Mecanismos de Oxidacin Bacterial de Minerales Sulfurados

MSc Juan Carlos Crdenas. Research & Development Department Kop-Coat. Inc. New Jersey, USA. jumakage@sbcglobal.net Biol. Jos J. Guerrero Rojas. Consultor en Biominera, Per esojgue@hotmail.com MSc Gabriel Zrate C. Vicepresidencia Metalurgia Anglo American Chile, Santiago, Chile gzarate@anglochile.cl
RESUMEN

En el presente trabajo se revisa el estado actual de los mecanismos de oxidacin bacterial de minerales sulfurados, presentando los fundamentos de los modelos de biolixiviacin hasta ahora propuestos e integrando los estudios del comportamiento qumico y electro-qumico y el papel de los microorganismos en la interfase solucin-mineral. En este trabajo se aborda tambin los recientes adelantos en aspectos bsicos como los parmetros qumicos y electroqumicos del proceso, adems de la importancia de las sustancias polimricas extracelulares (EPS), excretadas por las bacterias durante su adhesin al mineral, y la funcin que cumple el Fe3+ atrapado en estos EPS. ABSTRACT This bibliographic review summarizes the state of art on the subject through the fundamentals of bioleaching models, which integrate both the chemical and electrochemical behavior and the role played by microorganisms at the solution-mineral interface. Other important aspects included in this paper are the latest findings on chemical and electrochemical parameters of the process, the importance of extra cellular polymeric substances (EPS) excreted by leach bacteria during its adherence to mineral particles, and the function

played by the ferric iron trapped within this layer of EPS. INTRODUCCION La lixiviacin bacterial de sulfuros metlicos se ha desarrollado rpidamente en el curso de la ltima dcada. La recuperacin de metales pesados por la aplicacin de microorganismos es ahora una tcnica biotecnolgica establecida. La movilizacin de cationes metlicos desde minerales insolubles por oxidacin biolgica y procesos de complejacin es referida a la biolixiviacin. Los metales en los cuales esta tcnica es empleada son: cobre, cobalto, nquel, zinc y uranio. Estos metales son extraidos desde sus sulfuros insolubles o como el caso del uranio desde sus xidos. Sin embargo, para la recuperacin de oro y plata, la lixiviacin bacterial es aplicada solamente para remover sulfuros metlicos interferentes desde los minerales que contienen los metales preciosos, anterior al tratamiento por cianuracin24. Aqu, el trmino biooxidacion, debera preferentemente ser usado, porque, los metales biolixiviados en muchos casos, hierro y arsnico, no son recuperados. Un trmino general que cubre las tcnicas de biolixiviacin y biooxidacin podra ser biomining (Bosecker 1997; Ehrlich 2002; Olson et al. 2003; Rawlings 1997, 2002; Rohwerder et al. 2002). La emergente posibilidad de desarrollo

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en el campo de la biologa molecular, anlisis qumico y ciencia superficial (nanobiotecnologa) ha contribuido a mejorar el entendimiento de este bioproceso. La biologa de bacterias lixiviantes se ha vuelto ms y ms compleja, debido al incremento en la data sobre la secuencia gentica 16S rDNA. Muchas nuevas especies de bacterias lixiviantes han sido descritas y especies conocidas han sido reclasificadas. Mientras previamente solo las bacterias mesoflicas fueron consideradas importantes, hoy en dia, una nueva generacin de bacterias termfilas moderadas y termfilas extremas se ha convertido en atractivas para usar en biolixiviacin. Esto da como consecuencia el hecho que procesos industriales, como estanques agitados, sufren de altos costos operativos causados por el enfriamiento en procesos usando bacterias mesoflicas, a causa de su baja temperatura de supervivencia. Hoy, el uso de bacterias termfilas pueden ayudar a realizar este proceso ms econmico23. En lo que respecta a ARD y AMD, drenajes de roca y mina cida, han incrementado su inters. Compaas mineras responsables, agencias estatales y leyes ambientales ms estrictas se aliaron para luchar en contra de ARD y AMD. La reduccin de su impacto sobre el ambiente podr ser disminuido, solamente si entendemos las bases del proceso. Consecuentemente, los fundamentos bioqumicos de las reacciones de lixiviacin han sido el tema de investigacin intensiva en tiempos recientes. En este contexto, la qumica del azufre detrs de los mecanismos de lixiviacin ha sido aclarada (Schippers and Sand 1999; Schippers et al. 1996). La biolixiviacin de sulfuros metlicos y la generacin de drenaje de agua de mina son algunos de los procesos que resultan de la interaccin mineral-bacteria. Un mayor conocimiento de los mecanismos de oxidacin bacterial de minerales sulfurados puede mejorar significativamente el diseo y la operacin de plantas de lixiviacin bacteriana y puede asistir en la prevencin del drenaje de agua mina1. Los sulfuros presentan unas caractersticas adecuadas para la extraccin de los metales que contienen por mtodos pirometalrgicos, ya que son fcilmente concentrables y el azufre suministra parte de la energa necesaria para la obtencin del metal. Sin embargo, estos procesos son altamente contaminantes, por las emisiones de SO2 que producen, contribuyendo al problema de la lluvia cida. Como consecuencia de la poltica medioambiental existente y de la necesidad de reducir los elevados costos de inversin y de operacin que conllevan estos procesos, surgieron los procesos hidrometalrgicos como una alternativa novedosa. No obstante, estos ltimos tambin presentan

desventajas que han incidido negativamente en el desarrollo e implantacin de estos procesos a escala indutrial, como son el elevado consumo de reactivos lixiviantes, las altas presiones y temperaturas que a menudo se requieren y los mayores costos de operacin de la molienda fina. Por estas razones, en las ltimas dcadas ha surgido la Biohidrometalurgia y, dentro de sta, la Biolixiviacin, como un tratamiento alternativo prometedor para la obtencin de metales a partir de sulfuros metlicos. El proceso de Biolixiviacin se produce por la catlisis que los microorganismos ejercen durante la disolucin de algunas menas minerales. El microorganismo se sirve del mineral como combustible, utilizando la transferencia de electrones para sus propios propsitos de supervivencia y liberando metales, sin requerir una aplicacin externa de energa. En este tipo de proceso no son necesarias altas energas de activacin; una prueba de ello es que las reacciones ocurren a baja presin y baja temperatura. Siempre ha existido, y todava hoy existe, una gran controversia en cuanto al verdadero papel jugado por los microorganismos en la biolixiviacin. De la revisin de diversas publicaciones sobre este tema se pueden deducir importantes concordancias en algunos aspectos referentes a este fenmeno, pero sin embargo no se ha llegado a un acuerdo total y todava no existe una teora unnimemente aceptada. Sin embargo, citaremos a Ehrlich2: Aunque en el laboratorio es possible demostrar un exclusivo mecanismo directo de biolixiviacin por T. ferrooxidans de ciertos sulfuros metlicos noferrosos usando minerals libres de hierro y un medio de cultivo libre de hierro, en condiciones naturales esto nunca ocurre, porque los sulfuros metlicos no-ferrosos estn siempre acompaados por pirita en los depsitos minerales. De este modo, en ambientes naturales la oxidacin directa y oxidacin indirecta usualmente ocurren juntas. En cuanto a la biolixiviacin de sulfuros minerales, es bien sabido que la base de estos procesos la constituye la movilizacin de los constituyentes metlicos y que esta accin se realiza a travs de la oxidacin promovida por microorganismos. Pero, a travs de qu mecanismos la bacteria realiza dicha oxidacin? Muchos investigadores han dedicado aos de trabajo en busca de respuestas a esta cuestin fundamental. El primer intento de explicacin del posible mecanismo de biolixiviacin fue realizado por Silverman y Ehrlich3, quienes en 1964, plantearon dos vas posibles: la directa y la indirecta (Fig. 1). Como es sabido, la biolixiviacin de minerales sulfurados es causada por diversos grupos de microorganismos. Hoy, al menos 11 divisiones pueden ser relacionadas a este

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fenmeno. Los microorganismos predominantes

que disuelven sulfuros metlicos son bacterias

Figura 1: Biolixiviacin de Esfalerita25 extremadamente acidoflicas (significa, organismos que se desarrollan a valores de pH bajo 3) que son capaces de oxidar compuestos de azufre inorgnicos y/o iones Fe2+. La bacteria de lixiviacin clsica, conocida anteriormente como Thiobacillus, est ahora bajo el gnero Acidithiobacillus. En este grupo estn las primeras bacterias oxidantes aisladas de azufre y/o Fe2+ extremadamente acidoflicas, las mesoflicas At. Thiooxidans y At. Ferrooxidans. Juntas con las moderadamente termoflicas At. Caldus, estas bacterias lixiviantes pertenecen al grupo Grannegativos y proteobacterias. Otras proteobacterias lixiviantes son especies del gnero Acidifilium tales como, Ac. Acidofilum, mientras miembros del gnero Leptospirillum estn bajo una nueva divisin bacterial. Bacterias lixiviantes Gran-positivos son miembros moderadamente termoflicos del gnero Acidimicrobio, Ferromicrobio y Sulfobacilo. Archaebacteria lixiviante han sido conocidas por muchos aos por pertenecer a los Sulfolobolos, un grupo de termofilas extremas, oxidantes del azufre y Fe2+, los cuales incluyen el gnero Sulfolobus, Acidianus, Metallosfera y Sulfurisfaera. Sorprendentemente Archaebacteria mesoflica y acidoflica oxidante de Fe2+ han sido tambin descubiertas recientemente. Aquellas estn bajo el gnero Thermoplasmales, y dos especies, Ferroplasma acidifilum y F. acidarmanus, son conocidas. Aunque estas bacterias son especies con un espectro substrato extremadamente limitado. En particular, L. ferrooxidans y L. ferrifilum pueden crecer solamente oxidando iones Fe2+ 3 aerobicamente . MECANISMO DIRECTO Acorde al concepto de oxidacin directa de sulfuros metlicos susceptibles, como fue definido por Silverman y Ehrlich4, la red cristalina de tales sulfuros es atacada a travs de oxidacin enzimtica. Para fortalecer esta definicin, los microbios tienen que estar en ntimo contacto con el mineral que ellos atacan. Evidencia de rpido contacto de T. ferrooxidans a la superficie mineral de partculas de calcopirita han sido presentados por McGoran et al. (1969) y Shrihari et al. (1991); para partculas de covelita por Pogliani et al. (1990); para cristales de galena por Tributsch (1976); para cristales de pirita por Bennett y Tributsch (1978), Rodriguez-Leiva y Tributsch (1988), Mustin et al. (1992), Murthy and Natarajan (1992), y Edwards et al. (1998); y para minerales aurferos conteniendo pirita-arsenopirita por Snyman (1988). Ehrlich2, propone que la disociacin espontnea de algn mineral para entregar o ceder especies inicas oxidables en solucin donde T. ferrooxidans puede atacarlos, es tan pequea para el caso de minerales que son muy insolubles en solucin cida. Por ejemplo, covelita CuS, en donde el solo consituyente oxidable es el sulfuro, tiene una constante de solubilidad de 1044.07. Thiobacillus ferrooxidans es capaz de oxidar este mineral a pH igual a 2. Simples clculos muestran que en equilibrio a pH igual a 2, la disociacion de CuS generar solamente una concentracin de HSigual a 10-15.53 M y una concentracin de H2S igual a 10-13.06 M. Esto es insuficiente para la oxidacin del sulfuro por T. ferrooxidans porque el ms reciente valor de Ks para sulfuro oxidado en clulas de este organismo ha sido reportado ser 10-5.30 M (Pronk et al., 1990). Los valores de Ks son una medida de la concentracin de sustrato en donde una reaccin

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catalizada por clulas intactas es 50% mximo (Cintica de Michaelis-Menten). Desde este punto de vista, la disociacin de CuS hacia Cu2+, HS-, y H2S no puede suministrar casi suficiente sustrato sulfuro para sustentar su oxidacin por T. ferrooxidans a una razonable velocidad, no obstante que HS- o H2S o ambos son los actuales sustratos para el sulfuro oxidado. A causa que T. ferrooxidans puede oxidar covelita en la ausencia de hierro adicional, la bacteria debe estar en contacto directo con el mineral para atacarlo. La necesidad del contacto directo en la oxidacin de covelita por T. ferrooxidans en la ausencia de Fe2+ adicional fue demostrada experimentalmente por Pogliani et al. (1990). Por contraste T. thiooxidans fue mostrado por Donati et al. (1995) para promover la oxidacin de covelita solamente con la adicin al medio de Fe3+ o Fe2+ autooxidado a Fe3+. La oxidacin de covelita por Fe3+ gener So y otras cantidades de especies sulfuradas disueltas y reducidas como fue descrito por Sullivan (1930). Por otro lado, Ehrlich2 propone considerar un mineral sulfuro mas soluble tal como ZnS, que tiene una constante de solubilidad de 10-22.9. Clculos similares a aquellos para la covelita muestran que a pH igual a 2, la disociacin de ZnS ceder 10-4.95 M HS- y 10-1.47 M H2S. Aquellas concentraciones de HS- y H2S son ms que suficientes para satisfacer el Ks de 10-5.30 para sulfuro oxidado en T. ferrooxidans y para permitir su crecimiento sin ataque directo en la superficie del mineral. Asimismo, ha sido mostrado que T. Thiooxidans, que son incapaces de oxidar Fe2+, promover rpidamente la disolucin de ZnS a pH igual a 2 (Pistorio et al 1994). La relativa solubilidad de PbS en solucin cida, tambin explica el porque Garca et al, (1995), encontr que T. thiooxidans promovi la disolucin de PbS (galena). La constante de solubilidad de este sulfuro metlico es 10-27.5, un poco menor que ZnS, pero significativamente mayor que la de CuS. A pH igual a 2, se disocia para entregar 10-7.25 M HS- y 10-4.77 M H2S. Segn este mecanismo, la bacteria ataca al sulfuro metlico de forma directa mediante su adherencia a la superficie mineral y la posterior oxidacin enzimtica de ste por transporte de electrones desde la parte reducida del mineral, generalmente el sulfuro, al oxgeno disuelto.
Bacteria

MS + 5/2O2 + 2H+ > M2+ + SO42- + H2O (1) La adherencia de bacterias al mineral es, por tanto, necesaria para la biolixiviacin de minerales a travs del mecanismo directo y es la principal evidencia presentada en la defensa del mismo. Esta teora se ha apoyado en diversos

estudios experimentales que demuestran la capacidad de aPgina 4 de 11dhesin que presentan las bacterias biolixiviantes a las superficies de los minerales. En este sentido, Berry y Murr5 encontraron pruebas de que los Acidithiobacilli secretaban algunas sustancias que podran ayudar al ataque, pero la naturaleza de estas sustancias era desconocida. Bennett y Tributsch6, observaron, al microscopio electrnico de barrido (SEM), cristales de pirita expuestos a la accin de A. ferrooxidans: detectaron huellas de corrosin en los cristales y sugirieron que stas eran causadas por un agente bacteriano, un metabolito que podra actuar por tres medios: por oxidacin de Fe2+ a Fe3+, por solubilizacin del azufre molecular de las superficies del cristal o por ataque directo. Tambin comprobaron que A. ferrooxidans tena la capacidad de discernir las regiones ms favorables de la superficie mineral para obtener su fuente de energa y seleccionar el sitio de ataque en funcin de la disponibilidad del nutriente. Hansford y Drossou7 demostraron, tambin mediante SEM, la formacin de agujeros en la superficie de una esfalerita oxidada por bacterias y concluyeron que estos haban sido producidos mediante el ataque directo de las clulas al mineral. Al mismo tiempo, Mathews8 and Warren9, observaron el mismo efecto, pero durante la oxidacin qumica de los minerales. Estas observaciones, junto con las realizadas por McKibben y Barnes10 mediante el estudio de la superficie de una pirita, antes y despus de ser sometida a oxidacin, derrumbaron los argumentos de quienes defendan el ataque directo, ya que observaron que las hendiduras y fracturas formadas durante el proceso eran heredadas del historial de crecimiento del propio mineral y de los procedimientos de preparacin superficial previamente aplicados a ste. Estos lugares son qumicamente ms reactivos al tener una energa superficial ms elevada y, por ello, se atacaban preferentemente. Tambin existen dudas sobre la veracidad del ataque directo en cuanto a que el mecanismo enzimtico por el cual ocurre no ha sido, an, absolutamente esclarecido. Lundgren y Tano11 afirmaron que la envoltura celular contena las enzimas necesarias para lograr catalizar la oxidacin de sulfuros, pero Tributsch y Bennett12, basndose en clculos energticos, descartaron esta teora y afirmaron que para sulfuros como ZnS y CdS, la transferencia directa de electrones desde la banda de valencia del sulfuro metlico al sistema metablico de la bacteria no era possible. MECANISMO INDIRECTO El mecanismo indirecto de lixiviacin microbiolgica tiene lugar por la interaccin del

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mineral con productos intermedios o finales del metabolismo de las bacterias, no habiendo por tanto reacciones enzimticas que actuen directamente sobre el sulfuro, y el agente de lixiviacin, el Fe3+, es regenerado por el microorganismo segn las siguientes reacciones1. MS + 2Fe3+ > M2+ + 2Fe2+ + S0
Bacteria

biolixiviacin que permita aclarar todas estas cuestiones. PROGRESOS EN BIOLIXIVIACION: MODELO DE SAND - SCHIPPERS Una de las primeras dudas acerca de los mecanismos existentes (mecanismo directo e indirecto) surgi de un estudio sobre diversidad microbiana, realizado por Schippers14, en pilas de residuos de una mina de uranio. En estas pilas se encontr que la inmensa mayora de la poblacin bacteriana estaba constituida por bacterias acidfilas moderadas del gnero Acidithiobacillus como A. intermedius y A. neapolitanus, mientras que A. ferrooxidans estaban en una proporcin muy baja, aproximadamente de 100 a 1. Dado que el concentrado de uranio analizado solo posea pirita como fuente nutriente, no se explica como los microorganismos azufreoxidantes podan ser mayora, ms an sabiendo que stos son incapaces de utilizar esta fuente energtica y que la pequea proporcin de A. ferrooxidans era insuficiente para abastecer a los acidithiobacilli de sustrato (azufre). Estas observaciones se contradicen con el mecanismo indirecto de biolixiviacin, que indica que los nicos intermediarios posibles durante el proceso son el azufre elemental y el ion ferroso. Por otro lado, Rodrguez-Leiva y Tributsch15 encontraron que exista una capa de sustancias orgnicas, llamada EPS, exopolmero extracelular, entre la bacteria y la superficie mineral. Arredondo16, Gehrke17 et al. observaron que el exopolmero que rodeaba a las clulas de A. ferrooxidans y L ferrooxidans adheridas a la superficie mineral estaba fuertemente impregnado con Fe3+ ion frrico hexahidratado y grnulos de politionato incorporados en forma de grnulos de azufre coloidal. Estas observaciones, junto con el estudio realizado por Goldhaber, Luther, llevaron a Sand, Schippers18 et al. (Fig. 2) a plantear un nuevo mecanismo para la biolixiviacin de la pirita. La disolucin bioqumica de los sulfuros metlicos sigue solamente dos rutas o caminos, las que estn determinadas por la solubilidad cida de los sulfuros: mecanismo de biolixiviacin va tiosulfato y mecanismo de biolixiviacion va polisulfuro y azufre. La clula bacterial puede efectuar la disolucin del sulfuro por mecanismo de contacto y mecanismo de no-contacto. En estricto sentido, esto concuerda con el mecanismo indirecto mencionado previamente (Sand et al. 1995). El mecanismo de contacto asume que muchas clulas estn adheridas a la superficie del sulfuro metlico. El mecanismo no-contacto asume que la bacteria oxida solamente iones disueltos Fe2+ a iones Fe3+. Este ltimo puede luego atacar el sulfuro metlico y ser reducido a iones Fe2+.

(2)

2Fe2+ + 1/2O2 + 2H+ > 2Fe3+ + H2O

(3)

A su vez, el azufre elemental, que se forma en el proceso mediante la reaccion (2), es oxidado a cido sulfrico por la misma bacteria. Esta produccin de cido disminuye el pH durante la lixiviacin y acelera el proceso, mejorando, adems, las condiciones ambientales de vida de las bacterias, su adherencia al mineral y minimizando la precipitacin de jarositas que constituyen una barrera difusional entre el sulfuro y el Fe3+ 13.
Bacteria

2S0 + 3O2 + 2H2O

> 2H2SO4

(4)

Habra que hacer notar que bajo determinadas condiciones, la reaccin (3) podra determinar el cambio de valor del pH en el proceso de disolucin de los metales. Las jarositas se forman debido a que la oxidacin bacteriana de Fe2+ a Fe3+ consume protones aumentando asi el pH, y esto, sumado a una alta concentracin de hierro y/o sulfatos en disolucin, produce la precipitacin del hierro segn la siguiente reaccin: 3Fe3+ + X+ + 2H2SO4 + 6 H2O > XFe3(SO4)2(OH)6 + 10 H+ (5) Donde X es un catin monovalente como K+, H+ y NH4+, presente en las sales que componen los medios nutrientes bacterianos. El mecanismo de lixiviacin indirecto es la base de los procesos extractivos de biolixiviacin que se estn empleando a gran escala, desde hace aos, para la obtencin de uranio y cobre, principalmente. Ha sido ampliamente aceptado por su mejor explicacin del proceso de biolixiviacin, pero tambin deja algunas lagunas, como el hecho de que, en ausencia de Fe3+ y en presencia de bacterias, se observe la disolucion de sulfuros libres de hierro o de que, algunas bacterias se encuentran adheridas al mineral o porque, en estudios de poblacin celular en la biolixiviacin del uranio las bacterias predominantes son azufreoxidantes y no bacterias ferrooxidantes. Por todas estas razones, an siguen las investigaciones en la bsqueda de un modelo de

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En general, la disolucin es alcanzada por una combinacin del ataque de protones y el proceso de oxidacin. La va o camino de reaccin es determinada por la especie mineral (Schippers and Sand 1999; Sand et al. 2001). Sin embargo, la estructura cristalina (es decir, estructura monosulfuro o estructura disulfuro) no controla la va de disolucin. La reactividad del sulfuro metlico con los protones (solubilidad cida) es el criterio relevante. Esta ltima propiedad es determinada por la configuracin electrnica (Schippers and Sand 1999). El sulfuro metlico con bandas de valencia que son derivadas solamente desde los orbitales de los tomos metlicos no puede ser atacado por protones (sulfuro metlico insoluble en cido). Por el contrario, sulfuro metlico con bandas de valencia desde el orbital metlico y orbital sulfuro, son ms o menos solubles en cido (sulfuro metlico soluble en cido).

Figura 2. Modelo Mecanismo de Lixiviacion de Contacto de At. Ferrooxidans. A Vision general, mostrando la clula bacterial fijada en su EPS adherido a la pirita via interaccin electrosttica. CM membrana citoplasmtica, PS espacio periplasmtico, OM membrana exterior. B Detalles del transporte de electrones desde la pirita al oxgeno molecular. El mecanismo de contacto requiere adherencia de la bacteria a la superficie del sulfuro metlico. El mecanismo primario para la adherencia a la pirita es electrosttico en naturaleza. En el caso de Acidithiobacillus ferrooxidans, el exopolmero bacterial contiene iones Fe3+ acomplejados por dos residuos cidos urnicos. La resultante carga positiva del exopolmero permite adherencia a la pirita cargada negativamente. De este modo, la primera funcin

de los acomplejados iones Fe3+ (en el exopolmero bacterial) en el mecanismo de contacto es la realizacin de la adherencia celular, mientras su segunda funcin es la disolucin oxidante del sulfuro metlico, similar al rol de los iones Fe3+ libres en el mecanismo no-contacto. En ambos casos, los electrones extrados desde el sulfuro metlico reducen al oxgeno molecular via una cadena redox compleja localizada debajo de la membrana externa, el espacio periplasmtico y la membrana citoplasmtica de la bacteria lixiviante. Adems, es ahora generalmente aceptado que el originalmente discutido mecanismo directo de oxidacin biolgica de sulfuro metlico, es decir, la oxidacin enzimtica directa del azufre de los sulfuros de metales, no existe. Por el contrario, el mecanismo indirecto, es decir, la oxidacin noenzimtica del sulfuro metlico por iones Fe3+ combinado con reoxidacin enzimtica de los iones Fe2+ resultantes, se mantiene y ahora comprenden dos submecanismos: mecanismo de contacto y mecanismo de no-contacto (Rawlings 2002; Sand et al. 2001). El mecanismo no-contacto es bsicamente forzado por la bacteria, que oxida iones Fe2+ en solucin. El Fe3+ resultante de alguna manera entra en contacto con la superficie del mineral, donde es reducido, comenzando el ciclo nuevamente. Esto significa que el proceso electroqumico resultante en la disolucin de sulfuros metlicos toma lugar en la interfase entre la clula bacterial, especificamente en las paredes de la clula y la superficie del sulfuro metlico. De esta manera la clula contribuye a la disolucin del mineral por generacin del agente oxidante, el ion Fe3+, y por consiguiente la oxidacin de los compuestos de azufre resultantes desde la solucin. En ambos mecanismos, el principal rol de la bacteria lixiviante consiste en regenerar iones Fe3+, que es el ms importante oxidante en biotipos acdicos. De esta forma, el oxidador acidoflico Fe2+ controla el potencial redox en su ambiente, quien es determinado principalmente por la razn Fe3+/Fe2+ en soluciones lixiviantes. Adems de esto, oxidantes acidoflicos de azufre contribuyen a la transformacin del compuesto de azufre intermediario a cido sulfrico. En el caso de azufre elemental, la oxidacin es llevada a cabo por la bacteria, debido a que esta especie de azufre es inerte a la oxidacin abitica en ambientes cidos. Consecuentemente azufre elemental puede acumularse en el curso de la disolucin del sulfuro metlico, si la bacteria oxidante de azufre est ausente o inhibida. En general, la produccin de cido sulfrico desde compuestos de azufre reducidos es necesaria para regenerar protones consumidos por el proceso inicial de lixivacin va

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polisulfuro. En adicin, oxidadores de azufre pueden influenciar la cintica de lixiviacin en una forma particular. Azufre elemental puede ocurrir suspendido como agregados libres y cristales, o puede formar una capa sobre la superficie del sulfuro metlico. En el ltimo caso, las propiedades electroqumicas de la superficie del sulfuro metlico podran cambiar y/o una barrera es formada reduciendo la velocidad de difusin para iones y oxgeno. Ambos fenmenos influencian negativamente la cintica de lixiviacin. Capas de azufre que disminuyeron la velocidad de lixiviacin fueron observadas sobre esfalerita soluble en cido a bajos potenciales redox en la ausencia de oxidantes de azufre (Fowler y Crundwell 1999). Problemas similares son conocidos para calcopirita (Bevilaqua et.al 2002). En contraste, a altos potenciales redox (aprox. 750 mV vs. electrodo estndar de hidrgeno (SHE)) no fueron observadas capas de azufre inhibidoras, con sulfuros metlicos solubles en cido y no-solubles en cido (Fowler y Crundwell 1998; Fowler et al. 1999). Aunque azufre elemental fue tambin formado en los dos ltimos casos, lo que problamente ocurri solamente como agregados libres, que no disminuyeron la velocidad de lixiviacin bajo condiciones de pH controlado. Por otro lado, bastantes bacterias lixiviantes crecen adheridas a la superficie de sulfuros minerales. Este proceso de adherencia es predominantemente realizado por la sustancia polimrica extracelular (EPS) alrededor de las clulas e incluso estimula la produccion de EPS. En el caso de At. Ferrooxidans R1 y pirita el EPS consisti de los azcares glucosa, rhamnosa, fucosa, xylosa, mannosa, cidos grasos saturados C12-C20, cido glucurnico y iones Fe3+ (Gehrke et al. 1998, 2001). La adherencia ocurre debido a una interaccin electrosttica principal de las clulas cargadas positivamente (2 moles negativamente cargados de residuos de cido glucurnico acomplejan 1 mol positivamente cargado de iones Fe3+, resultando en una carga neta positiva) con pirita negativamente cargada a pH igual a 2 en solucin de cido sulfrico; Blake et al.1994; Grutzner 2001; Solari et al. 1992). Asimismo, la interaccin hidrofbica no contribuye significativamente a la adherencia de la superficie del sulfuro metlico (Gehrke et al. 1998; Sampson et al. 2000). MECANISMO DE BIOLIXIVIACION INDIRECTA VIA TIOSULFATO Sulfuros de metales como pirita, molibdenita, y tungstenita son exclusivamente oxidados va extraccin de electrones por iones Fe3+, es decir, la transferencia de electrones de la banda de valencia a iones Fe3+. En este grupo de sulfuros metlicos, el enlace qumico entre el

azufre y el metal no se rompe hasta que un total de seis etapas sucesivas de oxidacin electrnica hayan sido realizadas y el tiosulfato es liberado (Luther 1987; Moses et al. 1987; Schippers et al. 1996). Este mecanismo es llamado, segn el primer compuesto de azufre libre, via tiosulfato (Schippers et al. 1996). Principalmente, el tiosulfato libre es oxidado va tetrationato y otros politionatos, finalmente a sulfato, pero tambin cantidades significativas de azufre elemental (10-20%) puede ser producido en ausencia de bacterias oxidantes de azufre (Schippers et al. 1999). Goldhaber et al. observaron la presencia de compuestos intermedios de azufre (sulfitos, tiosulfatos y tetrationatos) durante la disolucin de pirita, lo cual llev a Luther, Moses et al. a proponer un mecanismo indirecto para la oxidacin del FeS2, en el que indicaban que este era atacado por ion frrico hexahidratado (compuesto encontrado en la EPS celular), produciendo tiosulfato e ion ferroso como primeros intermediarios. El tiosulfato formado, al no ser estable en soluciones cidas que contienen Fe3+, reacciona produciendo ion ferroso y tetrationato. De este modo, la oxidacin de la pirita tiene lugar de acuerdo con las siguientes reacciones: FeS2 + 6 Fe3+ + 3 H2O > 7 Fe2+ + S2O32- + 6 H+ S2O32- + Fe3+ > S4O62- + Fe2+ (6)

(7)

De acuerdo con Steudel y Wentzien, el tetrationato formado se descompone en presencia de pirita a azufre elemental, sulfato y trazas de tri- y pentationato, mediante un mecanismo de reaccin que involucra al cido disulfano-monosulfnico. Sand, Schippers et al. recogieron todas estas observaciones y las reforzaron mediante la realizacin de un estudio de los compuestos intermedios formados durante la disolucin biolgica de la pirita con Leptospirillum ferrooxidans y de la disolucin qumica con Fe3+. En ellos, detectaron tambin la formacin de tiosulfato, tritionato, tetrationato y cido disulfanomonosulfnico como intermediarios, por lo que propusieron un mecanismo indirecto de biolixiviacin al que dieron el nombre de mecanismo de biolixiviacin indirecta va tiosulfato (Fig. 3A). Segn este mecanismo, una vez que la clula se encuentra adherida a la superficie mineral, el ion frrico hexahidratado contenido en el exapolmero extracelular empieza a atacar al sulfuro metlico de forma indirecta segn la reaccin (6), produciendo Fe2+ y tiosulfato (intermediario). Este ltimo reacciona generando otros productos intermedios, tales como tetrationatos, cido disulfano-monosulfnico y

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tritionato, hasta llegar a sulfato, de acuerdo a la siguiente reaccin global: S 2O 32- + 8 Fe 3+ + 5 H 2O > 8 Fe 2+ + 2 SO 42- + 10 H+ ( 8)

El ion ferroso es rapidamente oxidado a ion frrico por la bacteria y reciclado dentro del exopolmero. Una parte de los politionatos producidos durante estas reacciones se incorpora en forma de partculas coloidales en el periplasma de A. ferrooxidans, como fuente de energa. En presencia de bacterias A. ferrooxidans, estas seran capaces de regenerar el Fe3+

Figura 3. Mecanismos de Biolixiviacin de Sulfuros Metlicos. A Mecanismo Tiosulfato. B Mecanismo Polisulfuro. necesario y, al mismo tiempo, de oxidar el tiosulfato y los politionatos a sulfato, mientras que si estn presentes L. ferrooxidans (incapaz de oxidar compuestos de azufre), seran las bacterias azufreoxidantes (A. thiooxidans, A. caldus, A. acidophilus, y otras) las responsables de la oxidacin del tiosulfato y de los dems compuestos de azufre. Una confirmacin de este modelo puede encontrarse en los resultados obtenidos por Sugio sobre la oxidacin qumica de azufre (tiosulfato) a tetrationato, mediante la reduccin de Fe3+ a Fe2+ por las enzimas fierro frrico xido-reductoras de A. ferrooxidans. La mayora del tetrationato se incorporaba como grnulos de politionato en el periplasma y el resto era oxidado a sulfato19. Este mecanismo explica bastante bien la oxidacin de la pirita que, aunque es el sulfuro ms abundante en la tierra, no es el ms valioso. Para poder postular un mecanismo vlido para otros sulfuros minerales, en los que se observaba que en ausencia de Fe3+ tambin tena lugar la disolucin bacteriana, se necesit la realizacin de nuevos experimentos. MECANISMO DE BIOLIXIVIACION INDIRECTA VIA POLISULFURO Y AZUFRE

Un estudio minucioso de la mineraloga y de las propiedades semiconductoras de los sulfuros metlicos llev a diferentes investigadores a la conclusin de que en la pirita (FeS2) y la molibdenita (MoS2), las bandas de valencia provienen solamente de orbitales de tomos metlicos, que no contribuyen al enlace qumico metal-azufre; razn por la cual estos sulfuros solamente pueden ser degradados por ataques oxidantes con el ion Fe3+. Por el contrario, otros sulfuros metlicos (ZnS, CuFeS2, PbS), poseen bandas de valencia a las que contribuyen orbitales de tomos metlicos y de azufre, que no solo seran atacables mediante la accin del Fe3+, sino que tambin los protones H+ podran producir el mismo efecto. Por consiguiente, el mecanismo indirecto va tiosulfato no sera vlido para estos ltimos sulfuros. En relacin a este tema, Tributsch y Bennett trabajaron con sulfuros sintticos libres de hierro, como ZnS y CdS, y observaron que la disolucin sin el oxidante era posible, lo que les llev a proponer un mecanismo en el cual, en ausencia de Fe3+, el ion H+ actua como receptor de electrones durante la oxidacin del sulfuro mineral. As, por reaccin qumica con la superficie del sulfuro metlico, los protones (H+) rompen sus enlaces qumicos, produciendo un estado superficial que puede describirse, qumicamente, como grupos SH-. Una molcula transportadora Y+, generada por la bacteria, retira estos grupos de la superficie mineral por formacin del complejo YSH18. Dicho compuesto es reabsorbido por el sistema metablico de la bacteria, que lo oxida y libera de nuevo la molcula Y+. Las reacciones que tienen lugar son: MS + Y+ + H+ > M2+ + Y-SH (9)

Y-SH + 2O2 > Y+ + H+ + SO42(10) Con estas bases y con el fin de plantear un mecanismo de ataque para estos sulfuros, Schippers y Sand realizaron un estudio de los compuestos de azufre formados durante la oxidacin qumica con ion frrico. Obtuvieron que, en el caso del FeS2 y MoS2, se formaba un 90% de sulfato y aproximadamente 10% de politionatos, lo que confirmaba el mecanismo via tiosulfato propuesto anteriormente por ellos. Sin embargo, para los otros sulfuros (ZnS, CuFeS2, PbS), se obtena ms de un 90% de azufre elemental, muy poco sulfato y una cantidad apenas detectable de politionatos. Con estas nuevas consideraciones, Schippers y Sand plantearon un nuevo mecanismo de disolucin de sulfuros como ZnS, CuFeS2, PbS, al que llamaron mecanismo de biolixiviacin indirecta va polisulfuro y azufre (Fig. 3B)20.

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Segn este mecanismo, la disolucin de sulfuros minerales, como ZnS, CuFeS2 y PbS, empieza por el ataque de los protones que liberan el metal en forma inica y producen H2S; este ltimo es oxidado consecutivamente por el Fe3+. Las reacciones que tienen lugar son: MS + 2H+ > M2+ + H2S H2S + Fe3+ > H2S+ + Fe2+ (11) (12)

Debido a la capacidad de iones Fe3+ para romper los enlaces del sulfuro metlico ms efectivamente que los protones, el radical H2S+ puede preferentemente ser formado en una reaccin sin formacin de H2S como producto intermedio. La produccin de polisulfuros (Fig. 4) empieza con la disociacin de los H2S+ a radicales HS, que a su vez reaccionan produciendo iones disulfuro, segn las siguientes reacciones:

Figura 4. Formacin de Polisulfuro. MS: sulfuro mineral; M2+: ion metlico; H2Sn y Sn2-: polisulfuros; H2S*+ y HS*:radicales.
bacteria

H2S + H2O > H3O + HS

+

(13)

0,125S8 + 1,5O2 + H2O > SO42- + 2H+ (20) Segn este mecanismo, el papel de las bacterias durante la biolixiviacin de sulfuros

Dos de los radicales HS pueden reaccionar a un disulfuro: 2HS > H2S2 (14)

El disulfuro formado puede llegar a ser oxidado por el Fe3+ o por radicales HS: H2S2 + Fe3+ > H2S2+ + Fe2+ (15)

Por dimerizacin de dos HS2 se produce tetrasulfuro, y por reaccin de HS2 con radicales HS se produce trisulfuro. As, el aumento de las cadenas de pilosulfuro tienen lugar mediante las reacciones representadas en la Figura 4. Los polisulfuros se transforman en azufre elemental por la accin de un medio cido y por reaccin con Fe3+, de acuerdo con las siguientes reacciones: HS9- > HS- + S8 0,5H2Sn + Fe3+ > n/16 S8 + Fe2+ + H+ (16) (17)

El azufre elemental producido se oxida mediante la accin bacteriana, regenerndose as el cido. En consecuencia, las reacciones globales del mecanismo via polisulfuro son las siguientes: MS + Fe3+ + H+ > M2+ + 0,5H2Sn + Fe2+ (n2) (18) 0,5H2Sn + Fe3+ > 0,125S8 + Fe2+ + H+

(19)

metlicos consiste en generar el cido sulfrico, abasteciendo al medio de protones para la hidrlisis del mineral, y mantener el hierro en un estado oxidado, como Fe3+, para el ataque oxidante del mineral. Este planteamiento est de acuerdo con los resultados de numerosos artculos que indican que en ausencia de iones Fe2+ y Fe3+, A. ferrooxidans puede disolver sulfuros sintticos que no contienen hierro y que son hidrolizables en medio cido, como es el caso del ZnS, CdS, NiS, CoS, CuS y Cu2S. En estos sulfuros la velocidad de lixiviacin est relacionada con sus productos de solubilidad y con el pH del medio21. Otro aspecto que apoya su teora tiene que ver con el hecho de que Tributsch y Bennett observaron que la adicin de ion frrico al medio de biolixiviacin de sulfuros sintticos, cido hidrolizables y libres de hierro, incrementaba las velocidades de disolucin, debido a que estos minerales pueden ser atacados tanto por los H+ como por el Fe3+. El descubrimiento de las sustancias polimricas extracelulares (EPS), excretadas por las bacterias para lograr su adherencia a la superficie mineral, tambin ha contribuido a esclarecer muchas interrogantes planteadas y apoya las nuevas teoras propuestas. Se han realizado diferentes estudios para determinar el origen, la funcin y los constituyentes de la EPS y se han obtenido evidencias del importante papel

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que cumple en la interaccin bacteria-superficie mineral, y en el ataque de este ltimo. En esos estudios se observ que la formacin del exopolmero es un requisito importante para la adhesin y posterior solubilizacin del mineral, ya que el hierro que contiene otorga a la clula una carga neta positiva que provoca una atraccin electrosttica entre esta y la superficie de la pirita cargada negativamente. Adems, estos iones Fe3+ intervienen en las primeras etapas de la degradacin del sulfuro, ya que al comienzo del proceso es necesaria la presencia de una cierta cantidad de ion frrico en el medio de biolixiviacin (aproximadamente 0,2 g/l). Por consiguiente, la EPS constituye un espacio inicial de reaccin en el que tiene lugar el proceso de lixiviacin del mineral a travs de la accin del Fe3+, permitiendo ampliar el radio de accin de la clula, al ser considerada como un comportamiento de reaccin. Todas las consideraciones realizadas anteriormente indican que los dos mecanismos de biolixiviacin propuestos por Sand, Schippers et al., junto con el papel que desempena la EPS, son fundamentales a la hora de considerar el verdadero mecanismo de biolixiviacin y ponen en duda la existencia de un mecanismo directo de ataque enzimtico de las bacterias al mineral22. ESTRATEGIAS DE BIOLIXIVIACION Finalmente, y con relacin al estado de investigacin y desarrollo de este tema, Tributsch26, en el Simposio Internacional de Biohidrometalurgia, celebrado en Espana en 1999 realiz una revisin de las propuestas existentes y propuso tres estrategias de biolixiviacin (Fig. 5): Biolixiviacin No-contacto: la bacteria no se adhiere a la superficie mineral y su accin se encuentra restringida a la renovacin del agente de lixiviacin, el Fe3+. Biolixiviacin de contacto: es el nuevo nombre dado a la biolixiviacin directa. En ella, la bacteria se adhiere a la superficie mineral con el propsito de acondicionar el entorno y facilitar el ataque al mineral, a travs de una disolucin electroqumica producida por el Fe3+ contenido en el exopolmero generado por la clula para adherirse al slido. Biolixiviacin cooperativa: existe una cooperacin entre las bacterias adheridas a la superficie mineral y las bacterias libres en solucin, donde las primeras, por biolixiviacin de contacto, liberan especies que constituyen la fuente energtica de las bacterias de la solucin.

Figura 5. Estrategias de Biolixiviacin

CONCLUSIONES Los sulfuros metlicos insolubles en cido como FeS2, MoS2 y WS2 son qumicamente atacados por iones Fe3+ generando tiosulfato, el cual es oxidado a cido sulfrico. Otros sulfuros metlicos tales como ZnS, PbS, CuS, CuFeS2 y otros, son atacados por iones Fe3+ y por protones, resultando en la formacin de azufre elemental va polisulfuros intermedios. El azufre es biooxidado a cido sulfrico. Aunque en el laboratorio es posible demostrar un mecanismo exclusivo de biolixiviacin directa por T. Ferrooxidans, de ciertos sulfuros metlicos no-ferrosos, usando minerales libres de hierro y un medio de cultivo libre de hierro, en condiciones naturales esto nunca ocurre. Esto es, porque, sulfuros metlicos no-ferrosos, estn siempre acompaados por pirita en los depsitos minerales. De este modo, en ambientes naturales la oxidacin directa y la oxidacin indirecta usualmente ocurren juntas. La disolucin bioqumica de los sulfuros metlicos sigue solamente dos rutas o caminos, las que estn determinadas por la solubilidad cida de los sulfuros: mecanismo de biolixiviacin va tiosulfato y mecanismo de biolixiviacin va polisulfuro y azufre. La clula bacterial puede efectuar la disolucin del sulfuro por mecanismo de contacto y mecanismo de no-contacto. El mecanismo de contacto asume que muchas clulas estn adheridas a la superficie del sulfuro metlico. El mecanismo no-contacto asume que la bacteria oxida solamente iones disueltos Fe2+ a iones Fe3+. Este ltimo puede luego atacar el sulfuro metlico y ser reducido a iones Fe2+. El mecanismo de contacto requiere adherencia de la bacteria a la superficie del sulfuro

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metlico. El mecanismo primario para la adherencia a la pirita es electrosttico en naturaleza. En el caso de Acidithiobacillus ferrooxidans, el exopolmero bacterial contiene iones Fe3+ acomplejados por dos residuos cidos urnicos. La resultante carga positiva del exopolmero permite adherencia a la pirita cargada negativamente. De este modo, la primera funcin de los acomplejados iones Fe3+ (en el exopolmero bacterial) en el mecanismo de contacto es la realizacin de la adherencia celular, mientras su segunda funcin es la disolucin oxidante del sulfuro metlico, similar al rol de los iones Fe3+ libres en el mecanismo no-contacto. REFERENCIAS 1. D.E.Rawlings, Annual Reviews Microbiology 2002, 56:65-91 2. H.L.Ehrlich, Geomicrobiology 2002, Rensseleer Polytechnic Institute, New York 3. A. Ballester, Mechanisms of Metals Sulfide Bioleaching, 2001. Madrid 37, 665-672 4. M.P.Silverman and H.L. Ehrlich, Adv. Microbiol. 6 (1964) 153-167 5. V.K.Berry and L.E. Murr, A.E.Torma and J.A. Brierley (Eds.), 1978, 103-118 6. F.F.Bennett and H.J.Tributsch J. Bacteriol. 134 (1978) 310-317 7. M. Drossou. P.R. Norris (Eds.) 1987. 345358 8. C.T. Mathews. Chem. Eng 1972, 21-25 9. G.W. Warren, Metall. Trans. B 15, 1985 512 10. M.A. McKibben Geochem, 1986 11. D. Lundgren, A.E.Torma and J.A. Brierley (Eds.), 1978, 151-160 12. H. Tributsch and J.C. Bennett, J. Chem Technol. Biotechnol. 31, 1981, 565-577 13. R. Vazquez and T.R. Espejo, Appl Environ. Microbiol 63 1997 332-347 14. A. Schippers and W. Sand, Appl Environ. Microbiol 62 1996 3424-3431 15. M. Rodrguez-Leiva and H. Tributsch. 1988 Arch Microbiol 149 401-405 16. R. Arredondo, Appl Environ. Microbiol 60 1994 846-851 17. T. Gehrke and W. Sand. T Vargas, C.A. Jerez, K.W. Wiertz and H. Toledo (Eds.) 1995 1-11 18. W. Sand. Appl Environ. Microbiol 63 2003 239-248 19. A. Schippers and W. Sand. Appl Environ. Microbiol 52 1999 104-110 20. A. Schippers and W. Sand. Appl Environ. Microbiol 65 1999 319-321 21. T. Gehrke and W. Sand. Water Science and Technology 2001 Vol. 43, 6, 159-167

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