TEMA 3.

TCNICAS INMUNOQUMICAS

CONCEPTO DE ANTIGENO Y ANTICUERPO

TEMA 3. TCNICAS INMUNOQUMICAS

Tema 3. REACCIONES INMUNOLGICAS Y TCNICAS INMUNOQUMICAS

Concepto de antgeno y anticuerpo Reacciones antgeno-anticuerpo Tcnicas inmunoqumicas: - El anticuerpo como reactivo: reactivos policlonales reactivos monoclonales - Ttulo, Afinidad y Especificidad del anticuerpo como reactivo - Reactividad cruzada - El antgeno como variable analtica Fases de la reaccin antgeno-anticuerpo - Primera fase - Segunda fase o fase indicadora: Inmunoprecipitacin Inmunoelectroforesis Inmunonefelometra Inmunoanlisis con indicadores marcados Ensayos de unin competitiva

ANTGENO: Sustancia que induce una respuesta inmune. La respuesta inmune puede ser un anticuerpo (respuesta humoral) o la generacin de clulas sensibilizadas (respuesta celular). Los HAPTENOS son antgenos incompletos que no producen una respuesta inmune por s solos, pero s reaccionan con anticuerpos. El DETERMINANTE ANTIGNICO es la porcin de antgeno que interviene en la reaccin con un anticuerpo. ANTICUERPO: Protena que se combina especficamente con un antgeno

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REACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO
Afinidad del anticuerpo: Fuerza de unin de un anticuerpo con un nico determinante antignico. Es funcin de la suma de fuerzas intermoleculares, no covalentes y de corto alcance (fuerzas electrostticas, uniones de H2, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofbicas. La unin antgeno-anticuerpo es una reaccin reversible: K1 Ag + Ac Ag.Ac K2 [Ag.Ac] K1 ------------------ = ------ = Ka (cte de asociacin) [Ag] [Ac] K2

REACCIONES DE PRECIPITACIN ANTGENO-ANTICUERPO

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TCNICAS INMUNOQUMICAS
El anticuerpo como reactivo: reactivos policlonales reactivos monoclonales - Ttulo: cantidad de anticuerpo disponible para su reaccin en un mtodo inmunolgico especfico. Es la mxima dilucin de anticuerpo que da una reaccin detectable para un mtodo especfico y vara con el procedimiento inmunolgico. - Afinidad: fuerza de unin de un anticuerpo con el antgeno en una reaccin antgeno-anticuerpo. - Especificidad: designa la capacidad del anticuerpo para restringir su reaccin a un grupo especficamente definido de molculas. - Reactividad cruzada: reaccin residual entre el reactivo-anticuerpo y un antgeno no superfluo estrechamente relacionado

FASES DE LA REACCIN ANTGENO-ANTICUERPO

- Primera fase

- Segunda fase o fase indicadora: . Inmunoprecipitacin . Inmunoelectroforesis . Inmunonefelometra . Inmunoanlisis con indicadores marcados: marcadores radiactivos, enzimticos y fluorescentes

El antgeno como variable analtica

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INMUNOELECTROFORESIS

INMUNOELECTROFORESIS

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INMUNOELECTROFORESIS ROCKET DE LAURELL

INMUNOELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

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CONTRAINMUNOELECTROFORESIS

INMUNOANALISIS CON INDICADORES MARCADOS

NO COMPETITIVOS. TIPO SANDWICH.

* marcadores radiactivos, enzimticos y fluorescentes

Ag + Ag Ag

Ag

* *

Ag

Ag

Antgeno (variable analtica) Anticuerpo unido a una superficie slida

Anticuerpo marcado

Respuesta *

[Ag]

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ENSAYOS DE UNIN COMPETITIVA

Mtodos analticos in vitro basados en la unin reversible, no covalente, de una molcula pequea o ligando con una protena de unin especfica protena de unin + ligando protena de unin : ligando

ENSAYOS DE UNIN COMPETITIVA

Ac + L* + L AcL + Ac L*
Ac + L* AcL* Ac + L* + L AcL* + AcL
(50%) (50%)

Ac = anticuerpo L = Ligando (antgeno) L*= Ligando marcado Ac + L* + 3L AcL* + AcL

(25%) (75%)

Ac + L* + 2L AcL* + AcL
(33%) (66%)

Ac + L* + 4 L AcL* + AcL
(20%) (80%)

anticuerpo-reactivo antgeno (hapteno)

(100%)

variable analtica Hapteno: molcula pequea que no puede por s sola provocar una respuesta inmune, pero puede generar anticuerpos cuando se acopla con molculas grandes. Suposiciones ideales: Anticuerpos y Antgenos son homogneos y su interaccin reversible alcanzar el equilibrio El marcador del antgeno no interfiere en la interaccin antgeno-anticuerpo Slo se pueden formar complejos 1:1 Los complejos formados se pueden separar fsicamente del antgeno libre marcado

L* (50%) AcL*

L* (66%)

L* (75%) L*

L* (80%)

CURVA DOSIS-RESPUESTA

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ENSAYOS DE UNIN COMPETITIVA

Marcadores radiactivos: las marcas radioisotpicas slo pueden utilizarse en sistemas de inmunoanlisis heterogneo. El radioistopo debe acoplarse fcilmente al ligando y su emisin debe ser fcil de detectar. Ejemplos: 125I, 57Co, 14C, titrio. Enzimas: deben poseer una elevada actividad especfica y debe acoplarse fcilmente al ligando sin que haya prdida significativa de su actividad. Ejemplos: peroxidasa, fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucosa oxidasa. Marcadores fluorescentes: pueden unirse al ligando y seguir emitiendo fluorescencia con un mayor grado de eficiencia. Es til que las de excitacin y emisin estn bien separadas. Ejemplos: ac. 1-anilino-8-naftalensulfnico, ac. dimetilamino-naftalensulfnico, fluorescena, rodamina, umbeliferona.

MARCADORES RADIACTIVOS. RADIOINMUNOANLISIS (RIA)

AcL Ac + L + L
125I

Ac-L AcL
125I

AcL*

[Ligando]

L* Ensayos heterogneos: requieren que el ligando marcado unido al anticuerpo (AcL*) sea separado fsicamente del ligando marcado libre (L*) Ensayos homogneos: no requieren separacin fsica del ligando marcado unido al anticuerpo (AcL*)y el ligando marcado libre (L*)
HETEROGNEO [Ligando]

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MARCADORES RADIACTIVOS. ENSAYOS INMUNORADIOMTRICOS (IRMA)

MARCADORES ENZIMTICOS. ENZIMOINMUNOANLISIS CON INMUNOADSORBENTES (ELISA)

HETEROGNEO

Ac-L Ac-L
AcL*

Ac + L + L Ac-L

HETEROGNEO

L + L + Ac L-Ac + L-Ac
125I 125I

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MARCADORES ENZIMTICOS. ELISA INMUNOMTRICO

MARCADORES ENZIMTICOS. ENZIMOINMUNOANLISIS HOMOGENEO (EMIT)

L + L + Ac

L-Ac + L-Ac S P

HETEROGNEO

HOMOGNEO

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MARCADORES FLUORESCENTES. FLUOROINMUNOANLISIS CON SUSTRATO MARCADO (SLFIA)

MARCADORES FLUORESCENTES. FLUOROINMUNOANLISIS DE POLARIZACIN (FPIA)

HOMOGNEO

HOMOGNEO

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CARACTERSTICAS DE LOS ENSAYOS DE UNIN COMPETITIVA