9. Centrifugacin.

Estudio del hematocrito

Isaac Tnez Fiana, Mara del Carmen Muoz, Pedro Montilla Lpez

Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Facultad de Medicina, Avda. Menndez Pidal s/n,
14004 -Crdoba


RESUMEN

Las partculas en disolucin pueden sufrir alteracin espacial, es decir, pueden
cambiar de posicin con el tiempo. Esto puede ser debido a procesos de difusin
(en un gradiente de concentracin, las partculas tienden a ir de la zona de mayor
concentracin a la de de menor concentracin) o bien a procesos de
sedimentacin. En las siguientes pginas se exponen los principales conceptos
tericos y matemticos sobre la centrifugacin, as como su aplicacin y uso,
teniendo como objetivo principal el conocimiento bsico de esta tcnica.

Palabras Clave: Centrfuga, plasma, sangre, sedimentacin

Abreviaturas. rpm: revoluciones por minuto


1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS

La centrfuga es una mquina diseada para separar partculas de una disolucin
sea cual sea la naturaleza de las mismas. Bsicamente consiste en un motor elctrico
que lleva unido un vstago, que a su vez soporta un cabezal o rotor donde se colocan
los recipientes con las muestras. Existen don tipos fundamentales de cabezales o
rotores, basculantes o de ngulo fijo.


















1

La centrifugacin es una tcnica de transporte basada en el movimiento de las
partculas, suspendidas en un medio lquido especfico, impulsadas por una fuerza
denominada centrfuga, que tiende a desplazarlas hacia fuera del centro de rotacin.
Tanto la viscosidad de la disolucin-muestra (esto es de gran inters para las
aplicaciones analticas) como las propiedades fsicas de las partculas afectarn a la
sedimentacin individual de las mismas.

Este procedimiento separa fundamentalmente las partculas de acuerdo con su
masa y su forma. La fuerza centrfuga depende adems, de la velocidad y radio de giro.
El radio de giro (x) es la distancia desde el centro de rotacin hasta el extremo del
recipiente donde est contenida la muestra. El valor de la aceleracin centrfuga, en
funcin de la velocidad de giro , viene dado por la ecuacin:

4
2
( rpm )
2
G =
2
x = ------------------- x = 0,01966 (rpm)
2
x
3600

donde x es el radio de giro y rpm la velocidad en revoluciones por minuto.

El objetivo principal ser el conocimiento correcto de los conceptos bsicos sobre
centrifugacin, as como de los diferentes tipos, utilidades y aplicaciones de este
procedimiento.

1.1 Ultracentrifugacin

La ultracentrfugacin fue ideada en 1923 por el bioqumico sueco Svedberg, puede
alcanzar velocidades tan elevadas como 80.000 rpm, de modo que genera campos
centrfugos que superan 600.000 g. La ultracentrifugacin se ha convertido en una
herramienta indispensable para el aislamiento de protenas, cidos nucleicos y
partculas subcelulares.

1.1.1. Sedimentacin

La velocidad a la que una partcula sedimenta en la ultracentrfugacin est
relacionada con su masa. La fuerza, F (sedimentacin), que acta para sedimentar
una partcula de masa m, que est situada a una distancia r del centro alrededor del
cual se halla girando con velocidad angular (en rad s), es la fuerza centrfuga (m

2
w r) sobre la partcula menos la fuerza de flotacin (V r) ejercida por la disolucin:

F = m
2
r - V r

V es el volumen de la partcula y la densidad de la disolucin.

La velocidad con que sedimenta una partcula, est en relacin con su coeficiente
de sedimentacin (s). Este coeficiente es reflejo del tamao y forma de la partcula o
molcula y de l depende la velocidad con que sta sedimenta.

1.2. Ultracentrifugacin preparativa
2
3

Consiste en aislar los materiales biolgicos para ulteriores investigaciones
bioqumicas. Los rotores preparativos contienen tubos cilndricos para las muestras,
cuyos ejes pueden ser paralelos, formar un cierto ngulo o ser perpendiculares al eje
de rotacin del rotor.

La sedimentacin puede llevarse a cabo en una disolucin de una sustancia inerte,
tal como sacarosa o CsCl, en la que la concentracin y por tanto la densidad de la
disolucin, aumentan desde la superficie hasta el fondo del tubo de centrfuga. Tras la
centrifugacin se obtienen dos fracciones, el sedimento y una disolucin sobrenadante
que puede separarse por decantacin o aspiracin. La utilizacin de este tipo de
gradientes de densidad, aumenta en gran medida la capacidad de resolucin de la
ultracentrfuga. Segn las determinaciones a realizar aplicaremos el tipo de gradiente
de densidad ms conveniente:

Ultracentrifugacin de zona
Ultracentrifugacin con gradiente de densidad en equilibrio

1.3. Ultracentrifugacin con gradiente de densidad en equilibrio

Separa las partculas de acuerdo con sus densidades. Este tipo de centrifugacin
separa mezclas cuyos componentes posen un intervalo en sus densidades. No solo
permite la separacin de varios o de todos los componentes de una mezcla en una sola
vez, sino que tambin posibilita la realizacin de medidas de tipo analtico en cada uno
de ellos.

El mtodo consiste en una columna de fluido soporte cuya densidad se incrementa
hacia el fondo del tubo. El fluido se confecciona con un soluto asequible de bajo peso
molecular en un disolvente en el que las partculas de la mezcla puedan ser
suspendidas. Existen dos tcnicas basadas en este mtodo: La centrifugacin zonal y
la isopcnica.

1.3.1. Ultracentrifugacin zonal

Separa las partculas de acuerdo con sus coeficientes de sedimentacin.

La ultracentrifugacin de zona separa las macromolculas basndose ampliamente
en sus masas moleculares.

1.3.2. Ultracentrifugacin isopcnica

En esta tcnica el gradiente de densidad de la columna viene determinado por el
rango total de densidades de las partculas de la muestra. Cada partcula sedimentar
en aquella posicin del tubo de centrfuga en la que la densidad del gradiente sea igual
a su propia densidad.

Centrifugacin de una mezcla uniforme macromolecular disuelta en una disolucin
de un soluto denso que se difunde con rapidez, tal como CsCl.

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1.4. Ultracentrifugacin analtica

Difiere de la preparativa en que se utiliza fundamentalmente para el estudio de las
caractersticas de sedimentacin de macromolculas y estructuras biolgicas, de este
modo se sacan conclusiones acerca de parmetros fsico-qumicos de dichos
compuestos.

Se emplean rotores especiales. La aplicacin ms habitual en los laboratorios de
bioqumica es la determinacin de pesos moleculares de macromolculas (protenas y
cidos nucleicos fundamentalmente), utilizndose tres mtodos:

El de velocidad de sedimentacin
El de equilibrio de sedimentacin
El de la aproximacin al equilibrio de sedimentacin

1.4.1. Mtodo de velocidad de sedimentacin.

Es el ms habitual: la ultracentrfuga se hace funcionar a altas velocidades (70.000
rpm) lo que hace que las partculas del lquido emigren radialmente al disolvente,
hacia fuera del centro de rotacin, formndose as un frente de separacin muy
definido.

1.4.2. Mtodo de equilibrios de sedimentacin

La velocidad requerida es mucho menor (7.000-8.000 rpm). Cuando se establece un
equilibrio entre la sedimentacin (bajo la influencia de la fuerza centrfuga) y la difusin
del material en la direccin contraria, cesa la migracin neta. As puede calcularse el
peso molecular de un soluto a partir del gradiente producido en su concentracin,
segn:

2RT ln ( c
2
/ c
1
)
M = -----------------------------

2
(1 - vp)(r
2
2
- r
2
1
)

donde: R= constante de los gases ; T =temperatura absoluta; =velocidad angular, p
=densidad del disolvente; v =volumen especfico parcial; c
1
, c
2
=concentraciones del
soluto a las distancias r
1
, r
2
del centro de rotacin).

El excesivo tiempo necesario para conseguir el equilibrio hace que se desestime este
mtodo.

1.4.3. Mtodo de aproximacin al equilibrio de sedimentacin.

Al comienzo del proceso, la macromolcula est distribuida por toda la clula de
manera homognea. Al ponerse en marcha la centrfuga, hay un descenso en la
densidad de la disolucin en el menisco al alejarse las molculas de l. En el descenso
influye el peso molecular del compuesto, por lo que este parmetro puede calcularse de
los valores del descenso de la densidad. El clculo resulta complejo por el gran
nmero de variables experimentales que es preciso controlar.
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2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO

Centrifuga de alta velocidad (8.000 12.000 rpm)
Plastilina
Tubos capilares de 75 mm de largo y 2 mm de dimetro interior y heparina
desecada
Lector de hematocrito


3. PROTOCOLO A REALIZAR.

Adquirir muestra sangunea capilar del pulpejo del dedo o del taln con el
tubo capilar hasta 1-2 cm del final
Taponar parte seca del tubo con plastilina
Colocar en el plato de la centrfuga
Centrifugar entre 3 y 5 min
Leer la altura del plasma y de los paquetes de hemates (en la misma
centrfuga si la posee o en escala aparte)

El ndice hematocrito es el volumen que ocupan las diferentes porciones que se
forman al centrifugar un tubo de sangre previamente hecha incoagulable por la adicin
de oxalato potsico o citrato sdico. La parte corpuscular por ser ms densa queda en
el fondo del tubo, mientras que sobrenada la fraccin plasmtica. La cantidad y
proporcin relativa de cada una de estas partes se denomina valor o ndice
hematocrito.

La medicin del valor hematocrito se fundamenta en la simple centrifugacin de una
muestra de sangre incoagulable colocada en un tubo especial (tubo hematocrito) que
lleva una escala de diez divisiones y que, tras la centrifugacin, permite medir la altura
del volumen que ocupan los glbulos en el fondo del tubo y la del plasma que
sobrenada.

Los tubos utilizados tienen distintas formas y tamaos, segn los autores que los
idearon (Hedin, Hamburger, Westergren, Wintrobe, etc.). Los que son capilares
permiten recoger la sangre por puncin digital.


4. RESULTADOS

Los resultados obtenidos debern encontrarse en caso de sujetos sanos entre los
siguientes rangos segn sexo:

Varn: 40,7 50,3%
Mujer: 36,1 44,3%

A partir del ndice hematocrito se puede deducir la cifra de hemates. Si los hemates
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son de forma, tamao y contenido en hemoglobina normal o poco alterada, la relacin
entre nmero de hemates (Heme) e ndice hematocrito (Ht) es una constante, es
decir:

Ht K = Heme

o sea, que el porcentaje del paquete hematolgico multiplicado por una constante nos
proporciona el nmero de hemates por milmetro cbico. Capdevila ha evaluado esta
constante en 110.000; as, si suponemos que el valor hematocrito de un paciente es de
40 por 100 (paquete de hemates), si se multiplica por 110.000 da 4.400.000, que
representa el n de hemates por milmetro cbico.


5. DISCUSIN

El hematocrito es la cantidad y proporcin relativa entre los glbulos y el plasma
sanguneo. Si bien este parmetro debe ser visto a la luz del resto de los parmetros
presentes en la bioqumica sangunea y en la hematimetra junto con la sintomatologa
del paciente, por si slo puede ser ya indicativo de variaciones en las caractersticas
sanguneas. Su aumento puede indicar una reduccin en el nmero de hemates
(anemia) y su aumento la situacin opuesta (policitemia).


6. BIBLIOGRAFA RECOMENDADA

Galindo J (1988): Centrifugacin. En Lozano J A, Tudelo J (eds): Prcticas de
Bioqumica. Experimentacin y Simulacin, 1 ed. Editorial Sntesis (Madrid,
Espaa), pp. 17 24.
Gonzlez de Buitrago J M (1985): Citometra hemtica y otras tcnicas hematolgicas.
En Gonzlez de Buitrago J M (ed): Tcnicas de Laboratorio Clnico, 1 ed. Editorial
Alhambra (Madrid, Espaa), pp. 36 51.
Govantes J , de Lorenzo P, Martn J J , Martn J (1990): Sangre-Hematopoyesis. En:
Manual Morton, 6 ed. Editorial Laboratorios Morton (Madrid, Espaa), pp. 31 35.
Stroev EA, Makarova VG (1989): Introduction to laboratory manual in biochemistry. En
Stroev EZ, Makarova VG (eds): Laboratory Manual in Biochemistry, 1 ed. Editorial
MIR Publishers Moscow (Mosc, Rusia), pp. 15 30.