona crecimiento en longitud al mismo.
Asptico: libre de grmenes contaminantes.
Axial: zona comprendida entre el eje de un tallo o rama y una hoja.
Callognesis: proceso en el que a partir de un explante se genera una masa amorfa de
clulas llamada callo.
Cmara de flujo laminar: aparato que proporciona en su interior un ambiente
totalmente estril, necesario para la manipulacin del material asptico (tejido y medios
de cultivo).
Catalogacin: mtodo utilizado para determinar si una planta tiene o no virus.
Clon: elemento de un grupo de individuos propagados asexualmente a partir de un solo
organismo, del cual conservan las caractersticas genticas.
Embriognesis somtica: proceso en el cual se forman, a partir de un explante,
embriones asexuales, los cuales dan origen a plantas completamente desarrolladas.
Explante: pequea porcin del tejido vegetal que funciona como generador de nuevas
plantas en el cultivo in vitro.
Fito-hormonas: compuestos qumicos que actan, en muy bajas concentraciones,
regulando el crecimiento de los tejidos vegetales.
Fito-patgenos: microorganismos que actan en forma daina en las plantas.
Hibridacin: cruza entre dos organismos de variedades o especies diferentes.
Hbrido: organismo obtenido por la hibridacin.
In vitro: tcnicas de reproduccin artificial en condiciones de laboratorio.
Meristemo: estructura localizada en diferentes zonas de la planta a partir del cual se
forman todos los rganos de la misma.
#(
Organognesis somtica: proceso en el cual se forman rganos (races, tallos, etc.) a
partir del explante.
Plntulas: plantas pequeas en proceso de desarrollo.

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