INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DEL SUR DEL ESTADO DE YUCATN

ORGANISMO PBLICO DESCENTRALIZADO DEL GOBIERNO DEL ESTADO DE YUCATN

Evaluacin de Metodologas para Establecer la Embriognesis Somtica en Chile Habanero

TESIS PROFESIONAL

PARA OPTAR AL TTULO DE: INGENIERO BIOQUMICO

PRESENTA: YUSIRA CAB UCN

OXKUTZCAB, YUCATN, MXICO

2013

DEDICATORIA: A DIOS TODOPODEROSO: Por regalarme este ao que hoy refleja el primer fruto de muchos que vendrn, que son producto de nuestra constancia y perseverancia. Por ser un amparo, fortaleza, cuando ms lo necesitamos, por hacer palpable su amor a travs de cada uno de los que nos rodea. Por haberme dado sabidura, fortaleza, salud, coraje y no dejarme sola en los momentos difciles y haberme permitido llegar a la meta en este gran proyecto, para que fuera posible alcanzar este triunfo. Por ser mi creador, el motor de mi vida, por no haber dejado que me rinda en ningn momento e iluminarme para salir adelante, porque todo lo que tengo, lo que puedo y lo que recibo es regalo que l me ha dado. A MIS PADRES: A ti padre: Sr. ngel Cab Coll, por ayudarme a la construccin de m vida y hacer que verdaderamente crea en m. Gracias papi por tu amor, por tu comprensin y por ser el mejor amigo, eres quien hizo que todo esto fuera posible, a ti te debo gran parte de lo que soy. Por apoyarme siempre y estar junto a m cuando lo necesito, por ser un excelente PADRE. A ti madre: Sra. Mara Elsy Ucn Couoh, por ser la mejor del mundo y por desempear muy bien tu papel. Por tu cario, tu apoyo, tu dedicacin y empeo por ayudarme a ser una persona mejor cada da. Por tanto esfuerzo para que yo alcanzara este triunfo. Qu sin esperar nada a cambio has sido pilar en nuestro camino y as, formas parte de este logro que nos abre puertas inimaginables en nuestro desarrollo profesional. Mil gracias por el apoyo incondicional que me brindaste, por todos los sacrificios que hiciste a lo largo de mi carrera, as como por tu comprensin y paciencia en los momentos difciles que tuve.

A ti amor: gracias por tus consejos, ayuda y comprensin, gracias por apoyarme en todo momento. Te amo mi vida!, juntos con la ayuda de Dios lograremos nuestros propsitos, porque nunca dejaste que me rinda y por decirme que en cada situacin vea el lado positivo, TE AMO Alfredo Magaa Camas. A mis hermanas: Elena, Rosana, Marisol, Mariana, Adidel e Ivette, gracias por todo el apoyo que me brindaron, las quiero mucho y con la bendicin de dios todas vamos a salir adelante. A ti to: Audomaro Cab Coll, por ser una gran persona en todo momento y sobre todo por ser un hermano para nosotras. A doa Rita: por ser una gran persona, por sus consejos de madre, su amabilidad y su compresin, muchas gracias por todo.

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AGRADECIMIENTOS Al Instituto Tecnolgico Superior de Sur del Estado de Yucatn, por darme la oportunidad de llevar a cabo mis estudios en su plantel. A la I.Q. Carolina Montejo Peraza,por ser ms que mi maestra, ser una amiga que me gui en el transcurso de la carrera, gracias por su confianza e invaluable apoyo. Al Dr. Jos Juan Ziga Aguilar, por darme la oportunidad y depositar su confianza en m, para realizar este trabajo, as como por el apoyo brindado, su excelente direccin, su amistad y constante motivacin. Al M.C. Ramn Souza Perera, por su apoyo tcnico que me permiti sacar adelante este trabajo, ya que sin su valioso apoyo no hubiera sido posible. A la Ing. Wilma Aracely Gonzlez Kantn por el apoyo tcnico brindado, por transmitirme sus conocimientos y por todas las facilidades brindadas. Por su amabilidad, buena disposicin, paciencia, por el tiempo que me dedic para que este trabajo culminara exitosamente. A la Unidad de Bioqumica y Biologa Molecular de Plantas del Centro de Investigacin Cientfica de Yucatn, por las instalaciones y facilidades brindadas para que este trabajo se llevara a cabo. A ustedes Lourdes, Celia y Dinora, porque en este ao y medio de vida que hemos compartido han demostrado ser buenas personas en todo momento y sobre todo por ser grandes amigas, las considero como unas hermanas, gracias por todos los consejos. A todos mis compaeros del laboratorio 26, Doribet, Daniel, Yailn, Yumi, David, Martha y Juan, gracias por acompaarme y siempre alentarme para poder realizar este trabajo, por compartir su amistad, son muy buenas personas, cada uno diferente, pero de gran corazn. A todos del laboratorio 24 asesorado por el Dr. Vctor Manuel Loyola Vargas y M en C. Rosa Mara Galaz Avalos gracias por el apoyo incondicional brindado para que este proyecto culminara exitosamente,
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en especial a mi amiga MARIA TERESA CADENAS GONZALEZ por el apoyo brindado, paciencia, enseanza muchas gracias por el apoyo. Al tcnico Francisco Javier Gonzlez Xool, Erick Javier Gonzlez Balam y Ral Humberto Chan Balan por los apoyos, consejos brindados en los invernaderos. A todos mis amigos y profesores, que me han ayudado en mi formacin acadmica, gracias por su paciencia y apoyo brindado. A todos mil gracias, Dios los bendiga en todo momento, siempre tendrn un lugar especial en mi corazn

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Lista de abreviatura Abreviatura 2,4-D BA B5 CTV EC ES ESD ESI Kin M M MS pH RCV T Definicin cido 2,4-diclorofenoxiactico Benciladenina Vitaminas Cultivo de tejidos vegetales Embriognesis cigtica Embriognesis somtica Embriognesis somtica directa Embriognesis somtica indirecta Cinetina Molar Micromolar Medio de cultivo Murashi & Skoog, Potencial de Hidrgeno Reguladores de crecimiento vegetal Tratamiento

T DZ

Thidiazuron

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Contenido
NDICE DE TABLA ................................................................................................... XII RESUMEN ............................................................................................................... XIII INTRODUCCIN ........................................................................................................ 1 CAPTULO 1 ............................................................................................................... 3 1.1 ANTECEDENTES .................................................................................................... 3 1.1.1 Origen y distribucin del gnero Capsicum. ................................................ 3 1.1.2 El chile habanero ......................................................................................... 4 1.2 CULTIVOS DE TEJIDOS VEGETALES (CTV) ............................................................... 4 1.3 REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL ........................................................... 7 1.3.1 Auxinas ........................................................................................................ 8 1.3.2 Citocininas ................................................................................................... 8 1.4 ASPECTOS GENERALES DE LA EMBRIOGNESIS SOMTICA ........................................ 8 1.5 EMBRIOGNESIS SOMTICA DIRECTA E INDIRECTA ................................................. 10 1.6 FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LA EMBRIOGNESIS SOMTICA............................ 12 1.7 EMBRIOGNESIS SOMTICA EN EL GNERO CAPSICUM ........................................... 12 1.8 ORGANOGNESIS ............................................................................................... 13 CAPTULO II ............................................................................................................. 15 2.1 JUSTIFICACIN ................................................................................................... 15 2.2 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................ 16 2.2.1 Objetivos especficos ................................................................................. 16 2.3 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ................................................................................ 17
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CAPTULO III ............................................................................................................ 18 3.1 MATERIALES Y MTODOS ..................................................................................... 18 3.1.1 Material biolgico ....................................................................................... 18 3.2 OBTENCIN DEL EMBRIN CIGTICO (EC) ............................................................ 18 3.2.1 Extraccin de semillas de chile habanero .................................................. 18 3.2.2 Protocolo para esterilizar semillas de Capsicum chinense Jacq. ............... 20 3.2.3 Evaluacin de diferentes concentraciones de 2,4-D, TDZ y sacarosa ...... 20 3.2.4 Hipoctilos de Capsicum chinense Jacq., como explantes ........................ 21 3.3 INDUCCIN A LA EMBRIOGNESIS SOMTICA ......................................................... 22 3.4 OBTENCIN DE DISCOS FOLIARES E INDUCCIN A LA EMBRIOGNESIS SOMTICA ...... 22 CAPTULO IV............................................................................................................ 26 4.1 RESULTADOS Y DISCUSIN .................................................................................. 26 4.1.1 Evaluacin de la respuesta morfognica de callos generados a partir de embriones somticos inmaduros, ante diferentes concentraciones de 2,4-D, TDZ y sacarosa. ................................................................................................. 26 4.1.2 Evaluacin con chile habanero de parmetros reportados en la literatura para el proceso de embriognesis somtica en el gnero Capsicum. ............... 26 4.1.3 Modificacin I. Adicin de benciladenina y reduccin de la

concentracin de sacarosa a explantes pre-tratados. ........................................ 28 4.1.4 Modificacin II. Disminucin de las concentraciones de TDZ y de

sacarosa. ............................................................................................................ 30 4.1.5 4.2 Modificacin al tratamiento T4D ............................................................ 34

INDUCCIN EMBRIOGNICA EMPLEANDO HIPOCOTILOS COMO EXPLANTES. ........... 37

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4.3

INDUCCIN EMBRIOGNICA EMPLEANDO DISCOS FOLIARES COMO EXPLANTES. ..... 39

4.4 DISCUSIN ......................................................................................................... 41 CAPTULO V............................................................................................................. 43 5.1 CONCLUSIN ...................................................................................................... 43 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................................... 44

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ndice de figuras

Figura 1. Comparacin de estructuras embriognicas entre los diferentes estadios de embriognesis somtica y cigticas (Traducido de Zimmerman, 1993). ................ 9 Figura 2. Representacin esquemtica del origen de un embrin somtico. Se representa en la parte superior la embriognesis somtica directa en C. Canephora y en la parte inferior la embriognesis somtica directa en C. arbica (Quiroz-Figueroa et al., 2006). .................................................................................. 11 Figura 3. Fruto, semillas y embrin cigtico inmaduro. El EC fue utilizado como fuente de explante ..................................................................................................... 19 Figura 4. Plntulas de chile habanero en diferentes medios de sub-cultivo. ............ 23 Figura 5. Obtencin de discos foliares a partir de hojas de chile habanero. ........... 25 Figura 6. Efecto del tratamiento con RCV sobre la diferenciacin celular. ............... 28 Figura 7. Efecto de la adicin de BA (8.9 M) sobre el comportamiento de embriones cigticos. .................................................................................................. 29 Figura 8. Reduccin de la concentracin de TDZ con respecto al protocolo original. ...................................................................................................................... 31 Figura 9. Formacin de estructuras a solo 30 das de induccin con diferentes concentraciones y combinaciones de TDZ y 2,4-D. .................................................. 33 Figura 10. Resultados obtenidos a solo 5 das de induccin a embriognesis somtica. ................................................................................................................... 34 Figura 11. Induccin de embriognesis somtica a partir de embriognesis cigticos de chile habanero. ...................................................................................... 36

Figura 12. Induccin a Embriognesis somtica de explantes de hipoctilo de 1cm. .......................................................................................................................... 38 Figura 13. Disco foliar de chile habanero, en dos tiempos de preacondicionamiento 7 das (izquierda), 14 das (derecha). ......................................... 40

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ndice de tabla
Tabla 1. Medio de cultivo murashi & skoog................................................................. 6 Tabla 2. Panel a y b. diferentes concentraciones de tdz, 2,4-d................................. 21 Tabla 3. Diferentes concentraciones de 2,4-d y tdz. ................................................. 27 Tabla 4. Diferentes concentraciones de 2,4-d, tdz aadiendo ba (8.9 m). .............. 29 Tabla 5. Reduccin de tdz. ....................................................................................... 31

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Resumen
El chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) pertenece al gnero Capsicum y aunque se considera originario de Sudamrica, Yucatn est reconocido como centro de reserva gentica de esta especie. Su cultivo se encuentra entre los principales productos agrcolas de la Pennsula y es altamente apreciado en el mundo por su aroma, sabor y picor, atributos que lo diferencian de las dems variedades de la especie Capsicum chinense. El chile habanero ha adquirido mayor demanda, en el mercado nacional como en el internacional, debido a que constituye la materia prima para diferentes industrias, especialmente la alimenticia, la farmacutica y la militar adems de su alto consumo en una amplia gama de platillos.

A pesar de su importancia, an no se cuenta con cultivares resistentes a las numerosas plagas y enfermedades que afectan su productividad, las cuales ocasionan cuantiosas prdidas econmicas. Por ello, el presente trabajo tuvo como objetivo principal mejorar los protocolos de embriognesis somtica de chile habanero, tomando en cuenta los diversos factores reportados en la literatura cientfica, esto como una alternativa para la generacin de herramientas moleculares para el mejoramiento gentico.

Mediante la evaluacin de diversas concentraciones de reguladores de crecimiento vegetal (RCV), as como de agentes osmticos, se estableci un protocolo eficiente para la de regeneracin por organognesis, partiendo de embriones somticos inmaduros. La inspeccin microscpica sugiere que las
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estructuras organelares podran generarse mediante un proceso de morfognesis unicelular, lo cual, de confirmarse, podra constituir una alternativa aceptable del proceso de embriognesis somtica como herramienta biotecnolgica para el mejoramiento del chile habanero.

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Introduccin
El chile habanero es un cultivo hortcola con importancia econmica para la Pennsula de Yucatn (referido en Sols-Ramos et al., 2010). Tiene una alta demanda por la industria alimentaria, farmacutica, qumica y militar, por sus altos contenidos de Capsaicinoides. Estos alcaloides le confieren una alta pungencia a sus frutos, considerados por ello como los ms picosos (Livingstone et al., 1999). Sin embargo, a pesar de su amplia importancia econmica, social y cultural, las plagas y enfermedades que afectan este cultivo han afectado su produccin y ocasionan la prdida de gran parte de la produccin. Los esfuerzos por mantener una buena produccin no han sido suficientes, por ello la importancia de la biotecnologa para el mejoramiento y regeneracin, considerando el establecimiento de un protocolo de embriognesis somtica agronmicas similares. Por otra parte, dentro de las tcnicas de cultivo de tejidos, la embriognesis somtica (ES) es, sin duda, la va ms poderosa de micropropagacin, que ha sido empleada para el mejoramiento gentico de una gran cantidad de especies vegetales. Esta va de regeneracin est poco elucidada y no se conoce mucho sobre la regulacin de los eventos morfo-histolgicos, bioqumicos y moleculares que tienen lugar cuando las clulas somticas se vuelven competentes para producir embriones somticos Un elemento comn en los diferentes protocolos de embriognesis somtica es la aplicacin exgena de fitorreguladores o reguladores del crecimiento vegetal (RCV).
1

para

la obtencin

de

plantas con

caractersticas

Los RCV son compuestos qumicos sintetizados en un determinado lugar de la planta y se translocan a otro, donde actan a muy bajas concentraciones, regulando el crecimiento, el desarrollo y el metabolismo de la planta En algunas especies, la induccin de la embriognesis somtica requiere la presencia de auxinas solas o en combinacin con citocininas (Gaj, 2004). La auxina ms utilizada para iniciar la embriognesis somtica es la auxina sinttica cido 2,4diclorofenoxiactico (2,4-D), tambin conocido por su actividad herbicida En la mayora de los casos en que las citocininas indujeron embriones somticos, fueron agregadas al medio en conjunto con auxinas (Gaj et al., 1994). Sin embargo, en algunos casos la adicin de citocininas como la nica fuente de RCV es suficiente para generar embriones somticos (Bronner et al., 1994; Lantcheva et al., 1999). Las citocininas utilizadas en el crecimiento de tcnicas vegetales son la benciladenina (BA), la cinetina (KIN, por sus siglas en ingls), la zeatina y, ms recientemente, el thidiazuron (TDZ).

Captulo 1
1.1 Antecedentes
1.1.1 Origen y distribucin del gnero Capsicum. Todos los chiles pertenecen al gnero Capsicum, el cual a su vez pertenece a la familia de las solanceas (Lpez-Riquelme et al., 2003). Los chiles se conocen desde principios de la civilizacin en el hemisferio occidental y ha sido parte de la dieta humana desde aproximadamente 7,500 A.C. Los antepasados nativos de Amrica ya cultivaban chile desde 5,200 a 3,400 A.C. El gnero Capsicum fue domesticado en diferentes partes del Mesoamrica y Sudamrica (Bosland, 1996). El gnero Capsicum fue introducido en Europa por Coln en 1493. El cultivo se extendi desde el Mediterrneo hasta Inglaterra en 1548 y en el mismo siglo lleg a Europa Central. Los portugueses llevaron el gnero a la India desde Brasil en 1585 y el cultivo ya se realizaba en China a finales del siglo XVll. Las especies del gnero de Capsicum fueron asimiladas rpidamente por distintas culturas de frica, Asia y Europa (Galmarini, 1999) Actualmente, se cuenta con cinco especies domesticadas, C annum (Jalapeo, Serrano, Ancho, Pasilla, Mirasol o Guajillo, de rbol, Chiltepin o Piqun, etc.), C. baccatum, C. chinense (habanero), C. frutescens (tabasco) y C. pubescens.

1.1.2 El chile habanero El chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) proviene de las tierras bajas de la cuenca amaznica y de ah se dispers a Per durante la poca prehispnica. La distribucin tambin se dirigi hacia la cuenca del Orinoco (ubicada en los actuales territorios de Colombia y Venezuela), hacia Guyana, Surinam, la Guyana Francesa y las Antillas del Caribe. (Gonzlez et al., 2006). Se ha sugerido que la introduccin prehispnica del chile habanero en el Caribe se debi a migrantes indgenas agricultores y alfareros procedentes de Sudamrica, pertenecientes a grupos arahuacos (originarios de Puerto Rico), quienes viajaron por las Antillas menores hasta llegar a Puerto Rico, La Espaola (Repblica Dominicana y Hait), Jamaica y Cuba entre los aos 250 D.C. y 1,000 D.C.

1.2 Cultivos de tejidos vegetales (CTV)

El cultivo de tejidos vegetales es un conjunto de tcnicas utilizadas para el cultivo y la manipulacin in vitro de clulas y tejidos, que utiliza medios ricos en nutrientes en ambientes aspticos controlados, llevando as a la aplicacin comercial de la produccin de plantas. Tambin es una herramienta importante para el estudio de las reas bsicas y aplicadas de la biologa del desarrollo. Los principales conceptos de esta rea fueron planteados por Haberlandt al comienzo del siglo XX (Thorpe, 2007) Puede decirse que el cultivo de tejidos vegetales (CTV) tiene tres aplicaciones principales:

La produccin de metabolitos secundarios. La micropropagacin. El estudio de la gentica, la fisiologa, la bioqumica y la patologa de las clulas vegetales (Jian-Jiang, 2001).

Durante el crecimiento de la planta se requiere de varios elementos para su sobrevivencia, tales elementos pueden ser proporcionados por el suelo o con la ayuda de fertilizantes; as mismo, en el cultivo de tejidos vegetales in vitro se requieren sales inorgnicas (macronutrientes y micronutrientes), suplementos orgnicos (vitaminas, aminocidos y reguladores de crecimiento vegetal (RCV) y una fuente de carbono (Hall, 1999) El medio Murashige y Skoog (MS) (Tabla 1) es comnmente utilizado para el cultivo de tejidos in vitro, especialmente para la regeneracin a partir de tejidos y callos (Beyl, 2005). La manipulacin del medio de cultivo es un factor importante, porque con ello se contiene el mejoramiento de la eficiencia del cultivo de clulas vegetales (Jian Jiang, 2001). Para la iniciacin del CTV deber tomarse en cuenta tres consideraciones importantes: i. La seleccin del explante. ii. La seleccin de medio adecuado y las condiciones ambientales apropiadas para su desarrollo.
iii. Por ltimo, el aislamiento y mantenimiento de callos (Loyola- Vargas et al., 2008)

Tabla 1. Medio de cultivo Murashi & Skoog Macroelementos NH4NO3 KNO3 CaCL22H2O MgSO47H2O KH2PO4 Na2EDTA FeSO47H2O Microelementos H3BO3 MnSO44H2O ZnSO47H2O Kl Na2MoO42H2O CuSO45H2O CoCl26H2O Componentes orgnicos Myo-inositol cido Nicotnico Piridoxina HCl Tiamina HCl Glicina Sacarosa pH 100.0 0.5 0.5 0.1 2.0 30,000 5.7- 5.8 555.10 4.06 2.43 0.30 26.60 87.64 mM Mg L 1,650 1,900 440 370 170 37.30 27.80 mg L 6.20 22.30 8.60 0.83 0.25 0.025 0.025 Mg/L-1
-1 -1

mM 20.60 18.80 3.00 1.50 1.25 0.10 1.10 mM 100.0 100.0 30.0 5.0 1.0 0.1 0.1 M

Los cultivos de callos se refieren a la iniciacin y proliferacin continua de clulas indiferenciadas de tejido del parnquima, tales cultivos se pueden mantener durante perodos de tiempo prolongados, por lo general son el material del cual se derivan las suspensiones celulares (Brown, 1990) Se ha observado que los tejidos cultivados in vitro liberan una cantidad de sustancias fenlicas en el medio de cultivo, el cual con frecuencia se torna caf o negro poco despus del aislamiento; cuando esto ocurre, se inhibe el crecimiento y el tejido por lo general muere. La oxidacin fenlica de los explantes se puede prevenir eligiendo semillas y tejidos jvenes; tambin, los explantes se deben transferir a un medio fresco al poco tiempo de haber sido sub-cultivados para que no se produzca la fenolizacin (Fakhrai y Fakharai, 1990)

1.3 Reguladores del crecimiento vegetal

Los RCV son esenciales en la promocin del crecimiento y el desarrollo de las plantas (Brown, 1990), tales como la germinacin, la elongacin del tallo, el crecimiento, el desarrollo de las hojas, la floracin y la maduracin de los frutos. Existen diferentes grupos de RCV, entre los que se encuentran las auxinas y las citocininas, ampliamente empleadas en el CTV (Gaba, 2005).

1.3.1 Auxinas Las auxinas desempean un papel en muchos procesos de desarrollo, incluyendo la elongacin celular, la dominancia apical, la formacin de races adventicias y la ES. Las auxinas sintticas ms utilizadas en el CTV son el cido naftalenactico (ANA) y el cido 2,4-diclorofenoactico (2,4-D); las de origen natural son el cido indolactico (AIA) y el cido indolbutrico (IBA) (Beryl, 2005). Una concentracin elevada de una auxina exgena puede inducir la ES (Gaba, 2005).

1.3.2 Citocininas Las citocininas promueven la divisin celular y estimulan la iniciacin y el crecimiento de los brotes in vitro. Las ms utilizadas son la zeatina (Z), la cinetina (KIN) y la 2isopentil adenina (2-IP), as como las sintticas benciladenina (BA) y el thidiazuron (TDZ) (Beyl, 2005).

1.4 Aspectos generales de la embriognesis somtica

La Embriognesis somtica es el proceso de desarrollo por el cual las clulas somticas, bajo condiciones de induccin adecuadas, generan clulas embriognicas que sufren cambios morfolgicos y bioqumicos que, semejando las estructuras de un embrin cigtico (Figura 1), resultan en la formacin de un embrin somtico; este proceso ha sido una va importante para la generacin de nuevas plantas. La

capacidad de producir embriones a partir de clulas somticas radica nicamente en el reino vegetal (Zimmerman, 1993). Los primeros estudios de la ES se llevaron a cabo en cultivos de zanahoria (Daucus carota). Este modelo ha sido ampliamente utilizado debido a su reproducibilidad, a su respuesta rpida y a los altos rendimientos (Stewart et al., 1958; Reinert, 1959). En el estudio de la ES en zanahoria, el tejido inicialmente requiere de auxinas; despus, las clulas son transferidas a un medio de cultivo sin auxina (Quiroz-Figueroa et al., 2006).

Figura 1. Comparacin de estructuras embriognicas entre los diferentes estadios de embriognesis somtica y cigticas (Traducido de Zimmerman, 1993).

La nueva planta se puede derivar de una sola clula somtica o un grupo de ellas. Este proceso de regeneracin, que difiere de la va del embrin cigtico, representa una va nica de desarrollo que incluye una serie de eventos caractersticos como la desdiferenciacin celular, la activacin de la divisin celular, la reprogramacin de su fisiologa, la produccin de metabolitos especficos y la modificacin de los patrones de expresin gnica (Yang y Zhang et al., 2010).

1.5 Embriognesis somtica directa e indirecta

La embriognesis somtica, tanto directa (ESD) como indirecta (ESI), se puede originar por dos vas, unicelular o multicelular. Cuando los embriones tienen un origen unicelular, se observan divisiones coordinadas de clulas y el embrin est conectado al tejido materno, por una estructura similar al suspensor, cuando los embriones tienen un origen multicelular, carecen de divisiones celulares coordinadas y los embriones en contacto con el rea basal se fusionan al tejido materno (REF) (Figura 2).

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Figura 2. Representacin esquemtica del origen de un embrin somtico. Se representa en la parte superior la embriognesis somtica directa en C. Canephora y en la parte inferior la embriognesis somtica directa en C. arbica (Quiroz-Figueroa et al., 2006).

Para el observador experimentado, es fcil distinguir entre callos embriognicos y no embriognicos con base en su morfologa y su color (Von-Arnold et al., 2002). En cultivos de C. arbica los callos embriognicos son de color marrn y poseen una textura dura, mientras que los callos no embriognicos son de color plido, con textura blanca, friable y carente de toda estructura organizada (Quiroz-Figueroa et al., 2006)
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Se ha realizado estudios histolgicos sobre la ESD, as como la ESI en C. arbica, en las cuales a la primera semana se pudo caracterizar una clula relativamente isodiametricas con un ncleo prominente, un citoplasma denso y una pared celular gruesa; estas observaciones les permiti a los autores concluir que estos embriones tienen un origen unicelular (Quiroz- Figueroa et al., 2002).

1.6 Factores que pueden afectar la embriognesis somtica

Los principales factores que afectan a la ES in vitro son el genotipo, el origen del explante y la composicin del medio de cultivo, particularmente con respecto a las hormonas (Zimmerman et al., 1989). De igual manera, se sabe que la fuente nitrogenada modifica sustancialmente la respuesta embriognica de los cultivos (Halperin y Wetherell, 1965).

1.7 Embriognesis somtica en el gnero Capsicum

Actualmente existen reportes de la generacin de plantas in vitro del genero Capsicum, particularmente en la especie C. annuum. Sin embargo, la gran mayora son va organognesis directa a partir de hojas cotiledonares e hipocotilos (Gunay y Rao, 1978; Fari y Sako, 1981; Phillips y Hubstenberger, 1985; Agrawal et al., 1989; Ochoa-Alejo e Ireta-Moreno, 1990; Hyde y Phillips, 1996). La ES en C. annuum ha sido inducida principalmente a partir de embrin cigtico inmaduro (Binzel et al., 1996). nicamente Kintzios et al. (2001) indujeron ES a partir

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de hoja. Recientemente Klan et al. (2006) reportaron la obtencin de embriones somticos utilizando yema apical y segmentos de tallos. A la fecha, en C. chinense existen dos reportes de ES (Lpez-Puc et al., 2006; Zapata-Castillo et al., 2007). El primer reporte es el ms eficiente no slo del gnero Capsicum, sino tambin de la familia Solanaceae, dado que la formacin de embriones somticos de manera directa puede ser inducida a partir de una amplia gama de explantes (Lopez-Puc et al., 2006). No obstante, los embriones somticos generados mediante estos protocolos no maduran eficientemente, generando estructuras aberrantes que no concluyen el proceso de conversin. Por otro lado, nicamente Sols-Ramos et al. (2010) han reportado la generacin de plantas transgnicas estables, obtenidas a partir de un proceso de embriognesis somtica.

1.8 Organognesis
El trmino organognesis se refiere a la formacin de novo de rganos en los explantes cultivados (Litz y Jarret, 1991; Perez- Molphe., et al., 1999). Este fenmeno est basado en la totipotencialidad de las clulas vegetales. La organognesis comprende la formacin de yemas o races y puede ser directa o indirecta. La primera se refiere a la formacin de rganos directamente del explante original, mientras que la segunda ocurre cuando primero se origina tejido calloso y luego se forman los rganos a partir de ste (Perez-Molphe et al., 1999). Estos rganos pueden ser inducidos a partir de una clula o de un grupo de clulas que, segn las condiciones de cultivo, tienen la propiedad de mantenerse en divisin
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activa). Para que la organognesis ocurra a partir de un callo, deben ocurrir cambios que conduzcan a la organizacin celular, estos cambios involucran la diferenciacin e interaccin celular y la repuesta a seales especficas (Litz y Jarret, 1991). El proceso de organognesis comprende muchos aspectos, como la

desdiferenciacin de tejidos y la organizacin de la clula para formar rganos especficos como primordios o meristemos. La organognesis in vitro depende de la adicin exgena de RCV, en particular de auxinas y citocininas, as como de la capacidad del tejido para responder a las seales hormonales. En general, se han reconocido tres fases en el proceso de organognesis. En la primera fase, las clulas adquieren la habilidad para responder a seales hormonales (competencia); en la segunda fase, las clulas competentes en los explantes cultivados son canalizadas y determinadas para la formacin de rganos especficos, bajo la influencia del balance hormonal; la tercera fase comprende la morfognesis propiamente, que es el proceso mediante el cual se logran desarrollar los rganos.

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Captulo II
2.1 Justificacin
Debido a que la generacin de plantas a travs del cultivo de tejidos in vitro es una herramienta indispensable para la propagacin masiva de plantas elite y constituye un medio para poder aplicar procedimientos de mejoramiento biotecnolgico, para intentar el mejoramiento del gnero Capsicum es necesario mejorar los protocolos existentes, especialmente los reportados para la especie Capsicum chinense Jacq. Los factores clave que apoyen la generacin de protocolos ms eficientes pueden constituir una herramienta experimental muy valiosa para la comunidad cientfica, especialmente para nuestro pas, que es el segundo productor mundial de chiles.

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2.2 Objetivo General

Mejorar los protocolos de embriognesis somtica del chile habanero, tomando en cuenta los diversos factores reportados en la literatura cientfica.

2.2.1 Objetivos especficos 1. Evaluar la respuesta morfognica de callos generados a partir de embriones somticos inmaduros, ante diferentes concentraciones de 2,4-D, TDZ y sacarosa. 2. Evaluar modificaciones a protocolos eficientes previamente reportados para la embriognesis somtica de Capsicum chinense Jacq. 3. Evaluar la respuesta del tejido foliar de Capsicum chinense Jacq, con protocolos reportados para el gnero Coffea.

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2.3 Estrategia experimental

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Captulo III
3.1 Materiales y mtodos
3.1.1 Material biolgico El material biolgico utilizado como explante en esta evaluacin fueron embriones cigticos inmaduros, segmentos de hipoctilo de plntulas de 15 das de germinacin, y discos foliares de aproximadamente 1cm , los cuales fueron cultivados in vitro en condiciones de fotoperodo (16/8 hrs.) a 25 C, en un medio de cultivo suplementado con MS y sacarosa. Para la germinacin, las semillas fueron embebidas con algodn estril y abundante agua por 7-10 das en oscuridad a TA.

3.2 Obtencin del embrin cigtico (EC)

Los embriones cigticos se obtuvieron a partir de semillas cosechadas de plantas cultivadas en el invernadero del CICY, de aproximadamente 6 meses de edad, utilizando como explante EC de semillas de frutos semi-maduros recin colectados, mismos que fueron incubados a 5 C por 24hrs.

3.2.1 Extraccin de semillas de chile habanero Despus del previo reposo a 5C de los frutos se procedi a la extraccin de las semillas realizando un corte horizontal en la superficie sin daar las semillas. Seguidamente teniendo el corte se hace otro pero en forma vertical. Una vez retirado
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la cubierta con el bistur se empieza a extraer las semillas. Ya retiradas todas las semillas se ponen en una caja Petri, ser seleccionada y esterilizada.

Figura 3. Fruto, semillas y embrin cigtico inmaduro. El EC fue utilizado como fuente de explante

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3.2.2 Protocolo para esterilizar semillas de Capsicum chinense Jacq. 1.- Sumergir en solucin de etanol al 70% por cinco minutos en constante agitacin. 2.- Enjuagar con H2O destilada estril tres veces. 3.- Esterilizar con una solucin de cloro al 30% por 15 min. 4.- Enjuagar cuatro veces con H2O destilada estril. 5.-Seguidamente ya desinfestados las semillas en un medio estril se sumergen en agua destilada estril en un micro tubo por tres das a 5C.

3.2.3 Evaluacin de diferentes concentraciones de 2,4-D, TDZ y sacarosa De acuerdo a los resultados obtenidos en la residencia se determin modificar las diferentes concentraciones de RCV para la induccin de la embriognesis somtica de chile habanero (Tabla 2).

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Tabla 2. Panel A y B. diferentes concentraciones de TDZ, 2,4-D. TDZ (M) A 2,4-D (M) 0 4.5 9 18 0 T1 T5 T9 T13 5 T2 T6 T10 T14 10 T3 T7 T11 T15 15 T4 T8 T12 T16

TDZ (M) B 2,4-D (M) 0 4.5 9 18 0 T1 T5 T9 T13 0.175 T2 T6 T10 T14 0.375 T3 T7 T11 T15 1.125 T4 T8 T12 T16

En la (Tabla 2). En el panel A indica las diferentes concentraciones de TDZ (5, 10 y 15 M), 2,4-D (4.5, 9 y 18 M) y sacarosa al 10% utilizadas en tratamientos previos. De acuerdo a los resultados del panel A, se plante modificar la concentracin de TDZ (0.125, 0.375 y 1.125 M) y sacarosa al 3% como se indica en el panel B.

3.2.4 Hipoctilos de Capsicum chinense Jacq., como explantes Para la obtencin de los hipoctilos se desinfestaron semillas maduras de Capsicum chinense Jacq. Variedad naranja San German, se colocaron en cajas Petri con algodn y abundante agua destilada estril para la germinacin, este proceso se

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mantuvo durante 8 das bajo condiciones de oscuridad a 242C. Posteriormente las mismas se dejaron por otros 7 das para la elongacin del hipoctilo con un total de 15 das.

3.3 Induccin a la Embriognesis Somtica

Previo al proceso de induccin se prepararon los medios de cultivo slido con un da de anticipacin, el cual esta suplementado con sales MS, 2,4-D (9.05 M) y sacarosa al 3% modificado de Santana Buzzy et al., 2006-2009., pH de 5.8 seguidamente se esteriliz a una temperatura de 121C, con una presin de 1psi, durante 15 min., fueron dosificados en cajas Petri. Posteriormente se prosigui al corte de los segmentos de hipoctilos de aproximadamente 1cm de longitud y fueron colocados en dichos medios e incubados en el cuarto de oscuridad.

3.4 Obtencin de discos foliares e induccin a la embriognesis somtica

Para la obtencin de los discos foliares se usaron 20 Plntulas de 15 das de edad, cultivadas en medio de mantenimiento (Quiroz-Figueroa et al., 2006), y un segundo medio suplementado con sales MS y sacarosa al 3%. Finalmente, se incubaron por 2 meses bajo condiciones de fotoperodo a una temperatura de 24 2 C.

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Figura 4. Plntulas de chile habanero en diferentes medios de sub-cultivo.

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Las plntulas de la derecha fueron cultivadas en medio MS y las de la izquierda se encuentran en medio de mantenimiento y vitaminas. Al momento de la seleccin de las plntulas de chile habanero para el preacondicionamiento se observ que las que se encontraban en el medio de MM no tenan un buen desarrollo en hojas y se determin usar plntulas sub-cultivadas en medio MS, son con las que contaban con ms explantes foliares para el preacondicionamiento de 14 das. (Figura 4). Posterior al pre-acondicionamiento se determin evaluar dos tiempos 7 y 14 das. Despus de los 7 y 14 das determinados de pre-acondicionamiento de las plntulas se procedi a la obtencin de los discos foliares de aproximadamente 1 cm con ayuda de un sacabocado. Cinco discos foliares fueron colocados en matraces de 250 mL conteniendo 50 mL de medio Yasuda modificado, a un pH de 5.8. Los matraces se incubaron en el cuarto de cultivo bajo condiciones de oscuridad, en un orbitador a 60 rpm.

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Figura 5. Obtencin de discos foliares a partir de hojas de chile habanero.

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Captulo IV
4.1 Resultados y discusin
4.1.1 Evaluacin de la respuesta morfognica de callos generados a partir de embriones somticos inmaduros, ante diferentes concentraciones de 2,4-D, TDZ y sacarosa. 4.1.2 Evaluacin con chile habanero de parmetros reportados en la literatura para el proceso de embriognesis somtica en el gnero Capsicum. La primera estrategia para la evaluacin de protocolos para la embriognesis somtica del chile habanero fue la de replicar protocolos exitosos aplicados a la especie Capsicum annuum, con base en reportes de la literatura; especficamente aquellos en donde se comparan las hormonas TDZ (tratamientos 2, 3 y 4) y 2,4-D (tratamientos 5, 6 y 7) o combinaciones de diferentes concentraciones de ambas (tratamientos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16), todas en presencia de una alta concentracin de sacarosa (10%). Como puede observarse en la Figura 6, en presencia de TDZ no se observaron cambios significativos diferentes al crecimiento de los pices radicular, cotiledonar y caulinar. En los tratamientos que contienen 2,4-D se observ la formacin de pequeos ndulos callosos solo en algunas partes del explante. En los tratamientos con combinaciones de ambas hormonas se puede distinguir una desdiferenciacin celular, hasta la formacin de callos. En ninguno de los tratamientos evaluados se observ la generacin de estructuras embrionarias. Cabe recordar que en estos
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experimentos se us azcar comercial al 10% y las observaciones se hicieron un mes despus de la induccin embriognica. Con base en estos resultados se determin repetir el experimento, pero introducir un par de modificaciones recomendadas en otras publicaciones. En la primera modificacin se subcultivo los explantes a los 8 das posteriores a la induccin embriognica en un medio MS en presencia de BA (8.9 M), de acuerdo a SolsRamos et al. (2010), y se redujo en esta segunda etapa la concentracin de sacarosa comercial al 3%. En la segunda modificacin se subcultiv a los ocho das y se redujo la concentracin de TDZ a
Tabla 3. Diferentes concentraciones de 2,4-D y TDZ. TDZ (M) 0 T1 0 5 T2 10 T3 15 T4

T5 2,4-D (M) 4.5

T6

T7

T8

T9 9

T10

T11

T12

T13 18

T14

T15

T16

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Figura 6. Efecto del tratamiento con RCV sobre la diferenciacin celular.

Los embriones inmaduros fueron aseptizados y cultivados en oscuridad en un medio MS con vitaminas y con las concentraciones de TDZ y 2,4-D mostradas en la tabla. El experimento fue repetido por triplicado y se muestra en cada panel una imagen representativa.

4.1.3 Modificacin I. Adicin de benciladenina y reduccin de la concentracin de sacarosa a explantes pre-tratados. El cultivo de los embriones pre-tratados como se describe en 2.1.1 y subcultivados a los ocho das en presencia de BA mostr resultados diferenciales, de acuerdo con el tipo de RCV y su concentracin utilizada. En embriones testigo cultivados sin RCV (T1) se observ necrosamiento (Figura 7). En embriones cultivados nicamente con TDZ (T2, T3 y T4) se observ la formacin de callo verdoso friable blando. En todos los tratamientos en presencia de 2,4-D, ya sea solo o en combinacin con diferentes concentraciones de TDZ (T5 a T16) (Figura

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7), se observa callos duros de diferente coloracin, desde caf obscuro hasta blancos.
Tabla 4. Diferentes concentraciones de 2,4-D, TDZ aadiendo BA (8.9 M).

TDZ (M) 0 T1 0 5 T2 10 T3 15 T4

T5 2,4-D (M) 4.5

T6

T7

T8

T9 9

T10

T11

T12

T13 18

T14

T15

T16

Figura 7. Efecto de la adicin de BA (8.9 M) sobre el comportamiento de embriones cigticos.

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Los embriones cigticos inmaduros cultivados bajo los mismos tratamientos descritos en la Figura 6 fueron subcultivados a los ocho das a un medio con BA (8.9 M) y sacarosa al 3%. Las observaciones fueron realizadas a los 30 das del subcultivo. Los experimentos se repitieron tres veces y se muestra en cada panel una imagen representativa.

Estos resultados sugieren que el cultivo in vitro de los explantes, con las combinaciones de RCV empleados solamente originaron la formacin de callo, pero estos callos no avanzaron hasta la formacin de estructuras diferenciadas, por lo que decidi modificar el protocolo evaluando una reduccin en la concentracin de TDZ, manteniendo las concentraciones de 2,4-D originales.

4.1.4 Modificacin II. Disminucin de las concentraciones de TDZ y de sacarosa. De acuerdo con los resultados obtenidos con la adicin de BA, el nico cambio observado fue la generacin de callos de diferente coloracin y textura, se determin modificar el protocolo original reduciendo las concentraciones de TDZ (0, 0.175, 0.375 y 1.125 M) y de sacarosa al 3%, manteniendo las concentraciones originales de 2,4-D (descritas en la Tabla 1B) Con estas modificaciones, luego de 7 das de induccin en presencia nicamente de TDZ (T4B, T4C y T4D) se observ un hinchamiento en el hipocotilo y la aparicin de brotes cotiledones sin emisin de races. En los tratamientos con TDZ y 2,4-D (T4E a T4O) se obtuvo desdiferenciacin celular, brotes de cotiledones y brotes de pelos
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radiculares, en menor medida que con las concentraciones mayores de TDZ, en algunos tratamientos.

Tabla 5. Reduccin de TDZ.

TDZ (M) 0 T4A 0 0.175 T4B 0.375 T4C 1.125 T4D

T4E 2,4-D (M) 4.5

T4F

T4G

T4H

T4J 9

T4K

T4L

T4M

T4N 18

T4O

T4P

T4Q

Figura 8. Reduccin de la concentracin de TDZ con respecto al protocolo original.

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El protocolo descrito en la Figura 6 fue repetido con las concentraciones de TDZ mostradas en la tabla. Los experimentos se repitieron tres veces y se muestra en cada panel una imagen representativa.

A los 30 dias posteriores a la induccin, se observ diferenciacin celular en los tratamientos T4B, T4C y T4D, principalmente la aparicin de ndulos y protuberancias. (Figura 9). Por otro lado, en los tratamientos T4E a T4O se observ la presencia de callos de color marrn, transparentes friables. Despus de 77 das, se observ que nicamente en el tratamiento T4D se mantuvo la formacin de estructuras diferenciadas, en algunos explantes se generaron estructuras tipo hoja y en otros la formacin de estructuras parecidas a embriones somticos (Figura 9). No obstante, ninguna de estas estructuras procedi hacia la formacin de embriones somticos.

32

Figura 9. Formacin de estructuras a solo 30 das de induccin con diferentes concentraciones y combinaciones de TDZ y 2,4-D.

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4.1.5 Modificacin al tratamiento T4D Con el tratamiento T4D (TDZ 1.125 M, sin 2,4-D) se obtuvieron los resultados ms promisorios, pero con concentraciones de TDZ superiores a 5 M, se procedi a evaluar un rango de concentraciones de TDZ de 0 (T4D1), 0.560 (T4D2), 1.125 (T4D3) y 2.25 M (T4D4), suponiendo que estas concentraciones podran estar cercanas a las requeridas para inducir la ES en Capsicum chinense. Como puede observarse en la Figura 10, a los 5 das de la induccin, en el tratamiento T4D1 (testigo sin RCV) se observ nicamente el hinchamiento de los embriones cigticos. En los tratamientos T4D2 y T4D4 se observ el hinchamiento del EC, el desarrollo de cotiledones y la presencia de pelos radiculares, mientras que solo en el tratamiento T4D3 se manifest la respuesta obtenida anteriormente (tratamiento T4D, Figura 9).

Figura 10. Resultados obtenidos a solo 5 das de induccin a embriognesis somtica.

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Con base en este resultado, y suponiendo que la accesibilidad del RCV a las clulas del explante podra constituir un factor limitante durante el proceso de diferenciacin, se decidi introducir una modificacin a este procedimiento, transfiriendo a los 20 das posteriores a la induccin una parte de los explantes a medio lquido con las mismas concentraciones de TDZ de 0 (T4D1L), 0.560 (T4D2L), 1.125 (T4D4L) y 2.25 M (T4D5L), con la misma composicin del medio de cultivo, mientras que el resto de los explantes (T4D1, T4D2, T4D4, T4D5) se mantuvieron en el medio semi-slido. Bajo estas condiciones, a los dos meses posterior a la induccin se observ en los tratamientos T4D2, T4D3 y T4D4 la aparicin de hinchamiento, de callos, de estructuras globulares tipo-embrin la generacin y crecimiento de estructuras foliares (Figura 11).

35

Figura 11. Induccin de embriognesis somtica a partir de embriognesis cigticos de chile habanero.

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4.2 Induccin explantes.

embriognica

empleando

hipocotilos

como

Desarrollado como un protocolo testigo en el presente trabajo, se repiti un procedimiento reportado como eficiente para la induccin de embriones somticos de Capsicum chinense (Santana-Buzzy et al., 2009). Para ello, se indujo el proceso de ES a partir de hipoctilos de 1 cm de longitud en medio de cultivo que contiene 2,4-D a una concentracin de 9.05 M, con base en reportes de la literatura. Un mes posterior a la induccin embriognica fue posible distinguir bajo el esteroscpio la formacin de estructuras de color caf, parecidas a burbujas, en las heridas del explante (Figura 12 A). Despus de tres meses se observ que los explantes adquirieron un tono transparente, se generaron lbulos en la epidermis y aparecieron zonas de color caf. Una observacin minuciosa bajo el estereoscopio demostr que las estructuras globulares estaban necrosadas. Por la forma de las estructuras desarrolladas se pens inicialmente que se podra estar obteniendo una respuesta favorable en el proceso de embriognesis; no obstante, estos explantes no llegaron a ningn resultado favorable (Figura 12B).

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Figura 12. Induccin a Embriognesis somtica de explantes de hipoctilo de 1cm.

38

4.3 Induccin embriognica empleando discos foliares como explantes.

La tercera opcin experimental evaluada fue el empleo de discos foliares de 1 cm para la induccin de la embriognesis somtica, siguiendo un protocolo las plantas son pre-acondicionadas en un medio con auxinas, para extraer los explantes e incubarlos en el medio embriognico en medio lquido con BA, en agitacin a 60 rpm, en oscuridad y a una temperatura de 24 C. En este protocolo se evaluaron dos perodos de pre-acondicionamiento, de 7 y 14 das, respectivamente. En ambos tratamientos se observ necrosamiento de los discos foliares. Mientras que en el pre-tratamiento de 7 das se observ la aparicin de callo en la herida del explante, estos no progresaron hacia la diferenciacin y finalmente se necrosaron tambin (Figura 13).

39

Figura 13. Disco foliar de chile habanero, en dos tiempos de pre-acondicionamiento 7 das (izquierda), 14 das (derecha).

40

4.4 Discusin
De acuerdo a los protocolos de la literatura cientfica, se decidi reproducir protocolos reportados para Capsicum chinense por Binzel et al. (2006), SantanaBuzzy et al. (2009); as como para cafeto (Quiroz-Figueroa et al., 2006). En referencia al protocolo de Binzel at al. (1996), se puede mencionar que aunque no se logr obtener embriones somticos en C. chinense, los resultados hasta este momento sugieren que es posible la obtencin de embriones somticos utilizando como explante frutos maduros de C. annuum en el medio siguiente MS+ 2,4-D (4.5M, 18 M) + TDZ (1 M, 10M) + sacarosa (10%). En nuestro caso, con las concentraciones evaluadas de TDZ de 0.560 M, 1.125M y 2.25M se tuvo un xito en la formacin de estructuras tipo globulares y en la formacin de abundantes rganos, posiblemente hojas, hasta la formacin de plntulas. Esto significa que se gener un protocolo exitoso de regeneracin in vitro por morfognesis. Cabe mencionar que las especies son diferentes, la formacin de estructuras y la evolucin de los brotes de acuerdo con los medios con TDZ probados, condujo en nuestro caso a la rpida formacin de brotes. Santana-Buzzy et al. (2009) reportaron un protocolo exitoso para el desarrollo de embriones somticos en medio MS con 2,4-D (9.05M), con sacarosa al 3% en medio lquido, utilizando como explante el hipocotilo. En nuestra mano este protocolo no se pudo reproducir, algo que es reiterativo con los diferentes protocolos

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reportados en la literatura, que al ser replicados en otros laboratorios no son reproducibles. De acuerdo con Quiroz-Figueroa et al. (2006), es posible inducir embriones somticos directamente de la herida de discos foliares de cafeto en un medio de Yasuda modificado, que contiene BA a una concentracin de 1.12 mgL-1. En ese protocolo es muy importante el pre-acondicionamiento de las plantas en un medio conteniendo auxinas, pero en el caso del chile habanero esto tampoco funcion. Los resultados negativos obtenidos replicando estos dos protocolos con nuestra variedad de chile habanero pueden explicarse debido a la diferencia de especies, al origen del explante y el estado fisiolgico de las plntulas que se obtuvieron dichos explantes.

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CAPTULO V
5.1 Conclusin
Con base a nuestro resultado, se puede concluir que para la especie Capsicum chinense Jacq., especficamente de la variedad Akil, es mejor emplear como explante el embrin cigtico semi-maduro para la induccin de la embriognesis somtica, en un medio MS semi-slido o lquido adicionado del fitorregulador thidiazuron en concentraciones de alrededor de 1 M. Bajo estas condiciones, se puede mencionar que se obtienen estructuras globulares a partir de las cuales se obtiene la formacin de hojas y posteriormente de plntulas. Por lo tanto se puede recomendar analizar modificaciones en la concentracin de los fitorreguladores, as como en la sacarosa, en las etapas tempranas se obtienen estructuras globulares, para analizar la posibilidad de generar embriones en lugar de rganos.

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