PRACTICA N 14

DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS. Determinacin cuantitativa de azcares reductores y totales (Mtodo de Lane y Eynon) y fibra cruda I. INTRODUCCIN. Entre los distintos componentes de los alimentos, despus del agua, los carbohidratos son las sustancias ms abundantes y ms ampliamente distribuidas en la naturaleza; siendo la celulosa la biomolcula que se encuentra en mayor cantidad en la biosfera, y el almidn, la fuente energtica alimentaria ms empleada en el mundo. En todos los seres vivos se encuentran presentes los carbohidratos ya que la ribosa y la desoxirribosa son parte de su material gentico. De la misma forma, en las frutas y hortalizas los carbohidratos cumplen funciones estructurales y energticas, constituyendo algunos la estructura rgida o mecnica de los tejidos vegetales; en tanto que en las semillas, races y tubrculos funcionan bsicamente como reservas energticas. Por otro lado, en algunos animales estos compuestos son parte de sus reservas energticas (glucgeno) o constituyen un componente esencial de su estructura externa (quitina). Adems de ser componentes naturales de muchos alimentos, la industria alimentaria emplea los carbohidratos en funcin de sus propiedades funcionales, usndolos como ingredientes para mejorar la aceptabilidad, palatabilidad y vida til de diversos alimentos. Desde el punto de vista qumico, los carbohidratos pueden definirse como polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas y sus derivados. Segn la anterior definicin, la denominacin de carbohidrato agrupa a una gran cantidad de compuestos. En la naturaleza se encuentran carbohidratos de diferente nmero de carbonos y distintos grupos funcionales o susbstituyentes. Esto da origen a distintos tipos de azcares, tales como las aldosas, cetosas, azcares acetilados, benzoesterificados y metilados, azcares cidos, glicsidos y

anhidroazcares. De la misma forma, las molculas de carbohidrato pueden incluir desde un solo monosacrido hasta varios miles de estos. Debido a lo expuesto anteriormente, la diversidad de sus orgenes y la gran variabilidad en su composicin qumica, han surgido una variedad enorme de mtodos de anlisis de carbohidratos; ya sean dichos mtodos: fsicos, qumicos o bioqumicos. Entre los mtodos cualitativos basados en las propiedades fsicas de los carbohidratos estn las cromatografas en papel y capa fina, la cromatografa gas-lquido, la de intercambio inico, la electroforesis, la refractometra, la hidrometra, la polarimetra y la espectroscopia de rayos infrarrojos. Por otro lado, entre los mtodos qumicos estn los basados en reacciones que dan origen a compuestos coloreados, tales como las que se dan despus de tratar los monosacridos con cido mineral fuerte y hacer reaccionar el furfural o hidroxifurfural formado, con compuestos orgnicos tales como fenoles, aminas aromticas, urea y antrona. De la misma forma, tambin se hace uso de su capacidad reductora, hacindolos reaccionar con sales de metales como el cobre, hierro, yodo, plata y cerio. Por ltimo, tambin es posible su anlisis basndose en la capacidad de formar complejos coloreados con el yodo, tal como sucede con el almidn. En relacin con los mtodos bioqumicos de anlisis de carbohidratos, estos pueden ser microbiolgicos o emzimticos. Los primeros se basan en la capacidad de ciertas cepas de lavaduras de fermentar especficamente algunos grupos de azcares; dichas levaduras son especialmente tiles a la hora de diferenciar entre pentosas y hexosas, incluyendo los polmeros de ambas. Con respecto a los mtodos enzimticos, estos incluyen los anlisis de monosacridos, oligosacridos y polisacridos. En el caso de los dos ltimos, el anlisis incluye la hidrlisis enzimtica de los enlaces glicosdicos.

II. Determinacin cuantitativa de azcares reductores y totales (mtodo de Lane y Eynon). Existen diversos mtodos de cuantificacin de carbohidratos basados en la capacidad reductora de los azcares que tienen libre el grupo carbonilo. Estos carbohidratos son capaces de reducir elementos como el cobre (Cu+2), el hierro (Fe+3) o el yodo (I0). En el caso especfico del cobre, este es reducido desde Cu+2 a Cu+1. En este sentido, en el mtodo de Lane y Eynon (1923) se hace reaccionar sulfato cprico con azcar reductor en medio alcalino, formndose oxido cuproso, el cual forma un precipitado rojo ladrillo. Este mtodo utiliza azul de metileno como indicador, el cual es decolorado una vez que todo el cobre ha sido reducido, lo que indica el fin de la titulacin. A. Reactivos: 1. Solucin de Fehling A (34,639 g de CuSO45H2O en 500 ml de agua) 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Solucin de Fehling B (173 g de tartrato de sodio y potasio, y Azul de metileno (1%) Solucin patrn de glucosa al 1% Solucin diluida de glucosa (50 mg/ml), preparada a partir de Solucin de acetato bsico de plomo al 30% Oxalato de sodio o potasio en polvo Solucin de HCl 1:1 Solucin de NaOH 6 N. NaOH en 500 ml de agua)

la solucin patrn de glucosa (1%)

B. Procedimiento: A.- Estandarizacin de la solucin de Fehling: Colocar la solucin diluida de glucosa en una bureta. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solucin de Fehling A y 5 ml de solucin de Fehling B. Aadir 2 o 3 gotas de solucin de azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de vidrio.

Llevar a ebullicin la solucin de Fehling y agregar lentamente la solucin de glucosa sin dejar de calentar, hasta que desaparezca la coloracin azul. En el momento en que desaparece el color del indicador, en los bordes del fondo de la fiola se puede observar cierto tono rojizo. Nota: durante todo el tiempo en que se aade la solucin de glucosa, la solucin de Fehling debe mantenerse en ebullicin.

B.- Preparacin de la solucin clarificada de azcares: Pesar una cantidad de muestra tal que en la solucin final clarificada, la concentracin de azcares reductores sea de 2 a 5 mg/ml (para gastar entre 10 y 25 ml de dicha solucin por cada 10 ml de solucin de Fehling). Homogeneizar la muestra con 50 ml de etanol al 80% (v/v) y traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 250 ml; aforar con etanol (80%), mezclar bien y filtrar. Tomar una alcuota de 25 ml de la solucin filtrada y colocarla en una matraz aforado de 250 ml. Diluir con 50 ml de agua destilada y aadir unos pocos mililitros de solucin de acetato de plomo (30%), hasta lograr la precipitacin completa (en el caso de jugos, pulpas y mermeladas de frutas es suficiente aadir 1 o 2 gotas de la solucin de acetato de plomo al 30%). Mezclar bien y filtrar. Agregar al filtrado oxalato en polvo en pequeas porciones (una cantidad muy pequea tomada con la punta de una esptula para evitar el profusin de oxalato) hasta eliminar el exceso de acetato de plomo. Mezclar y filtrar descartando los primeros mililitros. El filtrado debe quedar perfectamente transparente.

C.- Determinacin de azcares reductores (originalmente presentes): Tomar una alcuota de 25 ml, colocarla en un matraz aforado de 100 ml, aforar con agua, mezclar bien y colocar la solucin en una bureta. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solucin de Fehling A y 5 ml de solucin de Fehling B. Aadir 2 o 3 gotas de solucin de azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de vidrio. Llevar a ebullicin la solucin de

Fehling y proceder igual a como se hizo durante la estandarizacin de la solucin de Fehling.

D.- Determinacin de azcares totales: En un vaso de precipitados de 100 ml, colocar una alcuota de 25 ml de solucin clarificada. Agregar 5 ml de solucin de HCl (1:1) y calentar a 70 C durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente y con ayuda de un potencimetro llevar a pH 8,2 utilizando una solucin 6N de NaOH (en caso de no disponer de un potencimetro, aadir 2 o 3 gotas de fenolftalena y titular lentamente con la solucin de hidrxido de sodio hasta el cambio de viraje del indicador, luego aadir lentamente, gota a gota HCl (1:1) hasta la desaparicin del color rosado). Una vez alcanzado el pH indicado, pasar la solucin cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, aforar con agua, mezclar bien y colocar la solucin en una bureta. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solucin de Fehling A y 5 ml de solucin de Fehling B. Aadir 2 o 3 gotas de solucin de azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de vidrio. Llevar a ebullicin la solucin de Fehling y proceder igual a como se hizo durante la estandarizacin de la solucin de Fehling. Nota: los azcares no reductores son calculados restando al contenido de azcares totales, el contenido de azcares reductores. Para convertir este valor en contenido de sacarosa, se debe considerar la suma de los pesos moleculares de la glucosa y la fructosa (360 g/mol) y el de la sacarosa (342 g/mol).

ESQUEMA DE DETERMINACIN DE AZUCARES EN MERMELADA.

2.- Determinacin de fibra cruda. La fibra cruda est constituida por los carbohidratos presentes en los alimentos que no son digeridos por las enzimas de los animales. Metodolgicamente, sta es el residuo orgnico insoluble resistente a la hidrlisis cida (H2SO4 al 1,25%) y bsica (NaOH al 1,25%). El residuo obtenido de esta forma contiene minerales y una mezcla de materiales componentes de la pared celular de los vegetales que no corresponde a ningn compuesto especfico; correspondiendo aproximadamente el 97% de tales compuestos a celulosa y lignina.

A pesar de que con el anlisis de fibra cruda se pretende cuantificar carbohidratos componentes de la pared celular de los vegetales, segn el alimento analizado, durante la determinacin se pierde entre el 20 y el 60% de la celulosa original presente y entre el 33 y el 96% de la lignina. Reactivos:
1.- Solucin de cido sulfrico al 1,25% 2.- Solucin de hidrxido de sodio al 1,25% 3.- Etanol al 95%

Procedimiento: Pesar aproximadamente 2 g de muestra (en el caso de muestras que no estn secas utilizar un vidrio de reloj para pesar la muestra). Transferir cuantitativamente la muestra al vaso de precipitados especial del equipo de extraccin y aadir algunas perlas de vidrio. Agregar 200 ml de la solucin de H2SO4 (1,25%) hirviente, conectar el vaso de precipitados al condensador de reflujos y mantener la muestra en ebullicin durante 30 minutos exactamente. Durante la ebullicin, el contenido del vaso de precipitados debe mantenerse perfectamente mezclado. Transcurridos los 30 minutos, retirar el vaso de precipitados del condensador y filtrar la solucin a travs de un embudo de porcelana con lana de vidrio como material filtrante. Una vez filtrada la solucin, lavar el residuo del embudo con agua hirviente, haciendo pasar el agua a travs del vaso de precipitados. Se debe lavar el contenido del filtro hasta que el agua salga a pH neutro. Transferir cuantitativamente el residuo del embudo al vaso de precipitados (incluyendo la lana de vidrio) y agregar 200 ml de la solucin de NaOH (1,25%) hirviente. Luego conectar el vaso de precipitados al condensador de reflujos y proceder de igual manera a como se hizo durante la digestin cida. Despus de los 30 minutos de digestin alcalina, retirar el vaso de precipitados del condensador y filtrar de igual forma que en la digestin cida, lavando con agua hirviente hasta que el agua salga a pH neutro.

Lavar el residuo con etanol (95%) y transferir totalmente su contenido a una cpsula de porcelana. Colocar la cpsula de porcelana en una estufa a 100 C hasta llegar a peso constante. Una vez esto, pasar la cpsula a un desecador y pesarla cuando se encuentre a temperatura ambiente. Poner la cpsula de porcelana en una mufla y mantener a 600 C hasta la destruccin total de toda la materia orgnica. Una vez destruida la materia orgnica, colocar la cpsula en un desecador y pesar al alcanzar la temperatura ambiente. Nota: el contenido de fibra cruda en el peso de muestra corresponde a la prdida de peso despus de la incineracin.