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Mtodos de aislamiento
Aislamiento de hongos y bacterias
24 de abril al 5 de mayo de 2012
Unidad de Fitopatologa
Dto. de Proteccin Vegetal
Facultad de Agronoma.
Dr. Pedro Mondino
Tcnicas de Aislamiento de hongos y
bacterias fitopatgenas.
Aislamiento de flora epiftica, de suelo,
rizosfera.
Fundamentos, aislamientos directos e
indirectos.
Uso de medios selectivos.
Uso de cebos.
Mtodos de aislamiento
Aislamiento a partir de tejido vegetal
A partir del tejido vegetal enfermo es posible
aislar a los patgenos.
Se busca tomar trozos de la zona de avance
para incrementar las chances de aislar al
patgeno.
Los trozos de tejido vegetal se someten a una
desinfeccin superficial.
En el caso de bacterias es posible macerar un
trozo de tejido afectado y luego sembrar
Mtodos de aislamiento
Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de
avance del patgeno .
Ej: a partir de frutos afectados
Aislamiento a partir de trozos de tejido
vegetal
Trozos de tejido afectado de la zona de avance son
sembrados en medio de cultivo (ej. Madera)
Aguaestril
Hipoclorito 1%
Pinza
Bistur
Siembraen placa
Zonadeavance
Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de
avance del patgeno .
Aislamiento a partir de tejido vegetal
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Aislamiento de bacteria a partir del
tejido infectado
Tocando con el ansa en la zona de avance
de la infeccin es posible aislar la bacteria.
Aislamiento de bacterias por macerado
del tejido vegetal
El tejido afectado es macerado en mortero y
luego el macerado es estriado en placa.
Aislamiento directo a partir del signo.
Cuando la muestra vegetal presenta signo es
posible tomar una pequea porcin del
mismo y sembrar en una placa con medio de
cultivo.
Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible
tomar una pequea porcin del mismo y sembrar en
una placa con medio de cultivo.
Aislamiento directo a partir del signo.
Cuando la muestra vegetal presenta signo es
posible tomar una pequea porcin del mismo y
sembrar en una placa con medio de cultivo.
Aislamiento directo a partir del signo.
Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible
tomar una pequea porcin del mismo y sembrar en
una placa con medio de cultivo.
Aislamiento directo a partir del signo.
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Aislamiento directo de zooglea
Aislamiento a partir del exudado
bacteriano
Un trozo de tallo de una planta afectada vascularmentees
colocado en agua en recipiente con agua o salineesteril.
Ansa
Flujo bacteriano
en agua estril
Estriado en placa
Induccin del signo
La aparicin de signo puede ser inducida mediante
cmara hmeda.
Induccin del signo
La aparicin de signo puede ser inducida
mediante cmara hmeda.
Uso de cebos
Trozos de manzana verde son utilizados para
capturar Phytophthora sppdel suelo.
Uso de cebos
Cebos utilizados para aislar Pythium:
ptalos de clavel (Dianthus caryophyllus L.)
Caamones (Cannabis sativa L.) hervidos.
Trozos de zanahoria (Daucus carota L.)
Papa (Solanunt tuberosum L.) +agar-agua.
Trozos de tomate verde (Lycopersicon esculentum L)
Acculas de pino (Pinus spp.).
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Colonizadores de patgenos
Se pueden encontrar antagonistas colonizando
naturalmente a los patgenos de plantas.
Se pueden utilizar a los patgenos como cebo
para capturar a sus antagonistas.
Colonizadores de esclerotos
Aislamiento a partir de la flora
epifticadel fruto
Aislamiento de microorganismos del
suelo
La muestra de suelo se suspende en agua estril.
Se hacen diluciones 10
-1
a 10
-10
veces.
De cada dilucin se siembran por extensin dos
placas con 100 L (0.1 ml) en medios de cultivo
(dependiendo del tipo de microorganismos que
queramos aislar) y luego se incuban.
Se aslan colonias separadas de distinta morfologa y
se purifican mediante repiques.
Aislamiento de microorganismos del
suelo
Esquema de la metodologa utilizada para aislar a partir
de suelo.
Microorganismos rizofricos.
Microorganismos aislados de la rizosferade
plantas de tomate.
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Cultivos puros
para obtener un cultivo puro se debe inocular o
introducir, una sola clula o propgulode un
microorganismo en un medio slido o lquido,
esterilizado previamente.
Mtodos de aislamiento
Para aislar clulas individuales, los
microorganismos han de ser diluidos, debido
al gran numero en que normalmente estn
presentes.
La dilucin se realiza, normalmente, por uno
de los siguientes sistemas:
siembra por estra en placa
vertido en placa
extensin en placa.
Para que se pueda contar el nmero de
colonias en la placa debe estar entre 30 y
300.
Mtodo de extensin en placa
Mtodo de estriado en placa
Esquema prctico del aislamiento de bacterias
Colonias aisladas
Mtodo de extensin en placa
A partir de una suspensin concentrada de
microorganismos se realizan diluciones
seriadas.
Mtodo de extensin en placa
0,1 ml de la solucin se siembra en superficie y
se esparce mediante rastrillo de vidrio.
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Aislamiento de bacterias
Aislamiento por estriado
Mtodo de extensin en placa
0,1 ml de la solucin se siembra en superficie
y se esparce mediante rastrillo de vidrio.
Mtodo de vertido en placa
0,1 ml de la solucin se siembra en superficie
y se esparce mediante rastrillo de vidrio.
Cultivos monospricos
Para asegurarnos la homogeneidad gentica de un
cultivo de hongos se recurre a la tcnica de cultivo a
partir de una nica espora.
Los cultivos monospricos se pueden realizar:
sembrando en superficie una suspensin de esporas
y luego observando bajo lupa o microscopio repicar.
Sembrando diluciones de forma que crezcan colonias
aisladas.mm
Cultivos monospricos
Monospricos de Venturia inaequalis.
Metodologa
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Metodologa
Monospricos a partir de colonias aisladas de una
siembra de una suspensin diluida.
Cultivo a partir de punta de hifa
Cuando no es posible disponer de esporas
se puede recurrir al cultivo de punta de hifa