INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS EN SALUD PUBLICA DIRECCION EJECUTIVA DE LABORATORIOS DE REFERENCIA DIVISION DE PATOLOGIA Y PATOLOGIA CLINICA

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO EN EL DIAGNOSTICO BIOQUIMICO

SEGN NORMA INTERNACIONAL ISO/FDIS 15189:2000

MINISTERIO DE SALUD LIMA-PERU

INDICE

INTRODUCCION................................................................................3 SECCION 1 Generalidades.....................................................................................4 SECCION 2 Bioseguridad.......................................................................................6 SECCION 3 Recoleccin de muestras de sangre...................................................11 SECCION 4 Acondicionamiento, Preservacin y Transporte de Muestras............18 SECCION 5 Metodologa e Instrumentacin..........................................................21 SECCION 6 Procedimientos ..................................................................................33 SECCION 7 BIBLIOGRAFIA................................................................................. 107

ANEXOS.......................................................................................... .109

INTRODUCCION

La Bioqumica como espejo molecular de la vida. Con esta cita queremos atraer su atencin hacia el concepto de esta enorme disciplina, centro importante del conocimiento actual y arma fundamental para desentraar los misterios metablicos celulares. El Laboratorio, como institucin de apoyo diagnstico e investigacin, mantiene un enorme nexo con esta actividad, desarrollando en el quehacer diario numerosas pruebas relacionadas a componentes derivados de las diversas rutas metablicas con significado clnico. De las buenas prcticas laboratoriales, surgiran reportes adecuados que ayudaran al personal mdico y de salud en la toma de decisiones. El presente Manual de Procedimientos recopila informacin bsica para los pasos tcnicos en diversos ensayos de proceder comn a la mayora de laboratorios de la red. La intencin es establecer uniformidad en ciertos criterios que permitan entender los principios metodolgicos de las pruebas, las diferencias que pueden haber entre ellas y la instrumentacin diversa para tales fines. Se ha respetado la arquitectura que los manuales deberan seguir en este caso, segn las normas contenidas en el documento ISO/FDIS 15189. Sin embargo, hemos credo conveniente adelantar dichos procedimientos con explicaciones generales sobre Recolecin de Muestras, Metodologa Instrumental y Bioseguridad, conocimientos bsicos durante el trabajo preanaltico y analtico. La extensin de los mismos es breve y dirigida al rea; en lneas generales cada uno de estos tpicos merece manuales independientes. Como es de conocimiento al personal que labora en un laboratorio de ensayos, no es posible generalizar un nico procedimiento. Existiendo en la actualidad diversas alternativas de metodologas e instrumentacin, sera muy difcil acercar la realidad particular de cada laboratorio de la red, la cual depende de recursos especficos, funciones, influencia poblacional y otras variables conocidas de nuestra desigual infraestructura. Desde esa perspectiva, hemos trabajado en algunos de los analitos con mtodos estndar internacionales y que, intuimos , son utilizados por la mayora de entidades. Para otro grupo de ensayos, solo hemos sealado lineamientos generales de los principales mtodos, sin desarrollar ninguno en particular, evitando la pretensin de inclinar la balanza hacia alguno de ellos. Finalmente, creemos en la flexibilidad de esta primera entrega, la cual nos permitir recoger el aporte de todos los involucrados en esta rea y enriquecer con ello, futuras revisiones del presente trabajo.

Lima, Julio de 2003.

SECCION 1:

GENERALIDADES

1.1 FINALIDAD

El Manual de Procedimientos de Laboratorio en el diagnstico Bioqumico, tiene por finalidad presentar las actividades analticas relacionadas a las principales pruebas del rea de Qumica Clnica, reuniendo criterios de aceptacin internacional y enmarcadas de acuerdo a la gua ISO/FDIS 15189. Es propsito de la norma que los laboratorios de la red establezcan su propia documentacin de acuerdo al modelo impartido en el presente escrito y en relacin a su infraestructura y funciones. 1.2 ALCANCE Para aplicacin y modelo en los centros dependientes del Instituto Nacional de Salud y en la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica . 1.3 DOCUMENTOS DE REFERENCIA 1.3.1 International Organization for Standardization. ISO / FDIS 15189. 2000. Quality Management in the Clinical Laboratory. 2001. 1.3.2 Ministerio de Salud. Manual de Procedimientos de Laboratorio . Laboratorios Locales I. Laboratorios Locales II. Lima, 1999. 1.3.3 Ministerio de Salud. Manual de Procedimientos de la Red de Laboratorios de Primer Nivel de Atencin, Lima, 2000.

1.4 TERMINOS Y ABREVIATURAS 1.4.1 Absorbancia.Propiedad de una molcula o cojunto de ellas por retener parte de las longitudes de onda deun espectro de luz, no permitiendo su pasaje. 1.4.2 Acondicionamiento. Proceso por el cual se aseguran todas las propiedades de una muestra, permitiendo su correcto anlisis, desde la recoleccin hasta su ingreso al rea de anlisis. 1.4.3 Acoplamiento.Variante en una reaccin enzimtica en la que se aprovecha la formacin de un producto en una primera reaccin , para convertirlo en sustrato de una segunda a la cual se unir un componente que siga reaccionando con la primera. 1.4.4 Anlisis. En la prctica laboratorial, la realizacin tcnica de un proceso, bsicamente la determinacin de algn compuesto. 1.4.5 Analito. Elemento capaz de ser analizado o determinado. 1.4.6 Catalizador.Elemento qumico capaz de modificar la velocidad de una reaccin, bsicamente acelerarla. Ejemplo : enzimas. 1.4.7 Coenzima. Molcula orgnica que unida a una enzima le permite mejorar su accin. 1.4.8 Componente. Molcula o conjunto de molculas que logran una unidad y pueden estar independientemente en una sustancia o asociado a otros .

1.4.9 Corrida. Trmino utilizado en la prctica laboratorial, la cual denota el proceso poe el cual se determinan concentraciones de un analito enun mismo tiempo o en serie. 1.4.10 Cromgeno. Sustancia o componente qumico capaz de virar hacia una tonalidad de color dentro de una reaccin qumica. 1.4.11 Enzima. Protena que cataliza una reaccin qumica. 1.4.12 Extincin. Aumento en la velocidad de desaparicinde un sustrato o producto. 1.4.13 Filtro. Dispositivo que al paso de todo el espectro de la luz, permite separar slo una banda de longitudes de onda de la misma. 1.4.14 Kit. Denominacin de un set contenedor de diversos productos reactivos y materiales necesarios para un anlisis. 1.4.15 Linealidad. Capacidad de un anlisi de permitir crecimientos progresivos y lineales a medida que aumenta la concentracin del analito. 1.4.16 Macromolcula. Se dice de las molculas de alto peso molecular, compuestos por distintos grupos qumicos, formando una unidad. Dichos grupos qumicos pueden ser similares entre s o distintos. 1.4.17 Mtodo. Proceso o conjunto de procesos que permiten realizar una actividad, en este caso un anlisis. Las tcnicas son variaciones para poner en la prctica un mtodo. 1.4.18 Monocromador. Dispositivo que permite seleccionar una determinada longitud de onda con menos amplitud de banda que un filtro convencional. 1.4.19 Preservacin. Resguardo de las condiciones originales de los componentes qumicos en una solucin. 1.4.20 Prisma. Vidrio o cuarzo con caras laterales que al girar permite reflejar una longitud de onda (luz) especfico.Se usa en espectrofotmetros. 1.4.21 Reproducibilidad. Capacidad de verificar una misma concentracin bajo el mismo mtodo de anlisis, pero con anlista distinto y en un momento diferente de la determinacin original. 1.4.22 Repetitibilidad : Capacidad de mantener la determinacin de una concentracin anltica bajo las mismas condicones de analista, equipo y momento. 1.4.23 Standard. Solucin o sustancia pura de concentracin conocida. 1.4.24 Suero control. Solucin de analitos que se utiliza en el control de precisin. La concentracin obedece a una media y a un rango de valores calificados a ambos lados de esta media. 1.4.25 Transmitancia. Pasaje de luz o de longitudes de onda no retenidas al atravesar un cuerpo o compuesto molecular. 1.4.26 Trasvase. Accin de transportar una porcin de un lquido o un slido de un contenedor a otro distinto.

SECCION 2 : BIOSEGURIDAD

2.1 INFORMACION GENERAL Referirse al Manual de Normas de Bioseguridad (Serie de Normas Tcnicas No. 18 ) del Instituto Nacional de Salud, para la consulta oportuna de las medidas establecidas . En esta seccin, se daran indicaciones generales para el sector de Laboratorio de Bioqumica. 2.2 RESPONSABILIDADES La bioseguridad del laboratorio compromete a todo el personal; se deriva de esta afirmacin que cada empleado debe comunicar a sus superiores cualquier acto o condicin que atente contra ella, as como contribuir a su cumplimiento. Sin embargo, es aconsejable que el director del Laboratorio o un designado se encarguen de la supervisin de las normas. 2.3 PRINCIPALES MEDIDAS EN LABORATORIOS DE BIOQUIMICA 2.3.1 Proteccin Individual Facilitar equipo de proteccin necesario y mantenerlo en buenas condiciones de higiene y seguridad. Este equipo incluye : mascarillas, gafas de proteccin ocular y batas o mandiles apropiados, adems de una buena provisin de guantes. La infrestructura tomar en cuenta la necesidad de regaderas o suministros de agua potable. 2.3.1 Almacenamiento de Lquidos Inflamables

Utilizar recipientes adecuados, perfectamente identificados y dispuestos en armarios o mobiliario de seguridad. Disponer seales en el rea de almacenamiento (ver sealizaciones internacionales adelante) y extintores suficientes y en vigencia. 2.3.2 Saneamiento del medio

Mantener limpieza e higiene en mobiliarios, zonas de trabajo, pisos, corredores, indumentaria. Disponer de adecuados recipientes de basura y mantenerlos cerrados. Destinar espacio suficiente para la alimentacin del personal, as como vestidores para comodidad de los mismos. 2.3.3 Prevencin de Incendios y Riesgos Elctricos

Mantener como requisitos mnimos : Capacitacin del personal en los tpicos pertinentes. Sealizaciones adecuadas para las vas de escape en caso de incendios o siniestros. Identificar los extintores porttiles y mantenerlos en buen uso. Utilizar cables de tres conductores (con toma a tierra) en todas las instalaciones elctricas.

Se aconseja el uso de tomas de corriente de un solo enchufe, evitando las conexiones mltiples.

2.4 LAS REGLAS DE BIOSEGURIDAD INVIOLABLES 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4 2.4.5 2.4.6 Lavado de manos del personal despus de haber manipulado material infeccioso. No permitir pipetear con la boca Prohibir al personal comer, beber o fumar en zonas de trabajo. Evitar el uso de cosmticos en reas de trabajo. No guardar alimentos o bebidas en los refrigeradores de trabajo. Mantener el laboratorio limpio y aseado. Descontaminar superficies de trabajo una vez al da. 2.4.7 Usar batas, uniformes, mandiles en el ambiente de labores. No trasladar dicha indumentaria fuera del mismo. 2.4.8 Autorizar el paso a la zona de trabajo al personal del mismo y a todo aquel que sea informado de los requisitos para su permanencia en el lugar. Mantener las puertas cerradas. 2.4.9 No permitir nios en zonas de trabajo. 2.4.10 Prohibido absolutamente el ingreso de animales, con excepcin de alguna finalidad dentro de las funciones del laboratorio. 2.4.11 Utilizar guantes en todos los trabajos que impliquen relacin directa con material sanguneo. 2.4.12 Esterilizar en autoclave el material de desecho permisible de dicha accin, antes de su eliminacin. 2.5 DESINFECCION

Los desinfectantes recomendados para el trabajo general de laboratorio son: 2.5.1 Cloro: Hipoclorito sdico. El cloro es un desinfectante universal, activo contra todos los microorganismos. En general se utiliza en forma de hipoclorito sdico, con diversas concentraciones de cloro libre. Se trata de un agente oxidante, potente corrosivo para los metales. Las soluciones de hipoclorito se degradan poco a poco, por lo que es necesario prepararlas con frecuencia. Como desinfectante general para toda clase de trabajos de laboratorio, se utilizar una concentracin de 1gr/L (1000 ppm) de cloro libre. En los casos de salpicaduras de sangre o en presencia de material orgnico en cantidad apreciable, para la desinfeccin se debe recurrir a una solucin ms concentrada de 10 g/L (10 000 ppm), de cloro libre. 2.5.2 Compuestos fenlicos. Muchos compuestos fenlicos que constituyen la base de ciertos nmero de desinfectantes corrientes. Los compuestos fenlicos pueden emplearse cuando no se dispone de hipocloritos, diluyndolos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. 2.5.3 Yodo y yodoformos. La accin de estos desinfectantes es parecida a las de los hipocloritos; las superficies limpias pueden tratarse eficazmente con soluciones que

contengan 0.075 g/L (75 ppm) de yodo libre. Los yodoformos pueden diluirse en alcohol etlicos para el lavado de manos o como esporicida. 2.5.4 Alcohol etlico y alcohol isopropilico. Estos desinfectantes son de menos eficacia que los ya mencionados.

2.6 ELIMINACION DE DESECHOS 2.6.1 Los desechos no contaminados se introducen en bolsas negras y pueden eliminarse con la basura corriente. 2.6.2 Los objetos agudos y cortantes, como las agujas hipodrmicas y jeringas, deben colocarse en recipientes rojos con paredes que no puedan traspasarse fcilmente. Cuando estos estn llenos, se colocan en bolsas anaranjadas para desechos contaminados y se incineran. 2.6.3 El material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilizacin, se coloca en recipientes impermeables poco profundos, que contengan una cantidad de desinfectante suficiente para cubrir el contenido. Los recipientes se colocan luego en autoclave. No se efecta ninguna limpieza previa; cualquier limpieza o reparacin que sea necesaria se hace despus del paso por el autoclave. 2.6.4 Los materiales contaminados para eliminacin como todos los cultivos, sangre y sueros suelen esterilizarse en autoclaves. La eliminacin de las muestras de suero es muy importante. Cada rea debe tener recipientes de basura para descartar las muestras. Es importante tener presente que al descartar los desechos no producir aerosoles.

2.7 SEALIZACIONES PRINCIPALES)

INTERNACIONALES

(ETIQUETADOS

Los reactivos comerciales tienen en sus etiquetas smbolos de peligrosidad ,riesgos especficos y consejos de prudencia, para la interpretacin de estos smbolos acudir al catlogo que debe proporcionar la casa comercial.

Smbolos de peligrosidad y su significado Pictograma Indicacin del peligro Clasificacin Precaucin

E Explosivo Segn resultados experimentales Evitar choque, percusin, friccin segn la prescripcin de declaracin formacin de chispas, fuego y y control de la ley de productos accin del calor. qumicos (R.F.A.).

O Comburente

Segn los resultados de los ensayos Evitar cualquier contacto con considerando la inflamabilidad y sustancias combustibles. el peligro de explosin. Peligro de inflamacin! Los incendios pueden ser favorecidos y dificultado su extincin.

F+ Extremadaabiertas,

Lquidos con punto de inflamacin

Mantener

lejos

de

llamas

mente inferior a 0C y punto de ebullicin inflamable de mximo 35C; gases, mezclas de gases (aunque estn presentes en forma licuada), que con el aire a presin normal tienen punto de encendido.

chispas y fuentes de calor.

F Fcilmente abiertas, inflamable

Determinados perxidos orgnicos; lquidos con punto de inflamacin inferior a 21C, pero no extremadamente inflamables; sustancias slidas que son fciles de inflamar, de continuar quemando por si solas o arder sin llama por la accin de una fuente de encendido; liberacin de sustancias fcilmente inflamables por la accin de la humedad u otras propiedades.

Mantener

lejos

de

llamas

chispas y fuentes de calor.

Pictograma

Indicacin del peligro

Clasificacin

Precaucin

T+ Muy txico T Txico

Tras resultados de ensayos de toxidad aguda oral, dermal, inhalativa, as como por indicios considerables de daos graves para la salud, posiblemente irreversibles, por absorcin nica, repetida o de larga duracin.

Evitar cualquier contacto con el cuerpo humano, ya que no se pueden descartar graves daos para la salud, posiblemente de consecuencias mortales. Se hace referencia especial a la accin cancergena o al riesgo de alteraciones genticas o de accin teratgena de diversas sustancias.

Xn Nocivo de

Segn resultados de ensayos de toxicidad aguda oral, dermal, inhalativa as como por indicios considerables

Evitar el contacto con el cuerpo humano, tambin la inhalacin vapores. Con posibles daos

para de posibles daos para la salud, la salud en caso de empleo no posiblemente irreversibles, por adecuado. En algunas sustancias absorcin nica, repetida o de larga no es posible descartar totalmente duracin. cancergena,alteracin gentica o teratgena. Se hace referencia a ello, igualmente al peligro de sensibilizacin. una accin

C Corrosivo

Segn intensidad de la destruccin de piel intacta sana durante tiempos de accin definidos.

Evitar el contacto con los ojos, la piel y la ropa mediante medidas protectoras especiales. No los vapores.

inhalar

Xi Irritante

Claros daos de los ojos o irritacin de la piel, que se mantienen como mnimo 24 horas posteriores al tiempo de accin, o una irritacin clara de las vas respiratorias. Se hace referencia especial a una posible sensibilizacin por contacto con la piel.

Evitar el contacto con los ojos y la piel. No inhalar los vapores. Si clasificado R43 posible.

sensibilizacin

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SECCION 3: RECOLECCION DE MUESTRAS DE SANGRE

3.1 DISPOSICIONES GENERALES Ayuno : Para ciertos estudios que requieren muestras sanguneas, se deben conservar condiciones de ayuno. Dicho tiempo puede variar entre 8 horas a 12 horas. Sin embargo, otros ensayos no requieren esa condicin. En los procedimientos se cita dicha necesidad en el apartado correspondiente a la descripcin de la muestra primaria. La sangre debe recolectarse en tubos de vidrio o plstico limpios. La esterilidad es una condicin ideal aunque no absoluta en el trabajo bioqumico(esto se logra con tubos al vaco, aunque podran no ser disponibles). La contaminacin por bacterias podra acarrear la metabolizacin de ciertos analitos (ej. glucosa). En caso de recolectar la sangre con jeringa y aguja estriles, los tubos deben llenarse con celeridad, evitando movimientos bruscos que acarreen roturas de glbulos rojos y posterior hemlisis. Luego de la recoleccin de la sangre, debe permitirse que se coagule antes de la centrifugacin y separacin del suero. Para la totalidad de los procedimientos descritos en este manual, bastar con la utilizacin de este componente sanguneo. Sin embargo, para el manejo de muestras para ensayo de Hemoglobina glicosilada y en la eventualidad de usarse como alternativa el plasma, se recomienda someter los tubos a maniobras de inversin para lograr el mezclado correspondinte con el anticoagulante, evitando la formacin de cogulos.

3.2 ANTICOAGULANTES PARA RECOLECCION DE MUESTRAS Los anticoagulantes son sustancias que previenen la formacin de cogulos. Existen diferentes tipos de ellos en polvo o lquidos. Seleccionese el anticoagulante apropiado segn el estudio a realizarse. Describiremos brevemente los disponibles a manera de informacin, no siendo necesarios en el trabajo bioqumico, con excepcin de las muestras para ensayos de Hemoglobina glicosilada. 3.2.1 EDTA (Etilen Diamino Tetra Acetato): Usado para estudios celulares, es factible su su uso en el trabajo bioqumico de algunos componentes (ej. glucosa). 3.2.2 Citrato de Sodio : Usado en concentraciones al 3.8%, generalmente para estudios de coagulacin. 3.2.3 Heparina : Se utiliza en presentaciones con concentraciones de litio y sodio. Para estudios bioqumicos es preferible el uso de heparina con litio. 3.2.4 Oxalatos : De menor uso en la actualidad, se restringe a los ensayos de glucosa. 3.2.5 Cdigos de colores internacionales : Adoptados por muchas compaas que proveen los tubos con anticoagulantes para su uso cmodo, pues permiten una recoleccin prefijada de sangre, la cual se mezclar con la correspondiente cantidad de anticoagulante. Una vez realizada la toma de muestra, se recomiendan 10 a 15 inversiones del tubo para su homogenizacin. Tapa Roja : Sin Anticoagulante Tapa Violeta : Con EDTA. Tapa Celeste : Con Citrato de Sodio. Tapa Verde o Blanca : Con Heparina. Tapa Gris : Con Oxalatos. 11

Material para Toma de Muestras : Guantes Jeringa, aguja Tubo recolector Algodn 70 Alcohol Ligadura Lancetas Capilares Venditas Contenedor de desechos

3.3 GUIAS BASICAS DE ASEPSIA 3.3.1 Utilizar siempre guantes y mandil o bata para la obtencin de muestras. Los guantes deben desecharse y ser cambiados por un nuevo par despus de atender a cada paciente. Lavarse prolijamente las manos antes y despus de la atencin de un paciente. Todas las agujas, jeringas y de preferencia tubos de recoleccin deben ser estriles. Al utilizar una aguja, esta no debe haber tocado ningn elemento antes de la puncin de la piel. Si esto llega a ocurrir, utilice una nueva aguja. Desinfectar adecuadamente el rea de puncin con alcohol 70. Pueden utilizarse otras soluciones antispticas como el yodo, pero en condiciones ideales use la primera. Jams toque el sitio de puncin luego de la desinfeccin.

3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5

3.3.6

3.4 REVISION DE PETITORIOS U ORDENES MEDICAS 3.4.1 Examine con cuidado el petitorio u orden, asegurndose haber entendido la solicitud. En caso contrario, pregunte a su superior o intente comunicarse con el mdico tratante. No es aconsejable guiarse de las indicaciones del paciente. Si la orden le induce a pensar en incongruencias, incompatibilidades o amerita a su juicio un riesgo para el paciente, consulte el caso con su superior inmediato o con el mdico tratante.

3.4.2

3.5 LOS TIEMPOS EN LA TOMA DE MUESTRAS 3.5.1 El primer tipo de tiempo se denomina tiempo simple y es parte de la mayora de estudios, pues amerita una recoleccin con una sola puncin. 3.5.2 El segundo tipo se describe como tiempo mltiple y pertenece a la recoleccin de varias muestras y, por lo tanto, otras tantas punciones, para un mismo examen. Entre nuestros procedimientos, destaca el correspondiente a la Prueba de Tolerancia Oral a la Glucosa. 3.5.3 Tmese en cuenta las siguientes indicaciones en ambos tipos de tiempos de toma de muestras :

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Las condiciones de preparacin del paciente deben ser escrupulosamente respetadas. Preguntar por la ingesta de medicamentos; algunos de ellos interfieren en las pruebas. En toma de muestras de tiempo mltiple, dar las recomendaciones pertinentes al paciente mientras espera la siguiente puncin (ej. : evitar ingerir alimentos o limitar la actividad fsica). Se sugiere que en tomas de tiempo mltiple, la persona que inicialmente dio las indicaciones al paciente y recolect la primera muestra, sea la responsable de respetar los horarios indicados.

3.6 RECONOCIMIENTO DEL PACIENTE 3.6.1 Reconozca al paciente mediante un saludo agradable. Identifquese ante l como la persona de experiencia que va a recolectar la muestra. Asegrese que el procedimiento que va a efectuar lo har en el paciente indicado. Para ello no basta la identificacin de nmero de historia y cama. De ser posible, hable con el paciente para averiguar sus nombres y apellidos. Transmita confianza y seguridad, explicando calmadamente el procedimiento que realizar. Si el paciente tiene dudas, trate de absolverlas: disminuir su natural temor. No extienda la conversacin ms all de lo pertinente. Dialogos sobre temas ajenos a la preocupacin del paciente, podran perturbarlo. Termine su procedimiento, indicando lo necesario frente a segundos muestreos, horarios de entrega de resultados y todo aquello que Ud. pueda y le sea permitido resolver.

3.6.2

3.6.3

3.6.4 3.6.5

3.6.6

3.7 SELECCIN DEL SITIO DE PUNCION 3.7.1 Acomode al paciente de forma segura y confortable. 3.7.2 No practique ninguna puncin con el paciente en posicin de pie. 3.7.3 Elija una extremidad en la que no exista ninguna venoclisis, herida o lesin reciente, comunicaciones arteriovenosas, heridas o procedimientos quirrgicos y cualquier eventualidad que le haga dudar de la necesidad de punzar dicha zona. Elija una vena que tenga dos caractersticas : visible y palpable. Puede ubicarla en la fosa antecubital del antebrazo, por donde surcan las venas ceflica y braquial. Si la vena no es muy visible, intente realizar masajes desde la mueca hasta el codo. Si no hay contraindicacin, observe siempre ambas extremidades para elegir el mejor sitio de puncin Ajuste una ligadura unos 2- 4 dedos por encima del sitio elegido. La presin debe ser media, lo suficiente para evitar presiones mayores que causaran hemlisis, colapso venoso o dolor.

3.7.4

3.7.5

13

3.7.6

Previa a la puncin limpie la zona indicada con movimientos circulares y del centro hacia fuera.

3.7.7

Dirija la aguja en un ngulo de 15-30 con respecto a la superficie del brazo. Punze en forma directa a travs de la piel y hasta el lumen de la vena.

3.7.8

Terminada la coleccin , retire suavemente la aguja del brazo del paciente, aplicando una gasa compresiva o torunda de algodn en el sitio de puncin.

3.7.9

Acabado el procedimiento, indquele al paciente que debe conservar la presin, ejerciendo hemostasia por unos 5 minutos. Coloque finalmente una banda adhesiva(vendita o curita) sobre la herida de la puncin.

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3.7.10 Si el sangrado no se detiene, aplique presin sobre la zona durante 10 minutos adicionales. Si el problema persiste, consulte con el superior inmediato o mdico tratante. 3.7.11 Deposite y destruya todo el material desechable en los recipientes diseados para tal propsito. Este acto de destruir el material frente al paciente, aumenta su confianza en las bondades y buenas prcticas de laboratorio. 3.7.12 Finalmente, y muy importante, termine su trabajo etiquetando e identificando los tubos recolectados antes de atender una nueva tarea. 3.8 PUNCION EN UN DEDO 3.8.1 Ciertos examenes y ciertas condiciones del paciente ameritan la extraccin de sangre mediante la puncin de la yema de un dedo. 3.8.1 Aprete el pulpejo del dedo seleccionado de manera que muestre congestin.Los dedos de eleccin deberan ser el 3 4 de la mano no dominante. 3.8.2 Desinfecte la zona. 3.8.3 Tome una lanceta nueva y estril desechable y realice una puncin rpida y segura en la cara lateral. 3.8.4 Recolecte las gotas de sangre necesarias al interior de un capilar o colector especfico para estos casos. Permita que las gotas de sangre fluyan libremente; no es aconsejable presionar el pulpejo del dedo en el intento de obtener la muestra. Dicha accin puede mezclar lquidos tisulares junto a la gota de sangre. 3.8.5 Terminada la recoleccin, proporcione al paciente una gasa para rodear el pulpejo por dos minutos hasta detener el sangrado. 3.8.6 Elimine todo el material desechable. 3.8.7 Etiquete apropiadamente los contenedores usados en la recoleccin. 3.9 RECOLECCION DE MUESTRAS EN NIOS 3.9.1 3.9.2 3.9.3 Siga adecuadamente las indicaciones propuestas anteriormente. Realize el procedimiento mediante la ayuda de compaeros de trabajo. Sujete firmemente el brazo del nio, incluso cuando ste no oponga resistencia. La natural reaccin del nio es retirar bruscamente el brazo al sentir la puncin, lo cual podra ocasionar heridas en el mismo y prdida de la maniobra.

3.10 RECOLECCION DE MUESTRAS DE SANGRE EN BEBES 3.10.1 El sitio recomendado de puncin, se encuentra graficado en el dibujo inmediato. Pertenece al taln del beb o infante.

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3.10.2 Precaliente el taln del beb utilizando toallas calientes o alguna manta trmica que permita una temperatura de 42C por 3 a 5 minutos. Esto permitir la capilarizacin de la sangre y el flujo de la misma a la zona de puncin. Mantenga la precaucin de no lastimar al nio con este proceder. 3.10.3 Limpie la zona y mantenga firme el pie del infante para evitar sacudidas bruscas. 3.10.4 Use una lanceta estril y punze en las porciones laterales del taln (no en el centro), en sentido contrario a los pliegues del taln, evitando que la gota de sangre resbale hacia abajo, usando estos pliegues como camino. 3.10.5 Limpie la primera gota de sangre y permita la salida de las posteriores con suaves masajes, evitando la dilucin con lquidos tisulares. Llene el capilar o contenedores con la cantidad necesaria. 3.10.6 Al finalizar, eleve el taln, coloque algodn en la zona y presione ejerciendo la respectiva hemostasia. 3.10.7 Descarte el material desechable y etiquete apropiadamente los contenedores. 3.11 RECOLECCION EN LUGARES INUSUALES L a finalidad de este manual no permite extendernos en el tema, pero mencionaremos que en los casos de pacientes muy obesos, pacientes con venas fibrosas por quimioterapia, bebs y otras condiciones que imposibiliten la obtencin de muestras en las venas superficiales de brazos, ser necesario localizar otras zonas de puncin. Entre las alternativas, podran citarse el dorso de la mano (no recomendable en bebs) , dorso del pie y en casos muy difciles, mediante puncin de la vena yugular externa (recomendado slo para personal con experiencia). 3.12 CONSIDERACIONES FINALES 3.12.2 Para Prevenir un hematoma : Punze slo la pared superior de la vena. Remueva el torniquete o ligadura antes de remover la aguja Use venas superficiales mayores(ceflica, braquial). Asegrese que la aguja penetra la pared superior de la vena (penetraciones parciales permiten la salida de sangre hacia el tejido blando). Aplique presin en el sitio de la puncin.

3.12.3 Para prevenir hemlisis: Mezcle adecuadamente los tubos que contengan anticoagulante con la muestra obtenida. Evite recoleccin de sangre de una zona con hematoma. Evite la aspiracin forzada de sangre si usa jeringa y aguja y dispender la muestra al contenedor a travs de la aguja. Asegrese que el sitio de puncin est seco antes del procedimiento. Evite manipulaciones, repeticiones o venopunciones traumticas.

3.12.4 Evite la Hemoconcentracin : Un incremento de grandes molculas y analitos en la sangre puede deberse a : 16

Aplicacin prolongada de la ligadura. Excesivo masaje o presin al probar el sitio de puncin. Venas esclerosadas u obstruidas. Uso de terapias endovenosas de largo plazo.

3.12.5 Efectos de la aplicacin prolongada del torniquete o ligadura : Hemoconcentracin . Incrementos significativos en protenas totales, transaminasas, lpidos totales, colesterol, hierro. Afecta al paquete celular sanguneo.

3.12.6 Factores del paciente que afectan la calidad de la muestra recolectada. Uso de frmacos. Considerar en cada procedimiento de ensayos, la posibilidad de ciertas drogas de interferir en el mismo. Ejercicio: La actividad muscular tiene efectos directos sobre la elevacin de Creatina Kinasa, Aspartato aminotransferasa o Transaminasa glutmico oxalactica, Deshidrogenasa lctica y recuento de plaquetas. Stress: No tiene relacin directa con los procedimientos de este manual, sin embargo, la elevacin transitoria de cortisol y catecolaminas podra afectar indirectamente algunos analitos como la glucosa. Postura : Los cambios posturales ( de supina a sentado) pueden interferir en el ensayo de ciertos analitos. Ciertas molculas grandes no son filtrables hacia los tejidos, de modo que obtendran una concentracin mayor en la sangre. En esta categora se encuentran enzimas, protenas, lpidos, hierro y calcio. Otros factores : Edad, sexo, gestacin.

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SECCION 4 : ACONDICIONAMIENTO, PRESERVACION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

4.1 ACONDICIONAMIENTO DE MUESTRAS 4.1.1 Definicin Son los procedimientos que aseguran la calidad de la muestra desde su recoleccin hasta el anlisis real. 4.1.2 Identificacin de las muestras y Centrifugacin Las muestras no podran salir de la zona de toma de muestra sin la correspondiente identificacin. Los datos bsicos de rotulacin de los tubos de recoleccin dependeran del sistema generado por la institucin, pero se aconseja anotar nombre y dos apellidos, cdigo numrico si existiera, procedencia, anlisis solicitados, seales de alerta en caso de antecedentes infecciosos del paciente o necesidad de anlisis urgente. Llegada la o las muestras a la zona de trabajo, identificar las Esperar 20 a 30 mismas en una hoja de trabajo o planilla, validando si la minutos , muestra es conforme (si lleg en las condiciones adecuadas de evitando la volumen, preservante necesario, identificacin, tiempo formacin de prudente o cualquier otra condicin necesaria para su fibrina latente posterior anlisis). que puede Proceder a la espera de formacin de cogulo, en el causar caso de separar suero, antes de su proceso de obturaciones. centrifugacin. Centrifugar a 1000-1500 g por espacio de 10 minutos. Para las separaciones de plasma, es prudente no esperar ms de una hora para su separacin. Utilizar el mismo tiempo y FCR para la centrifugacin. En ambos casos, los tubos recolectores deben ser centrifugados con su respectivo tapn. No olvide sus Luego del centrifugado, separe el suero o plasma logrado en normas de tubos secundarios, anotando la identificacin y loa anlisis bioseguridad : pertinentes al rea de bioqumica. Si sospecha la posibilidad Use guantes, de repeticiones o adiciones de pruebas, separe un poco mascarillas y de la muestra en otro tubo y almacene refrigerado. gafas. Procure mantener un file u hoja de trabajo de las muestras separadas que traslada a las distintas zonas de trabajo, obteniendo del analista la conformidad de la muestra separada.

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4.2

PRESERVACION DE LAS MUESTRAS

4.2.1 Definicin Procedimientos destinados a eliminar o disminuir cualquier variacin en los componentes biolgicos y moleculares de una muestra recolectada y separada. 4.2.2 Procedimientos esenciales

4.2.2.1 Mantener como prctica ideal la centrifugacin de una muestra, tan pronto como se form el cogulo. 4.2.2.2 El tiempo mximo de espera de una muestra de sangre total para su separacin es de una hora. Pasado este tiempo, sufren variaciones significativas la glucosa, el potasio, fsforo, creatinina y transaminasas. 4.2.2.3 Si se requiriera una conservacin superior a 1 hora, se recomienda almacenar la muestra a temperatura ambiente,antes que a 4C. Esto retardar discretamente la hemlisis. 4.2.2.4 En el caso de suero o plasma separado, las muestras que no puedan analizarse dentro de las primeras 4 horas deben ser almacenadas a temperatura de refrigeracin ( 2-8 C) hasta su proceso, con un lmite de 48 horas. Si el tiempo de proceso se prolonga, es aconsejable almacenar las muestras a 20 C.

Siempre almacene las muestras en tubos o recipientes taponados.

4.3

TRANSPORTE DE MUESTRAS

4.3.1 Definicin Procedimientos de preservacin de muestras durante traslados desde el laboratorio hacia otro centro de referencia. 4.3.2 Procedimientos esenciales

4.3.2.1 El tiempo ideal de traslado de un laboratorio hacia otro centro debiera oscilar entre 45 a 60 minutos. 4.3.2.2 Utilizar recipientes de material plstico (polietileno o polipropileno) como contenedores de las muestras transportadas. 4.3.2.3 Identificar correctamente las muestras trasladadas, enviando en formato externo cualquier dato adicional que no pudiera escribirse en el tubo o contenedor.

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4.3.2.4 Depositar estas muestras en sobres o cajas que puedan permitir el uso de unidades o bolsas refrigerantes (los envases de polietileno son adecuados para este fin). 4.3.2.5 Asegurarse que los tubos se encuentren perfectamente sellados , evitando derrames o contaminaciones con las soluciones refrigerantes. 4.3.2.6 En caso de recurrir a envos por correo o courier, asegurarse de las condiciones de entrega y emabalaje del material enviando, respetando la cadena de fro si es esencial. Actualmente existen compaas que mantienen experiencia en traslados de material biolgico. 4.3.2.7 Verifique con el centro referencial las condiciones de envo de las muestras, as como su recepcin exitosa.

Nunca enve muestras de suero o plasma en tubos de vidrio. Por otro lado, procure utilizar tapas de tipo rosca para el sellado.

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SECCION 5: METODOLOGIA E INSTRUMENTACIN

5.1 FOTOMETRIA 5.1.1 Definicin El trmino equivale a medicin de luz, lo que se traduce en la prctica laboratorial como el proceso de determinar la intensidad de luz absorbida o emitida por una sustancia coloreada. Dicha sustancia coloreada puede ser el resultado del proceso para determinar un analito y, por lo tanto, la medicin de ese color final tendr una relacin directa con la concentracin de la sustancia. Para transformar la intensidad del color de una solucin en unidades de concentracin de una sustancia o analito, es necesario conocer la Ley de Lambert-Beer o simplemente Ley de Beer. 5.1.2 Ley de Beer La Ley de Beer explica mediante una frmula matemtica que la concentracin de una sustancia est en relacin directa a la cantidad de luz absorbida o en relacin inversa al logaritmo de la luz transmitida. L a relacin establecida entre Absorbancia (A) y Transmitancia (T) se expresa de la siguiente manera : El color de una sustancia se produce porque al incidir la luz sobre ella, sus molculas absorben ciertas longitudes de onda y dejan pasar las correspondientes al color que interpretaremos con nuestros ojos y cerebro.

A = log

100 = log 100 log % T = 2 log % T %T

En el terreno de la fotocolorimetra, sin embargo, usamos una frmula prctica que nos permite relacionar la concentracin frente a la absorbancia de una solucin :

C=

A del desconocido x C del patrn o Standard A del patrn o Standard

Donde C = Concentracin del desconocido y A= Absorbancia (en nm).

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Si quisiramos producir una grfica en papel milimetrado, enfrentando la absorbancia obtenida al medir distintas concentraciones de una misma sustancia, obtendramos un trazado parecido al de la figura A. Por otro lado, si realizamos lo mismo con la transmitancia, el grfico sera similar al de la figura B. A mayor concentracin, mayor absorbancia

No hay relacin directa y lineal entre concentracin y transmitancia.

0 Concentracin Fig. A

0 Concentracin Fig. B

Dichas figuras permiten explicar el por qu resulta prctico medir la absorbancia cuando intentamos realizar una curva de calibracin en papel milimetrado. De esa forma podremos obtener una curva lineal, que permite visualizar en forma directa que, a mayor concentracin, mayor cifra de absorbancia. Si quisiramos lograr una curva lineal aunque inversa, utilizando la transmitancia, necesitaramos utilizar papel semilogartmico. 5.1.3 Fotmetros y Espectrofotmetros. Son los instrumentos esenciales para realizar labores de fotocolorimetra y , en general, para la realizacin de los procedimientos de bioqumica. Los fotmetros mantienen en su interior ( a manera de tambores) diversos filtros, los cuales dejan pasar ciertas longitudes de onda , las cuales incidiran sobre la solucin a ser medida. El resto de las longitudes de onda son absorbidas por este filtro. Los espectrofotmetros, en cambio, permiten mediante prismas o rejillas de difraccin seleccionar longitudes de onda ms estrechas. En general, estos ltimos permiten obtener bandas que, en promedio, no sobrepasan los 0.5 a 1.5 nm, a diferencia de los fitros que obtiene aislamientos de luz con bandas promedios de 5 a 10 nm. 5.1.3.1 Componentes de un Fotmetro o Espectrofotmetro Fuente de energa luminosa: Se requieren lmparas especficas para mediciones en el espectro de luz visible ( 360 a 950 nm aproximadamente) y en el ultravioleta ( no visible, de 220 a 360 nm aproximadamente). Para las

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mediciones con luz visible se usan lmparas de wolframio o tungsteno y para las del rango ultravioleta, son apropiadas las de hidrgeno o deuterio. Selector de longitud de onda : Se usan filtros o monocromadores (prismas, rejillas de difraccin). La seleccin de una determinada longitud de onda depender del color de la solucin a ser medida.

Los anlisis realizados en bioqumica clnica dependen de la medicin de la cantidad de luz absorbida por la sustancia examinada.

Una solucin de color Una solucin de color amarillo, absorber luz que amarillo, absorber luz est comprendida entre 400 a que est 480 nm, lacomprendida cual corresponde al entre 400 a 480 nm, la color azul.Es decir, cual corresponde al obtendremos una mayor color azul.Es decir, ABSORBANCIA en ese rango

Cuando escogemos una determinada longitud de de onda onda para para medir medir una una sustancia, sabemos que la la misma misma absorber absorber tanta cantidad de esade luz como tanta cantidad esa cantidad de sustancia exista

Para una mejor comprensin, observe la siguiente tabla:

Color de la Solucin

Longitud de Onda Seleccionada (nm)

Color absorbido a dicha longitud de onda. Violeta Azul Verde Azulado Azul verdoso Verde Verde amarillo Amarillo Naranja Rojo

Amarillo Verdoso Amarillo Naranja Rojo Prpura Violeta Azul Azul verdoso Verde azulado

380-430 430-475 475-495 495-505 505-555 555-575 575-600 600-620 620-700

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Cubetas : Son los recipientes donde se colocar la solucin a ser medida. Los hay de diverso tamao y material de construccin. Detectores de Energa Radiante o Luminosa : Se encargan de transformar la energa luminosa en energa elctrica. Dispositivos de Lectura: Para transformar la energa elctrica en un valor de absorbancia o transmitancia.

Regist

Fuente de Luz

Filtro Monocromador

Cubeta

Detector

Registro

5.1.4

Operacin y Control de Instrumentos

5.1.4.1 Los siguientes pasos son instrucciones generales. Cada instrumento tendr particularidades descritas en el manual del proveedor, as como recomendaciones en relacin al mantenimiento. He aqu algunos consejos tiles: Revisar las condiciones de conexin del aparato a la red elctrica. Tome mucha atencin en el selector de voltaje. Conecte el instrumento a la energa cuando est seguro del mismo. Encienda el fotmetro o espectrofotmetro . Algunos instrumentos requieren ms tiempo que otros para estabilizar su sistema de medicin, incluida la lmpara. Basado en los procedimientos de cada anlisis, seleccione una longitud de onda determinada. Recuerde Lleve a cero la absorbancia. Convencionalmente se logra trasladar por esto utilizando agua destilada como solucin de ajuste. En escrito las aparatos automatizados, la mquina realiza este instrucciones de procedimiento internamente. operacin de su Cercirese si su procedimiento requiere blanco de muestra o equipo a un reactivo. Coloque lo indicado en la cubeta y ajuste a cero la archivo del absorbancia. laboratorio, Mida la absorbancia de estndares y muestras. disponible a todos Finalizado el trabajo, apague el instrumento. Limpie cualquier derrame en el instrumento o en su rea de trabajo.

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5.1.4.2 Control del Instrumento Para exactitud de la absorbancia puede preparar una solucin de dicromato potsico con 0.005 g del mismo y llevarla a 1 litro de solucin con cido sulfrico 0.005 M. Esta solucin debe dar una absorbancia de 0.535 a 350 nm de longitud de onda. En el mercado se encuentran adems soluciones de absorbancia conocida para diferentes longitudes de onda. Para controlar la exactitud de la longitud de onda seleccionada es factible utilizar cristal de xido de holmio y verificar que existan picos de absorbancia a 279; 287.6; 333.8; 360.8; 418.5; 536.4 y 637.5 nm. Finalmente puede chequearse la linealidad al comprobar la construccin de una curva o lnea recta con una solucin coloreada y diluida a distintas concentraciones. Las mediciones se realizaran a una longitud de onda que corresponda a la medicin de dicho color. Mtodos de Anlisis

5.1.5

La medida de la concentracin de sustancias por fotometra se realiza va dos tipos de mtodos : los de punto final y los cinticos. No confundir con la longitud de onda utilizada para la medicin, la cual puede ser de espectro visible o no visible (medicin con longitud de onda ultravioleta). Igualmente es importante reconocer que para ambos mtodos pueden existir variaciones enzimticas y no enzimticas, segn se utilice o no estos elementos como reactivos. 5.1.5.1 Mtodos de Punto Final En estos mtodos se incuban segn cada procedimiento, reactivos y muestra, adems del mismo reactivo con el patrn o standard, esperando un tiempo determinado para lograr un equilibrio o finalizacin de la reaccin. Al final se leen las absorbancias de la muestra, del patrn o standard, del blanco de reactivos ( si es exigencia del procedimiento) y debe conocerse la concentracin del patrn. Se procede al clculo mediante la ecuacin presentada en el acpite 3.1.2 : Concentracin de la muestra = Factor x (Absorb. Muestra-Abs. Blanco) El Factor es obtenido de la siguiente manera : Concentracin del patrn o Standard Factor = (Abs. Del Patrn-Absorbancia Blanco) Calibre diariamente colocando un Standard en cada corrida. De esta forma obtendr un factor confiable para su prueba

Eliminar de estos clculos la Absorbancia de Blanco de Reactivos si no es procedente. En algunas reaciones se recomienda el uso de blanco de muestra para reducir la interferencia que algn compuesto en la misma pudiera causar al proceso.

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Sencillamente mida la absorbancia de este blanco de muestra y proceda a la sustraccin con la absorbancia de la muestra. Finalmente, Ud. puede realizar el clculo de la concentracin de una sustancia o analito, construyendo una curva a partir de diluciones del patrn o Standard o con concentraciones ya conocidas del mismo componente. Coloque en una hoja milimetrada un grfico de dos ejes. En el eje horizontal site las concentraciones utilizadas y en el eje vertical las absorbancias obtenidas para cada una. Luego una las intersecciones logradas entre absorbancias y concentraciones y obtenga una lnea recta. Para lograr conocer la concentracin de una muestra desconocida, extrapole sus valores de absorbancia en la curva. Proceda a las respectivas intersecciones Eje vertical : Absorbancias

10 Trace una recta uniendo los puntos

20

30

40

Eje horizontal: Concentracin

5.1.5.2 Mtodos Cinticos En estos mtodos se determinan variaciones en la absorbancia de una reaccin a travs de mediciones por intervalos de tiempo, generalmente no mayor a los 5 minutos (vara de acuerdo al procedimiento especfico y al tipo de instrumentacin disponible). Por lo tanto, habr una serie de absorbancias obtenidas durante el lapso de tiempo total. Para ello, se consigue calcular una delta A, mediante la sustraccin entre la segunda determinacin y la primera, la tercera y la segunda y as consecutivamente, terminando por promediar dichas diferencias y aceptando ese promedio como delta A. Luego, se procede a multiplicar dicha cifra por el factor proporcionado por el fabricante. Dicho factor es calculado a travs de operaciones matemticas complejas que incluyen la necesidad de conocer el coeficiente de extincin molar y el paso de luz o distancia ptica de la cubeta. Dada la complejidad de esta metodologa, es preferible utilizarla con kits comerciales y con instrumentacin adecuada que permita una adecuada

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seleccin de la longitud de onda necesaria para la medicin y un control preciso de la temperatura de reaccin.

5.1.5.3 Medicin de Concentracin de Enzimas Especial atencin merece el conocimiento metodolgico en la medicin de enzimas. Estas protenas se encuentran en cantidades tan pequeas, que la forma prctica de valorar su concentracin es midiendo su actividad en las reacciones que catalizan. Para ello, se introducen sustancias que acoplados al sustrato o al producto permiten valorar en forma colorimtrica o mediante el rango ultravioleta dicha accin. El ejemplo clsico es la medicin de la actividad de la deshidrogenasa lctica. Dicha enzima interviene en la siguiente reaccin :

DHL Piruvato + NADH2 NAD + Lactato

Como se observa, en la reaccin existen dos coenzimas : el NAD (compuesto en estado de oxidacin) y el NADH2 (forma reducida de la coenzima). Se ha observado que la forma reducida de la coenzima (NADH2) absorbe luz a 340 nm (rango ultravioleta), razn por la cual si la reaccin se midiera de izquierda a derecha y, por lo tanto , se midiera la produccin de NAD, la medicin de la absorbancia sera en forma decreciente a lo largo de un tiempo. Si, por el contrario, la medicin de la reaccin fuera a la inversa, se estara midiendo el incremento en NADH2, por lo que la absorbancia sera medida en forma creciente a ciertos intervalos de tiempo. Esta observacin ha permitido adoptar el mismo sistema para la medicin de enzimas, acoplando ya sea la medicin de NADH2 o NAD, estableciendo una manera segura de determinar enzimas en el rango UV. 5.2 CENTRIFUGAS 5.2.1 Definicin Instrumental destinado al proceso de centrifugacin, tcnica de separacin por la cual las partculas de una solucin son separadas lejos de un centro de rotacin, gracias al movimiento originado por la fuerza centrfuga. Dicha separacin depender de la masa y la forma de las partculas. 5.2.2 Tipos de Centrfugas Existen dos tipos fundamentales de centrfuga en el trabajo de un laboratorio de Bioqumica. Estos tipos dependen del cabezal o rotor que soporta los envases donde se colocan los tubos. Dichos cabezales pueden ser horizontales o angulares. En los primeros, los tubos se centrifugan en forma horizontal, en forma paralela al eje de rotacin. En

27 Centrfuga Angular

los llamados angulares, la disposicin de los tubos en ngulo con respecto al eje, permite una centrifugacin que empuja las partculas hacia el fondo y hacia una pared lateral del tubo (ver fotografas).

5.2.3

Clculos de velocidad

La aceleracin en una centrfuga se expresa de manera estandarizada como mltiplo de la aceleracin de la gravedad. As, el nmero de veces de aceleracin de la gravedad se indica como Fuerza Centrfuga Relativa (FCR) y se expresa en g.
-5 2

FCR = 1.12 x 10

(rpm) x r

Donde r = radio de giro y rpm = revoluciones por minuto. De esto se desprende que una centrifugacin a 10,000 g variar en rpm en una centrfuga con radio de giro de 5cm frente a una de 10 cm. 5.2.4 Recomendaciones especiales Realizar mantenimientos preventivos en los carbones del instrumento y en las mediciones de rpm mediante un tacmetro. Calibrar si fuera posible al menos una vez al ao ( esto se consigue por medio de alguna empresa que brinde dicho servicio metrolgico). No es lo mismo calibrar que controlar las rpm en forma interna. Centrifugar con responsabilidad, manteniendo la tapa cerrada durante el proceso y esperando el tiempo necesario para el frenado completo . Eliminar la costumbre de abrir la cubierta del instrumento para apurar el proceso de frenado en forma manual. Realizar peridicamente una limpieza general y aplicar normas de bioseguridad en caso de rotura de tubos en su interior. Prevenga contaminaciones y accidentes balanceando eficazmente los tubos que introduce. Mantenga una ficha de mantenimiento en el archivo general de Mantenimiento de Equipos.

5.3 ANALIZADORES AUTOMATIZADOS Si bien no todos los centros pueden tener equipos de naturaleza automatizada o semiautomatizada, es pertinente para los fines del presente manual dar algunas definiciones en relacin a este tipo de equipos. 5.3.1 Clasificacin Los analizadores pueden clasificarse de la siguiente manera: 5.3.1.1 Segn su grado de automatizacin :

28

Automatizacin completa : Son equipos que partiendo de suero u otro lquido susceptible de anlisis, son capaces de realizar todos los pasos tcnicos hasta la entrega de resultados en forma de concentraciones. Automatizacin parcial o Semiautomatizacin : Son aquellos que requieren de algn manipuleo previo del suero o lquido a analizar, antes de suministrarlo a la mquina para que lo siga procesando.

Analizador Semiautomatizado 5.3.1.2 Segn la secuencia de anlisis

Analizador Automatizado

Seriada : Implica el anlisis de las muestras en forma secuencial, una detrs de otra, no pudiendo existir dos muestras distintas que puedan estar en la misma etapa operativa. Paralela : El analizador trabaja varias muestras en forma simultnea, las cuales van pasando por los mismos pasos de una tcnica .

5.3.1.3 Segn la independencia o no de cubetas o recipientes de reaccin Discretos : Sea automatizado o no, cada muestra con sus correspondientes reactivos se encuentra en un recipiente separado. Aunque una muestra puede cambiar de recipiente, jams comparte el mismo con otra muestra. De flujo continuo : Todas las muestras circulan a travs de un mismo tubo, de tal manera que varias muestras distintas se encuentran simultneamente, una detrs de otra , en el mismo recipiente. Mantenimiento de Analizadores automatizados :

5.3.2

Como cualquier instrumento, los analizadores automatizados requieren la puesta en marcha de un plan de mantenimiento. 5.3.2.1 Planifique anualmente el mantenimiento que le dar a fotmetros, centrfugas, estufas, pipetas, refrigeradores y termmetros. Incluya igualmente en fichas separadas, el correspondiente al analizador de uso. 5.3.2.2 Transfiera por escrito las principales indicaciones que el fabricante aconseja para el mantenimiento diario, semanal, mensual o anual, segn corresponda. Puede encontrar til la ficha de mantenimiento de equipos en la seccin de anexos.

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5.3.2.3 Delegue a una persona la responsabilidad del mantenimiento . Si el laboratori o cuenta con personal suficiente, puede dividirse este trabajo entre varias personas. 5.3.2.4 Mantenga el contacto y los datos precisos acerca del distribuidor local de su instrumento, con el objeto de coordinar mantenimientos preventivos y necesidades de reparacin. 5.3.2.5 En relacin a calibraciones, los equipos citados en este acpite no requieren estos procedimientos. Sustituya esta accin mediante verificaciones mensuales del rendimiento del equipo, basado en la performance buena o no del control de calidad interno. Es buena prctica pegar un sticker en alguna zona visible del aparato y realizar un check por cada mes en que se verifica el instrumento. Unido al mantenimiento arriba citado, Ud. habr cumplido con el cuidado de este til equipo.

5.4 PIPETAS 5.4.1 Definicin Instrumentos empleados para trasvasar un volumen lquido de un recipiente fsico hacia otro. Se emplea en los anlisis de laboratorio tanto para reactivos como para muestras biolgicas. 5.4.2 Clasificacin

5.4.2.1 Pipetas de vidrio. Pueden ser volumtricas (aspiran y transportan volmenes) y graduadas (permiten las aspiracin y transporte de volmenes medidos). En la rutina diaria de aspiracin y trasvase de reactivos y muestras este tipo de pipetas deberan ser reemplazadas en lo posible por pipetas mecnicas,por su mayor tiempo de vida, precisin y seguridad biolgica. 5.4.2.2 Pipetas Mecnicas: Las llamadas micropipetas mecnicas permiten trabajar en la rutina diaria con volmenes de 0.5 a 1000 ul. Pueden ser de desplazamiento de aire (indirectas ) o de desplazamiento directo. Por ser las pipetas ideales para el trabajo bioqumico se citan ms abajo recomendaciones sobre su uso. 5.4.2.3 Pipetas de Sanz : Recipientes con tapa ajustable y dispensador, tiles para la medicin de muestras y para la distribucin repetida de reactivos en el rango de 5-100 ul. . 5.4.3 Recomendaciones de Uso Las pipetas mecnicas o micropipetas se cargan y descargan merced a la accin del dedo pulgar sobre un pistn. Las pipetas mecnicas de pistn presentan tres posiciones en este extremo:l a normal de reposo, la intermedia de aspiracin y la de presin a fondo de dispensacin. Estas pipetas se cargan apretando el mbolo hasta la posicin intermedia y luego se afloja la presin para llenar la punta. Para descargarlas se aprieta el mbolo hasta el fondo. Al aspirar la muestra con la punta, es importante la tcnica de secado de la misma. Mediante un papel absorbente o tela, realizar dos movimientos suaves hacia abajo a 90 uno con respecto del otro. Al realizar este secado, tener

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presente iniciarlo por encima del nivel de lquido en el que la punta penetr y no tocar el lquido, ya que de esta forma se extraera parte del mismo. Finalmente, depositar la muestra o lquido en el contenedor o tubo que recibir el primer volumen. Puede introducirse la punta hasta cierta profundidad y expeler la totalidad de lo aspirado con suavidad. Dado que las puntas utilizadas para estas micropipetas son no humedecibles, no existe el peligro de arrastre de solvente fuera del tubo o receptculo que lo contiene. Incluso , pueden realizarse lavados finales con el solvente o reactivo final, desechando la punta al final de este acto.

5.4..4 Mantenimiento de Pipetas Mecnicas 5.4.4.1 No es posible dar recomendaciones especficas para la amplia variedad de modelos existentes en el mercado. Sganse los consejos descritos abajo. 5.4.4.2 Mantener como en cualquier equipo de laboratorio, una ficha o formato de mantenimiento individual por cada pipeta . 5.4.4.3 Mantener limpia cada pipeta en su aspecto externo. Si es posible y el fabricante lo recomienda, realizar peridicamente algn mantenimiento interno como aceitado de piezas. 5.4.4.4 En el caso de pipetas mecnicas que usan puntas descartables para las disposiciones de volumen, prevenir el abastecimiento de ellas; no es buena prctica de laboratorio reutilizar bajo ningn concepto las mismas. 5.4.4.5 Contactarse como mnimo una vez al ao para la calibracin de este material bajo una entidad especializada en el rubro de metrologa. 5.4.4.6 Dentro de la programacin de mantenimiento , disponer una periodicidad no mayor de 3 meses para la verificacin de la calibracin del instrumento. 5.4.4.6 Para la prueba respectiva de verificacin de volumen, pueden seguirse el mtodo de anlisis gravimtrico o de pesada de volumen, propuesto por la Organizacin Mundial de la Salud en su Manual de Mantenimiento y Reparacin del Equipo de Laboratorio . 5.5 Bao Mara 5.5.1 Definicin Dispositivo para calentar agua. El calor se obtiene a partir de un mdulo elctrico. Se utiliza para trabajos a 25, 30, 37, 42 56 , siendo de utilidad en bioqumica los tres primeros rangos. 5.5.2 Recomendaciones de Uso Controlar el nivel de agua, de modo que se mantenga por encima del nivel de la solucin que se ha de incubar. Mantener la tapa del bao mara abierta cuando se proceda a la incubacin de recipientes o tubos , evitando contaminaciones y la dilucin del material por el agua condensada. Cambiar el agua con regularidad para evitar la proliferacin de algas, bacterias u hongos.

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5.5.3 Mantenimiento del Equipo 5.5.3.1 Desmontar los sistemas de circulacin de agua para eliminar algas e impurezas. 5.5.3.2 Los termmetros de uso en el equipo deben verificarse al recibirlos de los proveedores y despus cada 3 meses, frente a un patrn : hielo o agua hirviendo. 5.5.3.3 Mantener una ficha formato individual para mantenimiento, siguiendo las recomendaciones arriba citadas, as como las sugeridas por el fabricante.

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SECCION 6: PROCEDIMIENTOS

6.1 GLUCOSA : METODO ENZIMATICO CON GLUCOSA OXIDASA

6.1.1

Presentacin

La glucosa constituye el monosacrido de mayor uso como fuente de energa a nivel celular. La utilizacin de la misma se produce a travs del metabolismo de carbohidratos de origen exgeno y endgeno por diversas rutas bioqumicas. Finalmente, la penetracin de la glucosa a nivel celular requiere la presencia de insulina, ptima en cantidad y calidad. Precisamente, la disminucin en el tenor de esta ltima y la resistencia a su accin constituyen algunos de los elementos causales de la aparicin de diabetes mellitus. La hiperglicemia , como hallazgo comn a diabetes mellitus puede derivar en acidosis metablica y cetosis, debido a la incapacidad de utilizar la glucosa como fuente energtica y trasladarse dicha necesidad a la utilizacin de grasas como alternativa. El hallazgo de niveles elevados de glucosa tambin se observan en diversos desordenes como enfermedades del pncreas, endocrinopatas (acromegalia, Sndrome de Cushing, Tirotoxicosis), uso de frmacos (esteroides, anticonceptivos orales) y asociada a la diabetes gestacional.

6.1.2

Principio del Procedimiento

Se describir el mtodo enzimtico de la glucosa-oxidasa, el cual corresponde a la metodologa recomendada y empleada como tal para la correspondencia con los rangos referenciales internacionales. Los laboratorios que no empleen esta metodologa seguiran sus instructivos de acuerdo a las normas del fabricante del kit comercial o de la referencia bibliogrfica utilizada para el desarrollo de la prueba. Se sugiere en todo caso, mantener dichas instrucciones al alcance del personal que labora en el rea y para efectos de auditoras y/o supervisiones. 6.1.3 Descripcin del mtodo

Ante la presencia de glucosa en el suero o plasma analizado , sta es oxidada por accin de la Glucosa Oxidasa, produciendo Acido Glucnico con liberacin de Perxido de hidrgeno. Luego, gracias a la accin de la Peroxidasa, este Perxido libera agua y Oxgeno. La molcula de Oxgeno es capatada por la 4 Aminofenazona, el cual junto al fenol(en algunos casos podra ser el hidroxibenzoato u otro aceptor de oxgeno), forma un compuesto cromgeno de color rosado-grossella, el cual se mide fotomtricamente (entre 490 a 530 nm). Dicha medicin del cromgeno guarda una relacin directa con la concentracin previa de glucosa. Glucosa + O2 + H2O-----GOD--------- Acido Glucnico + H2O2 (Perxido de Hidrgeno) 2H2O2 + 4-Aminofenazona + Fenol------POD-------- Cromgeno(quinona) + 4 H2O 33

6.1.4

Tipo de Muestra Primaria

Puede utilizarse suero o plasma. Condicin importante: Ayuno de 8 horas. La toma de muestras para petitorios de Glucosa Post Prandial requieren de la ingesta de alimentos ricos en carbohidratos 2 horas antes de la toma de muestra (ej.: un desayuno convencional con bebida azucarada y 2 porciones de pan ). Previamente se requerir una toma de muestra basal en ayunas.

6.1.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recoleccin 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mnimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recoleccin al vaco(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la seccin de Toma de Muestras para las generalidades de la venopuncin. 6.1.4.2 Obteniendo Plasma En caso de utilizar plasma, recurra a la utilizacin de 01 tubo de ensayo provisto con EDTA-K como anticoagulante. En los sistemas de recoleccin al vaco es fcil obtener la proporcin adecuada de mezcla, obteniendo el volumen de muestra fijado por el fabricante. En caso de utilizar anticoagulante, cuya preparacin se realiza en el laboratorio, siga las instrucciones siguientes : Mezcle 100 g de EDTA-K y 200 g de Fluoruro de sodio hasta homogenizar en un polvo. Se requerir 5 mg de dicha preparacin por cada 2 ml de sangre obtenida. Otros anticoagulantes como heparina, oxalato o fluoruro no interfieren en la reaccin, por lo que tambin pueden emplearse. 6.1.4.3 Separacin de la Muestra y Preservacin Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de glbulos rojos. Sin la utilizacin de aditivos, la glucosa en muestras de sangre completa se metaboliza a razn de 7 mg/dl/hora a temperatura ambiente y a 2 mg/dl/hora a 4C. Sin embargo, separando a tiempo el suero o plasma, la glucosa es estable por 48 horas a temperaturas de refrigeracin y aproximadamente 6 horas a temperatura ambiente. En caso contrario, al no existir condiciones para una separacin oportuna de la muestra de sangre completa, utilice como aditivo el fluoruro de sodio: 2 mg del mismo por cada mililitro de sangre obtenida. Esto preserva la muestra en refrigeracin por unas 48 horas.

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6.1.5

Equipos y Materiales

6.1.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm. En el caso de espectrofotmetros se aconsejan lecturas a 505 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.1.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material. 6.1.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Bao Mara : Para la respectiva incubacin durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reaccin, en el caso de preparacin de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. e) pHmetro en el caso de preparacin de reactivos. f) Reloj o timer. 6.1.6 Reactivos

6.1.6.1 Reactivo Comercial Resulta una prctica muy generalizada la utilizacin de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribucin en el mercado. La nica indicacin sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relacin al uso y preservacin de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. No son aceptables dentro de las normas actuales, el uso de los insertos o facsmiles comerciales, los cuales pueden ser almacenados como documentos externos de consulta. Es necesario, por lo tanto, transcribir los pasos de la tcnica de una manera sencilla para el uso del personal del rea de trabajo, manteniendo la misma en revisin y actualizacin peridica si fuera necesario. 6.1.6.2 Reactivo Preparado en el Laboratorio A continuacin se describe el procedimiento para la preparacin de reactivo hecho en casa, siguiendo la metodologa enzimtica(glucosa-oxidasa) :

35

a)Buffer Fosfato : Verificar al final un pH de 7.0 +/- 0.05 A un volumen de 800 ml de Agua destilada, aadir en el siguiente orden: Fosfato hidrogenado disdico dihidratado (Na2HPO4.2H2O)---- 12.95g Fosfato potsico dihidrogenado (KH2PO4)------ 4.95 g Azida sdica (NaN3)----- 0.5 g Disolver y completar hasta 1 litro de solucin. Estable por 3-4 meses a 2-8C.

b)Reactivo de Color A un volumen de 100 ml del buffer arriba descrito, aada lo siguiente en el orden indicado: 4-Aminofenazona----- 16 mg GOD (Glucosa Oxidasa: Sigma G 7016)----- 1800 Unidades POD (Peroxidasa: Sigma P 8250)------- 100 Unidades Fenol ------ 105 mg Tween 20 (Sigma P1359)------ 50 ml Reconstituya el GOD y POD con el Buffer Fosfato. Dispense en viales separados la cantidad de unidades necesarias para cada preparacin. Congele estos viales. La solucin as preparada es estable en frasco color caramelo por 2 semanas a 2-8 C.

c)Acido Benzoico Disuelva 1 g de acido benzoico en agua y complete hasta 1 litro de solucin. Almacene a temperatura ambiente hasta el consumo del mismo o deterioro. d)Solucin Stock de Glucosa ( 1 g/ L) Disuelva 1 g de glucosa en cido benzoico hasta lograr 100 ml de solucin. Estable por 6 meses a temperatura ambiente . e)Solucin Standard de Glucosa Para obtener un Standard con 100 mg/dl de glucosa, disuelva 10 ml de la solucin stock en cido benzoico hasta completar 100 ml de solucin. Estable por 6 meses a temperatura ambiente.

36

6.1.7

Procedimientos

6.1.7.1 Reactivo Comercial Mantenga las recomendaciones del proveedor. Recuerde la necesidad de transferir las mismas en un escrito propio de su manual de Procedimientos. Puede resultar til el modelo adjunto en Anexos.

6.1.7.2 Reactivo Preparado en el Laboratorio Dilucin de Standards, Muestras y Control

Pipetee lo siguiente en tubos identificados de 13 x 100 mm:

S1 Agua destilada(ml) 1.9 Solucin Standard De Glucosa( ml) 0.1 Muestra/Control --

S2 1.8 0.2 --

S3 1.7 0.3 --

S4 1.6 0.4 --

S5 1.5 0.5 --

Muestra 1.9 -0.1

Control 1.9 -0.1

Mezcle bien. Desarrollo de Color

Pipetee lo siguiente en otro set de tubos :

ml Reactivo De Color

Blanco --

S1 1.2

S2 1.2

S3 1.2

S4 1.2

S5 1.2

Muestra 1.2

Control 1.2

Agua Destilada 0.1 Standard Diluido --Muestra/ Control --Diluido

---

---

---

---

---

---

---

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

---

---

---

---

---

---

---

0.1

0.1

37

Mezcle todos los tubos. Incube a 37C en bao mara por 15 minutos. Remueva del bao y deje atemperarse a temperatura ambiente. Lea en fotmetro o espectrofotmetro a 505 nm filtro verde los Standards, muestras y Control. Blanquee previamente a 0 con el Blanco preparado.

6.1.8

Clculo de Resultados

El Standard S1 representa 100 mg/dl de concentracin de glucosa. El Standard S2 representa 200 mg/dl de concentracin de glucosa. El Standard S3 representa 300 mg/dl de concentracin de glucosa. El Standard S4 representa 400 mg/dl de concentracin de glucosa. El Standard S5 representa 500 mg/dl de concentracin de glucosa. Represente en un papel milimetrado los valores de absorbancia de S1 a S5 en el eje vertical de un grfico y las respectivas concentraciones en el eje horizontal. Asegrese de obtener una curva lineal hasta los 500 mg/dl. Posteriormente calcule la concentracin de muestras y controles ploteando la absorbancia obtenida en el grfico diseado.

Una vez que la linealidad est asegurada, no es necesario preparar grficos de standards cada vez que se analizan muestras de pacientes. Utilice el Standard S2 (200 mg/dl de glucosa) en cada corrida y calcule la concentracin de cada muestra utilizando la siguiente frmula : Absorbancia de la muestra -------------------------------- x 200 mg/dl Absorbancia del Standard S2 38

Concentracin de la muestra =

6.1.9 Procedimientos de Control de Calidad. Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio. 6.1.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), triglicridos ( > 1,250 mg/dl) y bilirrubina (> 10 mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos de concentracin. Niveles altos de acido ascrbico y cido rico pueden interferir disminuyendo los niveles de glucosa al interferir con el desarrollo de la reaccin de color. 6.1.11 Intervalos de Referencia Biolgica

Valores de Referencia Neonatos a Trmino : 30-90 mg/dl Valores de Referencia Adultos( Ayuno de 8 horas) : 70-110 mg/dl Valores de Referencia Glucosa Post Prandial (2 horas): Menor de 140 mg/dl 6.1.12 Valores de Alerta/Crticos Reportar inmediatamente, previo aviso al Mdico o Responsable del Laboratorio , si los valores obtenidos son : Glucosa (Adulto) : Menor de 40 mg/dl Mayor de 500 mg/dl. Glucosa (Neonato): Menor de 40 mg/dl Mayor de 200 mg/dl 6.1.13 Interpretacin de Laboratorio 6.1.13.1 Elevaciones de Glicemia : Se considera hiperglicemia todo valor que excede los valores referenciales para el laboratorio. Sin embargo, tienen especial inters aquellas cifras que sobrepasan el valor de 126 mg/dl y se repite en dos das distintos. Las condiciones productoras de hiperglicemia han sido referidas brevemente en el apartado 6.1. El mdico tratante evaluar cada caso especfico. 6.1.13.2 Criterios diagnsticos de Diabetes Mellitus: Sntomas de diabetes m un glicemia casual en cualquier momento del da mayor o igual a 200 mg/dl Glucosa en ayuno mayor o igual a 126 mg/dl Glucosa plasmtica a las 2 horas mayor o igual a 200 mg/dl durante una prueba de tolerancia. 6.1.13.2 Disminucin de glicemia : Los valores por debajo del valor referencial inferior del laboratorio, pueden ser considerados hipoglicmicos. Diversas condiciones como hipoglucemia reactiva, hipoglucemia inducida por etanol o frmacos,

39

lesiones anatmicas que derivan en insulinomas, insuficiencia corticosuprarrenal, hipopituitarismo, neoplasias extrapancreticas y enfermedad heptica masiva, pueden condicionar valores hipoglicmicos transitorios o continuos. 6.1.14 Especificaciones de desempeo 6.3.14.1 Linealidad : Vara segn los fabricantes. Se sita aproximadamente en 500 mg/dl. 6.1.14.2Lmite de deteccin : Igualmente, los diferentes productos citan cifras sobre 0.23 mg/dl. 6.1.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, esta metodologa arroja coeficientes de variacin entre 1.9% y 2.7 %, siendo menores las variaciones a mayor concentracin de las muestras. 6.1.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variacin se sitan entre 0.9 y 1.2 % para la metodologa. 6.1.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad Los procedimientos mencionados utilizan azida sdica y fenol, los cuales son txicos y custicos. No inhalar ni exponer piel y mucosas al contacto de estos elementos.

6.1.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.1.16.1 Controlar la temperatura exacta del bao mara. La variacin no puede ser mayor a +/- 0.1C. 6.1.16.2 Observar que el nivel de agua del bao cubra el nivel superior de los tubos en incubacin. 6.1.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.1.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.

40

6.2

PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA

6.2.1 Presentacin Esta prueba se solicita en pacientes cuyo nivel de glucemia es dudoso frente aun diagntico de diabetes mellitus, durante el embarazo o por razones epidemiolgicas para detectar diabetes y disminucin de la tolerancia a la glucosa. 6.2.2 Principio del Procedimiento. Se basa en proporcionar una sobrecarga de glucosa a un individuo, con la finalidad de determinar laboratorialmente la calidad de su respuesta fisiolgica, la cual debera consistir en un aumento de los niveles de insulina que permitan mantener la glicemia bajo cifras aceptables. 6.2.3 Descripcin del mtodo Luego de tomar una glucosa basal, el paciente ingiere una cierta cantidad de glucosa, permitiendo luego de dos horas la recoleccin de una nueva muestra de sangre. Las muestras de sangre se colectan bajo normas convencionales y se procesan segn el procedimiento explicado en el acpite 6.1, siguiendo la metodologa de determinacin enzimtica de glucosa . 6.2.4 Tipo de Muestra Primaria 6.2.4.1 Se obtiene suero de la manera convencional, primero en una muestra basal y luego a las dos horas de ingerida la solucin de glucosa. Se puede emplear igualmente plasma, siguiendo las recomendaciones del acpite 6.1. 6.2.4.2 Si las muestras no se van a procesar en forma inmediata, se aconseja recolectar en tubos con fluoruro de sodio como preservante. 6.2.5 Equipos y materiales 6.2.5.1 Equipo de Medicin Se requiere de un fotmetro o espectrofotmetro que rena las caracersticas expuestas en 6.1.5.1. 6.2.5.2 Material de vidrio. Respetar las indicaciones en 6.1.5.2 6.2.5.3 Otros Implementos. Asegurar lo indicado en 6.1.5.3. 6.2.6 Reactivos 6.2.6.1 Se utilizan los reactivos citados en el acpite 6.1 . 6.2.6.2 Se requiere glucosa anhidra . 6.2.6.3 Agua potable temperada para la disolucin de la glucosa. 6.2.6.4 Un vaso adecuado para contener al menos 375 ml de solucin. 6.2.6.5 Opcionalmente, se puede requerir jugo de limn.

41

6.2.7 Procedimientos 6.2.7.1 Debe instruirse previamente al paciente con las siguientes medidas: Tres das antes de la prueba, debe alimentarse con no menos de 150 g. De carbohidratos y llevar una actividad fsica normal. Llegar al laboratorio a la hora solicitada, en la maana. El da del anlisis concurrir en ayuna de 10 horas. Puede tomar agua durante ese tiempo. Est prohibido fumar . Indicar al laboratorio si est tomando medicamentos o se encuentra con alguna probable infeccin. 6.2.7.2 Tomarle una muestra de sangre en ayunas. 6.2.7.3 Darle de beber 75 g. De glucosa disuelto en 250 a 300 ml de agua temperada. Deber beberlo en un lapso de 5 minutos. 6.2.7.4 En el caso de nios proporcionar 1.75 g de glucosa por Kg. De peso. Y hasta un mximo de 75 g de glucosa. 6.2.7.5 Se puede proporcionar la solucin con algunas gotas de limn para evitar las nauseas y el sabor de la solucin. 6.2.7.6 Salvo indicaciones de su mdico para otras tomas durante su espera, recolectar la segunda muestra a las dos horas de haber iniciado la ingestin de la glucosa. 6.2.7.7 Si ocurri alguna eventualidad como nauseas y vmitos que impidan la realizacin de la prueba, citar al paciente en una semana, salvo indicacin contraria de su mdico. 6.2.8 Clculo de resultados Las muestras son sometidas al anlisis convencional de glucosa. Referirse al acpite 6.1.8 para explicaiones. 6.2.9 Procedimientos de Control de Calidad Se mantienen las mismas condiciones de la prueba de glucosa. Mantener la glucosa en un ambiente seco, para evitar hidrataciones y contaminaciones. 6.2.10 Interferencias Definidas en el acpite 6.1.10. 6.2.11 Intervalos de referencia biolgica 6.2.11.1 Tolerancia normal a la glucosa : Cuando a las dos horas posteriores a la carga, presenta glucemia menor de 140 mg/dl. 6.2.12 Valores de Alerta /Crticos No aplica. 6.2.13 Interpretacin de Laboratorio 6.2.13.1 Tolerancia normal: Valores a las dos horas menores a 140 mg/dl.

42

6.2.13.2Intolerancia a la glucosa : Valores a las 2 horas mayor o igual a 140 mg/dl y menor a 200 mg/dl. 6.2.13.3Diagnstico de diabetes : Valores a las 2 horas mayores de 200 mg/dl. 6.2.14 Especificaciones de desempeo Slo aplica la correspondiente al mtodo analtico, citado en 6.1.14 6.2.15 Precauciones de Seguridad 6.2.15.1 Mantener informado al paciente sobre el procedimiento. 6.2.15.2Es aconsejable determinar la glucosa basal en forma rpida, con el objeto de verificar posible hiperglicemia en rangos de alerta 6.2.15.3 Aplican las recomendaciones en la seccin de metodologa de glucosa. 6.2.16 Potenciales fuentes de variabilidad Aplican las correspondientes a la metodologa utilizada en la determinacin de glucosa.

43

6.3

COLESTEROL TOTAL : METODO ENZIMATICO CON COLESTEROL OXIDASA Presentacin

6.3.1

El colesterol es un componente importante de la membrana celular y de obligada necesidad en la sntesis de hormonas esteroideas y sales biliares. Su sntesis se realiza a nivel heptico, siendo luego transportado en sangre constituyendo estos grandes complejos moleculares denominados lipoprotenas. El mayor porcentaje del colesterol se encuentra repartido en la forma LDL y HDL de estas lipoprotenas. Es conocida la importancia de este elemento dentro de las enfermedades cardiovasculares y numerosos estudios han probado la relacin directa entre cardiopata y elevacin de este componente. Como parte de las actividades preventivas y de diagnstico en este grupo de enfermedades, el laboratorio juega un rol importante, brindando informacin y permitiendo el estudio de valores referenciales en este componente y sus fracciones. 6.3.2 Principio del Procedimiento

Se describe el mtodo enzimtico de Colesterol oxidada, ampliamente utilizado hoy en da. Los laboratorios que no empleen esta metodologa seguiran sus instructivos de acuerdo a las normas del fabricante del kit comercial o de la referencia bibliogrfica utilizada para el desarrollo de la prueba. Se sugiere en todo caso, mantener dichas instrucciones al alcance del personal que labora en el rea y para efectos de auditoras y/o supervisiones. 6.3.3 Descripcin del Mtodo

El colesterol se encuentra en sangre en forma de ster de colesterol y en forma libre. Para la reaccin citada, los steres de colesterol son hidrolizados por la enzima colesterol esterasa. El colesterol libre obtenido de esta reaccin es luego oxidado por la colesterol oxidasa , formando una cetona que libera perxido de hidrgeno. Posteriormente, este perxido de hidrgeno de desdobla en agua y oxgeno, siendo ste ltimo capturado por la 4-aminofenazona ( en algunos kits comerciales la 4aminoantipirina) que en presencia de fenol forma una quinoneimina coloreada de rosado. Este componente puede ser medido a 500-505 nm o utilizando filtro verde de fotmetro ( 490-530 nm).

Colest. esterasa

Ester de Colesterol + H2O

Colest. Oxidasa

Colesterol + Acido Graso Colestenona + H2O2 (Perxido de

Peroxidasa

Colesterol + O2 + H2O Hidrgeno) 2 H2O2 + 4-Aminofenazona + Fenol

Quinoneimina + 4H2O

44

6.3.4

Tipo de muestra Primaria

Se puede utilizar suero plasma . Condicin importante : Ayuno de 12 horas. 6.3.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recoleccin 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mnimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recoleccin al vaco(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la seccin de Toma de Muestras para las generalidades de la venopuncin. 6.3.4.2 Obteniendo Plasma En caso de utilizar plasma, recurra a la utilizacin de 01 tubo de ensayo provisto con heparina como anticoagulante. En los sistemas de recoleccin al vaco es fcil obtener la proporcin adecuada de mezcla, obteniendo el volumen de muestra fijado por el fabricante. Otros anticoagulantes podran interferir en la reaccin. Consulte al respecto el instructivo del proveedor. 6.3.4.3 Separacin de la Muestra y Preservacin Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de glbulos rojos. La muestra es estable 7 das a 2-8C y 3 meses a 20C. 6.3.5 Equipos y Materiales.

6.3.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm. En el caso de espectrofotmetros se aconsejan lecturas a 505 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.3.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo(13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material. 6.3.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Bao Mara : Para la respectiva incubacin durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37C.

45

Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reaccin, probetas, en el caso de preparacin de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. e) Reloj o timer. 6.3.6 Reactivos Definido el kit que usar, recuerde trasladar por escrito el procedimiento especfico.

6.3.6.2 Reactivo Comercial Recomendamos utilizar material comercial para la metodologa empleada en la determinacin de este componente. Estos elementos aseguran precisin y facilitan el trabajo de un laboratorio de cualquier nivel. Las caractersticas y procedimientos anotados posteriormente se cien a la metodologa ya reseada. 6.3.6.3 Reactivos Provistos en Kits Comerciales

Standard : El patrn Standard generalmente se provee en concentraciones de 200mg/dl en forma de solucin. Enzimas : Se provee una suspensin conteniendo : Lipasa fungal Colesterol esterasa, Colesterol oxidasa , Peroxidasa . Reactivo 4-Aminofenazona. Reactivo Fenol . Los reactivos arriba indicados expiran en la fecha grabada en la etiqueta del fabricante. Conservar a 2-8C. Reactivo de Trabajo : Ceirse a las recomendaciones del fabricante en cuanto a proporciones de mezcla de cada uno de los elementos reactivos del kit. Generalmente, el reactivo de trabajo es estable por un mes a temperatura de refrigeracin ( 2-8 C). Indicios de inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez partculas tanto en el Standard como en el reactivo de trabajo. Adems, vigilar las recomendaciones del proveedor en cuanto a la absorbancia del blanco de reactivo, la cual tiene un lmite .

6.3.7

Procedimientos

El siguiente es un procedimiento que indica proporciones estandarizadas por la mayora de fabricantes : Pipetee en tubos de ensayo de 13 x 100 mm los siguientes componentes : Muestra Reactivo(ml) React. De trabajo Standard Blanco 2.0 -Standard 2.0 0.02 Muestra 2.0 --

Mezclar bien e incubar a 37C en bao mara por 5 minutos. Retirar del bao de agua y Muestra Control --0.02 preparar el espectrofotmetro fotmetro para la lectura respectiva. 46

Leer la absorbancia del blanco, standard y muestra a 500-505 nm filtro verde (490-530 nm) en fotmetro con filtros. Blanquee a cero previamente con agua destilada. Las proporciones arriba indicadas pueden disminuirse aumentarse proporcionalmente de acuerdo a las necesidades de cada laboratorio y su infraestructura.

6.3.8

Clculo de resultados

La linealidad para los grficos de calibracin ha sido bien documentada por diversos fabricantes de kits comerciales. Se ha obtenido un nvel mnimo de linealidad de 500 mg/dl, razn por la cual basta utilizar un solo standard para la calibracin de la prueba y para los clculos respectivos de la concentracin mediante la frmula :

Absorbancia de la muestra Concentracin (mg/dl) = Absorbancia de Standard x 200

6.3.9

Procedimientos de Control de Calidad.

Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio. 6.3.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), triglicridos ( > 1,000 mg/dl), bilirrubina (> 10 mg/dl) y cido ascrbico (> 10 mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos.

6.3.11 Intervalos de Referencia Biolgica Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos (2001) y, al ltimo reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los siguientes valores de referencia en adultos :

47

Deseable Aceptable : Menor de 200 mg/dl Moderadamente alto : 200-239 mg/dl Alto elevado : Mayor o igual a 240 mg/dl.

6.3.12 Valores de Alerta/Crticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.3.13 Interpretacin de Laboratorio 6.3.13.1 Elevaciones de Colesterol : Adems de las relaciones con la enfermedad cardiovascular(enfermedad arterial coronaria), el colesterol se encuentra en concentraciones elevadas en el hipotiroidismo, diabetes mellitus, sndrome nefrtico y en varias hiperlipidemias, especialmente aquellas que causan xantomatosis. 6.3.13.2 Disminucin de glicemia : Puede detectarse niveles bajos de colesterol en la enfermedad hepatocelular , hipertiroidismo, anemia y desnutricin. 6.3.14 Especificaciones de desempeo 6.3.14.1 Linealidad : Vara segn los fabricantes. Se sita entre 500 a 1000 mg/dl. 6.3.14.2Lmite de deteccin : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre 0.3 mg/dl y 0.7 mg/dl. 6.3.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, esta metodologa arroja coeficientes de variacin entre 1.0% y 3.49 %, siendo menores las variaciones a mayor concentracin de las muestras. 6.3.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variacin se sitan entre 0.9 y 1.1 % para la metodologa. 6.3.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad Los procedimientos mencionados utilizan fenol, el cual es txico e irritante. No inhalar ni exponer piel y mucosas al contacto de este elemento. 6.3.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.3.16.1 Controlar la temperatura exacta del bao mara. La variacin no puede ser mayor a +/- 0.1C. 6.3.16.2 Observar que el nivel de agua del bao cubra el nivel superior de los tubos en incubacin. 6.3.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.3.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.

48

6.4

TRIGLICERIDOS: METODO ENZIMATICO CON GLICEROL FOSFATO OXIDASA

6.4.1 Presentacin Los triglicridos son steres formados gracias a la unin de glicerol y cidos grasos provenientes de dos fuentes: exgena (dieta) y endgena, por sntesis interna a partir de carbohidratos y principalmente en el hgado. Son transportados al igual que otros lpidos en complejos moleculares denominados lipoprotenas hacia el tejido adiposo, msculo y otros, teniendo como funcin principal el aportar energa a nivel celular. Sus elevaciones se han reportado en diversas hiperlipidemias primarias, de origen gentico, as como secundariamente a patologas de fondo como la diabetes mellitus. Hoy en da se considera la hipertrigliceridemia como un factor de riesgo de enfermedad coronaria arterial en forma independiente. 6.4.2 Principio del Procedimiento

Se describe el mtodo enzimtico con el uso de Glicerol Fosfato oxidasa como enzima que cataliza la formacin de perxido de hidrgeno y Peroxidasa como responsable de la separacin de Oxgeno del perxido. Esta metodologa es ampliamente utilizada hoy en da y aplicable a cualquier analizador.El mercado provee de kits comerciales para su uso . Los laboratorios que no empleen esta metodologa seguiran sus instructivos de acuerdo a las normas del fabricante del kit comercial o de la referencia bibliogrfica utilizada para el desarrollo de la prueba. Se sugiere en todo caso, mantener dichas instrucciones al alcance del personal que labora en el rea y para efectos de auditoras y/o supervisiones. 6.4.3 Descripcin del Mtodo Los triglicridos presentes en la muestra, sufren una escisin inicial, dando lugar a la separacin del glicerol y los cidos grasos. Luego, el glicerol es unido a adenosina trifosfato (ATP) que, en presencia de glicerolquinasa, cede un fsforo al glicerol, convirtindolo en glicerol 3-P. Este, unido al oxgeno y bajo la accin de la Glicerol Fosfato oxidasa forma una cetona y perxido de hidrgeno. Finalmente, el Perxido de hidrgeno, ante la presencia de la Peroxidasa, cede oxgeno, el cual es capturado por la 4-aminofenazona en presencia de clorofenol, terminando en un compuesto coloreado o quinonimina roja. Este ltimo componente es medido fotomtricamente , estando en relacin direca a las concentraciones previas de triglicrido. El rango de medicin se establece en 500-505 nm o bien con filtro verde (490-530 nm) en fotmetros que lo utilicen.
Lipasa

Triglicridos + H2O
Gliceroquinasa

Glicerol + Acidos grasos Glicerol 3-P + ADP

Glicerol + ATP
Glicerol Fosfato Oxidasa

Glicerol 3-P + O2

Dihidroxiacetona-P + H2O2 Quinonimina

2 H2O2 + 4-Aminofenazona + Clorofenol

49

6.4.4 Tipo de Muestra Primaria

Puede utilizarse suero o plasma. Condicin importante: Ayuno de 12 horas.

6.4.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recoleccin 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mnimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recoleccin al vaco(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la seccin de Toma de Muestras para las generalidades de la venopuncin. 6.4.4.2 Obteniendo Plasma En caso de utilizar plasma, recurra a la utilizacin de 01 tubo de ensayo provisto con EDTA-K como anticoagulante. En los sistemas de recoleccin al vaco es fcil obtener la proporcin adecuada de mezcla, obteniendo el volumen de muestra fijado por el fabricante. Otros anticoagulantes como heparina, oxalato o fluoruro no interfieren en la reaccin, por lo que tambin pueden emplearse. 6.4.4.3 Separacin de la Muestra y Preservacin Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de glbulos rojos. Los triglicridos son estables en estas muestras durante 3 a 5 das a temperatura de refrigeracin (2-8 C). No congelar.

6.4.5

Equipos y Materiales

6.4.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm. En el caso de espectrofotmetros se aconsejan lecturas a 505 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.4.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material.

50

6.4.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Bao Mara : Para la respectiva incubacin durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reaccin, en el caso de preparacin de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. e) Reloj o timer.

6.4.6

Reactivos

6.4.6.1 Reactivo Comercial Resulta una prctica muy generalizada la utilizacin de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribucin en el mercado. La nica indicacin sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relacin al uso y preservacin de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acpite, se describir el procedimiento estndar utilizado por la mayora de proveedores.

6.4.6.2 Reactivos Provistos en Kits Comerciales Standard : El patrn Standard generalmente se provee en concentraciones de 200mg/dl en forma de solucin de glicerol. Enzimas : Se provee una suspensin conteniendo : lipoproten lipasa,glicerolquinasa, glicerolfosfato oxidasa, Peroxidasa, adenosina trifosfato y 4-amiofenazona . Buffer con solucin de Goods y Clorofenol Los reactivos arriba indicados expiran en la fecha grabada en la etiqueta del fabricante. Conservar a 2-8 C. Reactivo de Trabajo : Ceirse a las recomendaciones del fabricante en cuanto a proporciones de mezcla de cada uno de los elementos reactivos del kit. Generalmente, el reactivo de trabajo es estable por un mes a temperatura de refrigeracin ( 2-8 C). Indicios de inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez partculas tanto en el Standard como en el reactivo de trabajo. Adems, vigilar las recomendaciones del proveedor en cuanto a la absorbancia del blanco de reactivo, la cual tiene un lmite .

51

6.4.7

Procedimientos

El siguiente es un procedimiento que indica proporciones estandarizadas por la mayora de fabricantes : Pipetee en tubos de ensayo de 13 x 100 mm los siguientes componentes : Muestra Reactivo(ml) Blanco Standard Muestra React. De trabajo Standard Muestra Control 1.0 --1.0 0.01 -1.0 -0.01

Mezclar bien e incubar a 37C en bao mara por 5 minutos. Retirar del bao de agua y preparar el espectrofotmetro fotmetro para la lectura respectiva. Leer la absorbancia del blanco, standard y muestra a 500-505 nm filtro verde (490-530 nm) en fotmetro con filtros. Blanquee a cero previamente con agua destilada. Las proporciones arriba indicadas pueden aumentarse proporcionalmente de acuerdo a las necesidades de cada laboratorio y su infraestructura.

6.4.8

Clculo de resultados

La linealidad para los grficos de calibracin ha sido bien documentada por diversos fabricantes de kits comerciales. Se ha obtenido un nvel mnimo de linealidad de 600 mg/dl, razn por la cual basta utilizar un solo standard para la calibracin de la prueba y para los clculos respectivos de la concentracin mediante la frmula :

Absorbancia de la muestra Concentracin (mg/dl) = Absorbancia de Standard x 200

6.4.9

Procedimientos de Control de Calidad.

Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo.

52

Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.4.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 1.0 g/dl), bilirrubina (> 2.5 mg/dl) mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos.

6.4.11 Intervalos de Referencia Biolgica Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos (2001) y, al ltimo reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los siguientes valores de referencia en adultos : Deseable Aceptable : Menor de 150 mg/dl Moderadamente alto : 150-199 mg/dl Alto elevado : 200-499 mg/dl. Muy alto muy elevado : Mayor o igual a 500 mg/dl.

6.4.12 Valores de Alerta/Crticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.4.13 Interpretacin de Laboratorio 6.4.13.1 Elevaciones de Tiglicridos : Adems de comportarse como factor independiente en la enfermedad arterial coronaria, la hipertrigliceridemia se observa en enfermedades hepatobiliares, diabetes mellitus, nefrosis, hipotiroidismo, alcoholismo, hiperlipoproteinemias familiares tipo IV y V. 6.4.13.2 Disminucin de Triglicridos : Puede detectarse niveles bajos de colesterol en condiciones extremas de desnutricin.

6.4.14 Especificaciones de desempeo 6.4.14.1 Linealidad : Vara segn los fabricantes. Se sita entre 600 a 1000 mg/dl. 6.4.14.2 Lmite de deteccin : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre 0.8 mg/dl y 1.6 mg/dl. 6.4.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, esta metodologa arroja coeficientes de variacin entre 1.7% y 2.6 %. 6.4.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variacin se sitan entre 0.7 y 1.7 % para la metodologa.

53

6.4.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad Los procedimientos mencionados utilizan fenol, el cual es txico e irritante. No inhalar ni exponer piel y mucosas al contacto de este elemento.

6.4.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.4.16.1 Controlar la temperatura exacta del bao mara. La variacin no puede ser mayor a +/- 0.1C. 6.4.16.2 Observar que el nivel de agua del bao cubra el nivel superior de los tubos en incubacin. 6.4.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.4.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.

54

6.5 6.5.1

HDL-COLESTEROL : METODOS : A) PRECIPITACIN B) DIRECTO Presentacin

Las lipoprotenas constituyen macromolculas de forma esfrica con una capa externa de protenas, fosfolpidos y colesterol libre en diversa proporcin. La parte central de la esfera contiene bsicamente colesterol esterificado y triglicridos, cuya concentracin difiere segn el tipo de lipoprotena. La funcin principal de estas molculas es transportar adecuadamente los lpidos dentro de un medio acuoso como es el torrente sanguneo. Las HDL cumplen importante funcin va el mecanismo reverso, retornando colesterol perifrico desde los tejidos hacia el hgado. Esto permite afirmar que su actividad es cardioprotectiva, razn por la cual son sus disminuciones las que tienen un efecto contrario en la enfermedad cardiovascular. 6.5.2 Principio del Procedimiento

Se presentan dos procedimientos. Uno de ellos, el referido al uso de reactivo precipitante es el ms conocido y difundido, si bien con tendencia a ser suplantado por la medicin directa, de mayor facilidad en el trabajo y mayor precisin . La metodologa con reactivo precipitante implica el uso de un agregado de acido fosfotngstico con iones magnesio, logrando la precipitacin selectiva de las fracciones LDL y VLDL, quedando en el sobrenadante (luego de una centrifugacin) la fraccin HDL, a la cual se le mide el colesterol. Por otro lado, la determinacin directa de HDL se basa en el uso de detergentes y polmeros que logran fraccionar y solubilizar las HDL, permitiendo posteriormente su determinacin va la cuantificacin de colesterol. 6.5.3 Descripcin del Mtodo

6.5.3.1 Determinacin de HDL con Reactivo Precipitante Las lipoprotenas HDL se separan precipitando las VLDL y LDL gracias al agregado de Acido Fosfotngstico y iones magnesio en forma de cloruro de magnesio. Luego de un determinado tiempo de reposo entre reactivo y muestra, se procede a un centrifugado de esta reaccin capturando una porcin del sobrenadante. Esta muestra se procesa con el reactivo de determinacin de colesterol, generalmente suplido con el kit comercial. De no ser as, puede emplearse el reactivo utilizado normalmente para el anlisis de colesterol, siempre y cuando se respeten las diluciones propuestas por el fabricante. 6.5.3.2 Determinacin de HDL sin precipitacin directo Para esta determinacin se usan polmeros o polianiones que logran mantener como complejos estables a las VLDL, LDL y Quilomicrones, no logrando su solubilizacin en la reaccin. Al contrario, la accin de un detergente especfico permite a las HDL su fragmentacin y solubilizacin, con lo que su aporte de colesterol ser cuantificado posteriormente sin la necesidad del paso de centrifugacin.

55

Polianin Lipoprotenas de bajo peso molecular Detergente HDL-colesterol HDL-colesterol soluble en solucin

Estabilizacin de complejos Fragmentacin de HDL Determinacin deColesterol (Colesterol Oxidasa)

6.5.4 Tipo de Muestra Primaria

Puede utilizarse suero o plasma. Condicin importante: Ayuno de 12 horas.

6.5.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recoleccin 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mnimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recoleccin al vaco(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la seccin de Toma de Muestras para las generalidades de la venopuncin. 6.5.4.2 Obteniendo Plasma En caso de utilizar plasma, recurra a la utilizacin de 01 tubo de ensayo provisto con EDTA-K como anticoagulante o heparina. Algunos fabricantes prefieren el uso de heparina si se trabaja con plasma. En todo caso, consulte dichas recomendaciones en el inserto del kit. En los sistemas de recoleccin al vaco es fcil obtener la proporcin adecuada de mezcla, obteniendo el volumen de muestra fijado por el fabricante. Otros anticoagulantes como oxalato o fluoruro no interfieren en la reaccin, por lo que tambin pueden emplearse. 6.5.4.3 Separacin de la Muestra y Preservacin Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de glbulos rojos. Las partculas de HDL son estables en estas muestras durante 7 das a temperatura de refrigeracin (2-8 C). Sin embargo, algunos autores prefieren procesos mucho ms rpidos, con un mximo de almacenamiento de 3 das.

56

6.5.5 Equipos y Materiales 6.5.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm y en algunos kits se requiere lecturas de 600/700 nm. Los equipos automatizados suelen poseer estos filtros, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.5.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material.

6.5.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Bao Mara : Para la respectiva incubacin durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reaccin, en el caso de preparacin de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. e) Reloj o timer. f) Centrfuga de tubos.

6.5.6

Reactivos

6.5.6.1 Reactivo Comercial Resulta una prctica muy generalizada la utilizacin de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribucin en el mercado. La nica indicacin sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relacin al uso y preservacin de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acpite, se describir el procedimiento estndar utilizado por la mayora de proveedores.

57

6.5.6.2Reactivos Provistos en Kits Comerciales 6.5.6.2.1 Reactivos del Mtodo de Precipitacin a. Standard : El patrn Standard generalmente se provee en concentraciones variables de colesterol etiquetadas en el frasco. Otros kits podran no contenerlo. Verificar informacin en su instructivo. b. Reactivo Precipitante: Se provee una suspensin conteniendo : Fosfotungstato (Acido Fosfotngstico) y Cloruro de Magnesio. c. Set de enzimas para la determinacin de Coleserol : Colesterol esterasa, colesterol oxidasa, peroxidasa, 4-aminofenazona, fosfatos, diclorofenolsulfonato. d. Los reactivos arriba indicados expiran en la fecha grabada en la etiqueta del fabricante.Conservar de 2-8 C, a excepcin del reactivo precipitante, capaz de ser almacenado a temperatura ambiente segn muchos fabricantes. Verificar esta ltima informacin en su instructivo comercial. e. Indicios de inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez partculas tanto en el Standard como en los reactivos 6.5.6.2.2 Reactivos del Mtodo sin Precipitacin Directo a) Calibrador : Suero humano liofilizado conteniendo diversas concentraciones de lipoprotenas, especialmente HDL/LDL. Estas concentraciones varan, verificar la etiqueta del frasco o el instructivo comercial. b) Detergentes/Polmero/Enzimas: Las concentraciones y presentacione cambian segn el tipo de reactivo, pero lo usual es separar por un lado el polmero o polianin con alguna de las enzimas implicadas en los primeros pasos de la reaccin de determinacin de colesterol y en segundo trmino el detergente con la cantidad mayor de enzimas implicadas en la metodologa enzimtica con colesterol oxidasa. c) Conservar a 2-8C. El calibrador es estable 1 semana a estas temperaturas, pero puede alicuotarse y almacenarse a -20C por un mes. El resto de los reactivos una vez abiertos son estables por unas semanas. Verificar esta informacin. d) Indicios de Inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez partculas tanto en el Standard como en los reactivos 6.5.7 Procedimientos

6.5.7.1 Metodologa con Reactivo Precipitante El siguiente es un procedimiento que indica proporciones estandarizadas por la mayora de fabricantes :

a. Pipetear en un tubo 13 x 100 mm : Muestra Reactivo Precipitante 0.2 ml 0.5 ml

58

b. Mezclar bien y dejar en reposo por 10 minutos a temperatura ambiente . c. Centrifugar 10 minutos a 4,000 rpm. Esta informacin debe ser confrontada con el reactivo comercial . Existen diversas alternativas de variar el tiempo y rpm. d. Extraer el sobrenadante. e.Proceder al segundo tiempo de reacciones (Determinacin del Colesterol HDL):

Blanco

Standard

Muestra

Agua destilada Standard colesterol Sobrenadante Reactivo de enzimas

0.05 ml --1.0 ml

-0.05 ml -1.0 ml

--0.05 ml 1.0 ml

Las cantidades arriba citadas varan en cada kit. El anterior ejemplo slo presente ser demostrativo de una variante. Consulte su instructivo y no olvide trasladarlo por escrito a su documento de procedimientos.

f. Mezclar bien e incubar a 37C en bao mara por 10 minutos. Retirar del bao de agua y preparar el espectrofotmetro fotmetro para la lectura respectiva. g. Leer la absorbancia del blanco, standard y muestra a 500-505 nm filtro verde (490-530 nm) en fotmetro con filtros. Blanquee a cero previamente con agua destilada.

59

6.5.7.2 Procedimiento con Metodologa sin precipitacin o Directa Para este caso, los procedimientos y concentraciones varan. En general se intenta incubar en un primer paso la muestra y el calibrador, con el objeto de fragmentar la HDL-colesterol y poder luego, en un segundo paso, gracias a las enzimas provistas por la metodologa colesterol oxidasa, determinar la concentracin de colesterol de las HDL. Las lecturas varan : en algunos se utiliza 505 nm, en otras variantes 600/700 nm. Verifique el instructivo.

6.5.8

Clculo de resultados

6.5.8.1 Metodologa con Reactivo Precipitante Al variar las cantidades de reactivos con muestras, los clculos varan segn el kit comercial empleado. Respetar la sugerencia del fabricante. A continuacin, la frmula empleada de manera genrica :

Concentracin de Muestra = Absorbancia de Muestra x Concent. Standard x F Absorbancia Standard

Donde F= Factor de dilucin de muestra

6.5.8.2 Metodologa sin reactivo de precipitacin y directa. Al ser una tcnica que llega a 2 pasos, existen dos lecturas de absorbancia, la primera de ellas luego de la primera incubacin (A1) y la segunda al final de la reaccin completa (A2). Se realiza el mismo procedimiento con el calibrador. El clculo general ser el siguiente :

Concentracin de muestra= A2-A1 (Muestra) x Concent. Calibrador A2-A1 (Calibrador)

60

6.5.9

Procedimientos de Control de Calidad.

Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.5.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), bilirrubina (> 10 mg/dl) mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos. Es discutible la interferencia de los triglicridos en cuanto a cifras, pero es aconsejable considerar esta accin a cifras superiores a 1000 mg/dl.

6.5.11 Intervalos de Referencia Biolgica Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos (2001) y, al ltimo reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los siguientes valores de referencia en adultos : Deseable : 40-60 mg/dl Protectivo : Mayor de 60 mg/dl

6.5.12 Valores de Alerta/Crticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.5.13 Interpretacin de Laboratorio La disminucin de cifras de HDL-colesterol se considera en correlacin positiva en la incidencia de la enfermedad coronaria arterial y, en general, en la incidencia de ateroesclerosis. Existen tambin otros estados patolgicos en los cuales se puede evidenciar disminucin de estas cifras : enfermedad heptica, malnutricin, diabetes mellitus, anemia crnica, ansiedad, tabaquismo. 6.5.14 Especificaciones de desempeo 6.5.14.1 Linealidad : Vara segn los fabricantes. Se sita entre 150 a 500 mg/dl para ambas metodologas. 6.5.14.2 Lmite de deteccin : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre 3.0 mg/dl para la metodologa precipitante y 6.0 mg/dl en el mtodo directo. 6.5.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, estas metodologas arrojan coeficientes de variacin entre 3.1 % y 4.2 %.

61

6.5.14.3 Repetitibilidad : Los coeficientes de variacin se sitan entre 2.0 % y 3.3 % para las metodologas.

6.5.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad

6.5.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.4.16.1 Controlar la temperatura exacta del bao mara. La variacin no puede ser mayor a +/- 0.1C. 6.4.16.2 Observar que el nivel de agua del bao cubra el nivel superior de los tubos en incubacin. 6.4.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.4.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.

62

6.6

LDL-COLESTEROL :METODOS: A) PRECIPITACIN B)DIRECTO

6.6.1 Presentacin Con una carga de 50 % de colesterol transportado, bsicamente de naturaleza endgena, la lipoprotena LDL se convierte en factor clave en la patogenia de la enfermedad cardiaca coronaria. Su funcin es precisamente transportar este colesterol al interior de las clulas, convirtindose por lo tanto en un elemento comprometido en la formacin de la placa ateromatosa. Numerosos estudios le han asignado el papel negativo en este proceso y sus cifras debieran vigilarse ante alguna evidencia clnica, incluso con cifras normales de colesterol total. Por otro lado, el aumento de esta lipoprotena puede sobrepasar largamente el efecto de las HDL, las cuales slo tienen un papel protector hasta cierto lmite. 6.6.2 Principio del Procedimiento Se describen dos metodologas. La primera en relacin al uso de reactivo precipitante, el cual provoca una sedimentacin de esta macromolcula, dejando en el sobrenadante las HDL y VLDL, las cuales, por diferencia con el colesterol total indicaran el tenor de LDL-colesterol. El segundo procedimiento implica el uso de detergentes y polmeros parala solubilizacin especfica de las LDL y su posterior cuantificacin, va su colesterol. 6.6.3 Descripcin del Mtodo 6.6.3.1 Mtodo con Reactivo Precipitante Mediante el agregado de polmeros de alto peso molecular, las LDL son precipitadas para dejar tras una centrifugacin un sobrenadante con el colesterol de las HDL y VLDL. Este colesterol se determina y luego se resta del colesterol total, quedando calculado el LDL-colesterol. 6.6.3.2 Mtodo sin reactivo precipitante o Directo En ese mtodo, se emplea un primer paso para solubilizar el colesterol de HDL, VLDL y Quilomicrones, logrando consumir este compuesto va enzimas, sin desarrollo de color. Esto se logra va un primer agente tensioactivo. Aplicando otra concentracin de agente tensioactivo, se logra en un segundo paso solubilizar la LDL restante y, esta vez, someter su colesterol a una cuantificacin directa.

Polmero-Detergente-Enzimas

HDL + VLDL +Quilomicrones

Agente tensioactivo

Liberacin de colesterol y Consumo por Enzimas. Colesterol para Ser medido.

LDL-colesterol

63

6.6.4 Tipo de Muestra Primaria

Se debe usar suero. Slo en algunos kits se condiciona el uso de plasma bajo recoleccin con EDTA heparina y con metodologa directa. Condicin importante: Ayuno de 12 horas.

6.6.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recoleccin 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mnimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recoleccin al vaco(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la seccin de Toma de Muestras para las generalidades de la venopuncin.

6.6.4.2 Separacin de la Muestra y Preservacin Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de glbulos rojos. Las partculas de LDL son estables en estas muestras durante 24 horas a temperatura de refrigeracin (2-8 C) cuando se practica la metodologa con reactivo precipitante y entre 4-5 das en refrigeracin para el mtodo directo.

6.6.5 Equipos y Materiales 6.6.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm y 600 a 700 nm. Los equipos automatizados suelen poseer estos filtros, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.6.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material.

64

6.6.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Bao Mara : Para la respectiva incubacin durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reaccin, en el caso de preparacin de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. e) Reloj o timer. f) Centrfuga de tubos.

6.6.6

Reactivos

6.6.6.1 Reactivo Comercial Resulta una prctica muy generalizada la utilizacin de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribucin en el mercado. La nica indicacin sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relacin al uso y preservacin de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acpite, se describir el procedimiento estndar utilizado por la mayora de proveedores.

6.6.6.2Reactivos Provistos en Kits Comerciales 6.6.6.2.1 Reactivos del Mtodo de Precipitacin a. Reactivo Precipitante : Solucin de polivinil sulfato disuelto en polietilenglicol. Conservar a 2-8C hasta fecha de expiracin. b. Indicios de inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez partculas tanto en el Standard como en los reactivos, al igual que cambios de color. c. Adicionalmene, se requiere un kit para determinacin de colesterol por mtodo enzimtico de colesterol oxidasa.

65

6.6.6.2.2 Reactivos del Mtodo sin Precipitacin Directo a) Calibrador : Suero humano liofilizado conteniendo diversas concentraciones de lipoprotenas, especialmente HDL/LDL. Estas concentraciones varan, verificar la etiqueta del frasco o el instructivo comercial. b) Detergentes/Polmero/Enzimas: Las concentraciones y presentaciones cambian segn el tipo de reactivo dando como resultado 2 reactivos separados. c) Conservar a 2-8C. El calibrador es estable 1 semana a estas temperaturas, pero puede alicuotarse y almacenarse a -20C por un mes. El resto de los reactivos una vez abiertos son estables por 4 semanas. Verificar esta informacin. d) Indicios de Inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez partculas tanto en el Standard como en los reactivos 6.6.7 Procedimientos

6.6.7.1 Metodologa con Reactivo Precipitante El siguiente es un procedimiento que indica proporciones estandarizadas por la mayora de fabricantes :

a. Pipetear en un tubo 13 x 100 mm : Muestra Reactivo Precipitante 0.4 ml 0.2 ml

b. Mezclar bien y dejar en reposo por 15 minutos a temperatura ambiente . c. Centrifugar 15 minutos a 4,000 rpm. Esta informacin debe ser confrontada con el reactivo comercial . Existen diversas alternativas de variar el tiempo y rpm. d. Extraer el sobrenadante. e.Proceder al segundo tiempo de reacciones (Determinacin del Colesterol en el sobrenadante):

Blanco

Standard

Muestra

Agua destilada Standard colesterol Sobrenadante Reactivo de enzimas

0.02 ml --1.0 ml

-0.02 ml -1.0 ml

--0.02 ml 1.0 ml 66

Las cantidades arriba citadas varan en cada kit. El anterior ejemplo slo presente ser demostrativo de una variante. Consulte su instructivo y no olvide trasladarlo por escrito a su documento de procedimientos.

f. Mezclar bien e incubar a 37C en bao mara por 10 minutos. Retirar del bao de agua y preparar el espectrofotmetro fotmetro para la lectura respectiva. g. Leer la absorbancia del blanco, standard y muestra a 500505 nm filtro verde (490-530 nm) en fotmetro con filtros. Blanquee a cero previamente con agua destilada.

6.6.7.2 Procedimiento con Metodologa sin precipitacin o Directa Para este caso, los procedimientos y concentraciones varan. En general se intenta incubar en un primer paso la muestra y el calibrador, con el objeto de solubilizar el colesterol de todas las lipoprotenas, excepto la LDL-colesterol, consumiendo las primeras sin que reaccionen y poder luego, en un segundo paso, gracias a las enzimas provistas por la metodologa colesterol oxidasa , determinar la concentracin de colesterol de las LDL.De esta forma, hay una lectura de absorbancia por cada uno de los pasos, tanto para las muestras como para el calibrador.

6.6.8

Clculo de resultados

6.6.8.1 Metodologa con Reactivo Precipitante Al variar las cantidades de reactivos con muestras, los clculos varan segn el kit comercial empleado. Respetar la sugerencia del fabricante. A continuacin, la frmula empleada de manera genrica :

67

Concentracin de Muestra = Absorbancia de Muestra x Concent. Standard x F Absorbancia Standard

Donde F= Factor de dilucin de muestra

Con esto se obtiene la concentracin del colesterol del sobrenadante. Para calcular el colesterol de LDL, debe lograrse una diferencia entre el colesterol total del paciente y la concentracin obtenida con el clculo anterior :

Concentracin de LDL-colesterol= Colesterol total Colesterol del sobrenadante

6.6.8.2 Metodologa sin reactivo de precipitacin y directa. Al ser una tcnica que llega a 2 pasos, existen dos lecturas de absorbancia, la primera de ellas luego de la primera incubacin (A1) y la segunda al final de la reaccin completa (A2). Se realiza el mismo procedimiento con el calibrador. El clculo general ser el siguiente :

Concentracin de muestra= A2-A1 (Muestra) x Concent. Calibrador A2-A1 (Calibrador)

6.6.9

Procedimientos de Control de Calidad.

Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.6.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), bilirrubina (> 10 mg/dl) mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos. Es discutible la interferencia de los triglicridos en cuanto a cifras, pero es aconsejable considerar esta accin a cifras superiores a 1000 mg/dl.

68

6.6.11 Intervalos de Referencia Biolgica Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos (2001) y, al ltimo reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los siguientes valores de referencia en adultos : Deseable : Menor a 130 mg/dl. Riesgo Moderado a Elevado : 130-189 mg/dl. Riesgo muy elevado : Mayores o iguales a 190 mg/dl .

6.6.12 Valores de Alerta/Crticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.6.13 Interpretacin de Laboratorio El aumento de las cifras de LDL-colesterol se observan en ateroesclerosis y sus consecuencias, especialmente infarto de miocardio y accidentes cerebrovasculares. Igualmente se detecta aumento en nefrosis, diabetes mellitus, obesidad y tabaquismo.

6.6.14 Especificaciones de desempeo 6.6.14.1 Linealidad : Vara segn los fabricantes. Se sita entre 450 a 1000 mg/dl (ms alta con el mtodo precipitane)para ambas metodologas. 6.6.14.2 Lmite de deteccin : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre 0.45 mg/dl para la metodologa precipitante y 3.5 mg/dl en el mtodo directo. 6.6.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, estas metodologas arrojan coeficientes de variacin entre 1.5 a 4.8 %. 6.6.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variacin se sitan entre 1.4 % y 2.7 % para las metodologas.

6.6.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad

6.6.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.6.16.1 Controlar la temperatura exacta del bao mara. La variacin no puede ser mayor a +/- 0.1C. 6.6.16.2 Observar que el nivel de agua del bao cubra el nivel superior de los tubos en incubacin.

69

6.6.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.6.16.4Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes. 6.6.16.5 Observar un sobrenadante claro. La aparicin de turbidez puede implicar la necesidad de adicionar otra cantidad de precipitane. Verificar los instructivos comerciales para las correcciones respectivas. 6.6.16.6 En la metodologa con precipitane, procurar no dejar el precipitado en contacto con el sobrenadante, debido a que puede haber redisolucin del colesterol de las otras lipoprotenas, disminuyendo en el clculo final el tenor de LDL-colesterol.

70

6.7

UREA : METODO ENZIMATICO CON UREASA

6.7.1 Presentacin La rea es producida en el hgado, como paso final de la desaminacin de aminocidos y excretada posteriormente a travs de la orina. Es una porcin importante del nitrgeno no proteico y va final delmetabolismo de este gran grupo metablico. Su relacin con la funcin renal es clara, si bien se debe estudiar igualmente los factores extrarrenales de su elevacin en sangre. 6.7.2 Principio del Procedimiento Se describir un mtodo enzimtico espectrofotomtrico al alcance de la mayora de laboratorios por medio de kits comerciales. El uso de la ureasa como enzima principal h apermitido establecer no slo esta tcnica colorimtrica, sino tambin modificaciones que permiten reacciones para lectura en ultravioleta, lo cual no ser materia del presente manual . Para la tcnica colorimtrica se establece la accin de la ureasa sobre la rea, descomponindola y permitiendo posteriores reacciones con el objeto de formar un compuesto coloreado medible. 6.7.3 Descripcin del mtodo La ureasa acta sobre la rea, permitiendo la formacin de dixido de carbono y amonaco, reaccionando este ltimo con salicilato e hipoclorito, reaccin en medio alcalino que origina indofenol de color verde, medible fotomtricamente a 570 nm.

Ureasa

Urea + H2O

2 NH4+ + CO2
Nitroprusiato

NH4+ + Salicilato +Hipoclorito de sodio

Indofenol

6.7.4 Tipo de Muestra Primaria 6.7.4.1 Puede usarse suero, plasma u orina. Utilizar la orina diluida 1/50 con agua destilada y multiplicar el resultado por esta dilucin. Para el uso de plasma, obtenerla a partir de heparina como anticoagulante. Ceirse a otras instrucciones impartidas en la seccin de venopuncin en Toma de Muestras. 6.7.4.2 La rea en suero es estable por 7 das a 2-8C. En muestras de orina es estable por 3 das en refrigeracin , salvo excesivo crecimiento bacteriano. Para aumentar a 6 meses la conservacin deben usarse temperaturas de 20C o ms bajas.

71

6.7.5 Equipos y Materiales 6.7.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura entre 600 +/- 20 nm (filtro naranja) o bien espectrofotometra para lecturas a 570-600nm. Los equipos automatizados suelen poseer estos filtros, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.7.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad de 1 a 10 ml para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material.

6.7.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Bao Mara : Para la respectiva incubacin durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reaccin, en el caso de preparacin de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. e) Reloj o timer.

6.7.6

Reactivos

6.7.6.1 Reactivo Comercial Resulta una prctica muy generalizada la utilizacin de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribucin en el mercado. La nica indicacin sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relacin al uso y preservacin de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acpite, se describir el procedimiento estndar utilizado por la mayora de proveedores.

72

6.7.6.2Reactivos Provistos en Kits Comerciales a) b) c) d) e) Reactivo 1 : Salicilato d e sodio, nitroprusiato sdico, tampn. Reactivo 2 : Solucin de Hipoclorito de sodio en hidrxido de sodio. Reactivo 3 : Ureasa. Standard: La concentracin de rea vara segn el fabricante. Conservar a 2-8 C. El tiempo de estabilidad depender del tipo de reactivo. El reactivo 1 y 2 son estables hasta la fecha de caducidad. El reactivo de trabajo con ureasa es la mezcla del reactivo 1 con el reactivo 3 bajo medidas que depende de especificaciones propias de cada kit; suele ser estable por un mes luego de su preparacin y en refrigeracin. f) Verificar indicios de deterioro mediante observacin de turbidez, partculas o absorbancia de blanco superior a la indicada por el fabricnte. Procedimientos

6.7.7

a) Pipetear en tubos de ensayo 13 x 100 mm :

Blanco

Standard

Muestra

Standard Muestra

---

0.01 ml --

-0.01 ml

Reactivo de TrabaJo ( 1 + 3) 1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

b) c) d) e)

Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 C. Agregar a cada uno de los tubos anteriores 1.o ml de Reactivo 2. Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 C. Leer absorbancia de muestras y Standard a 600 nm.

73

6.7.8

Clculo de resultados

Concentracin de muestra= Absorbancia de muestra x Concent.Standard Absorbancia Standard

6.7.9

Procedimientos de Control de Calidad.

Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.7.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.2 g/dl), bilirrubina (> 20 mg/dl) mg/dl), triglicridos ( > 1000 mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos.

6.7.11 Intervalos de Referencia Biolgica Cada laboratorio deber establecer sus propios rangos referenciales, en razn a recomendaciones del proveedor o bajo estudio de poblacin. Como cifras de orientacin, se dan las siguentes : Urea (Suero y Plasma) : 10-45 mg/dl Urea (Orina) : 20 40 g/24 horas.

6.7.12 Valores de Alerta/Crticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.7.13 Interpretacin de Laboratorio Se encuentran concentraciones elevadas en diversas disfunciones renales, adems de uremias extrarrenales como dieta hiperproteica, aumento de catabolismo proteico, post hemorragia gastrointestinal, deshidratacin, shock, insuficiencia cardiaca, uso de corticoides, litiasis renal, hipertrofia prosttica. No considerar la elevacin de la rea

74

como nico indicador de enfermedad renal, debido a su amplia variacin por causas extrarrenales. 6.7.14 Especificaciones de desempeo 6.7.14.1 Linealidad : Vara segn los fabricantes. Se sita entre 250 a 300 mg/dl . 6.7.14.2 Lmite de deteccin : Igualmente, los diferentes productos citan cifras alrededor de 1.3 mg/dl. 6.7.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, estas metodologas arrojan coeficientes de variacin entre 1.32 % a 2.4 %. 6.7.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variacin se sitan entre 0.8 y 1.6 %.

6.7.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad El Reactivo 2 de hipoclorito sdico es irritante. En caso de contacto con ojos, lvese abundantemente con agua y acuda al mdico. Deben usarse guantes y proteccin para ojos y cara. 6.7.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.7.16.1 Controlar la temperatura exacta del bao mara. La variacin no puede ser mayor a +/- 0.1C. 6.7.16.2 Observar que el nivel de agua del bao cubra el nivel superior de los tubos en incubacin. 6.7.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.7.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes. 6.7.16.5 Conservar estrictamente la reaccin de trabajo con ureasa a 2-8 C. Debido a sus propiedades enzimticas es muy sensibles a cambios de temperatura. Periodos prolongados a temperatura ambiente reducen su estabilidad. 6.7.16.6 En relacin a los rangos referenciales,tomar en cuenta el sexo como fuente de variabilidad (mayor cantidad en hombres) y la edad ( cifras menores en neonatos y mayores en ancianos).

75

6.8 6.8.1

CREATININA : METODO DE JAFFE/PICRATO ALCALINO Presentacin

La creatinina es un producto de degradacin formado en el msculo partir de la creatin fosfato.El compuesto es muy estable en concentraciones a nivel de sangre y excrecin urinaria en individuos normales, de ah que resulte un gran marcador de disfuncin renal. Su eliminacin es casi exclusivamente por orina, siendo til su cuantificacin en sangre y orina para los clculos del clearance o depuracin de creatinina. 6.8.2 Principio del Procedimiento

La creatinina presente en suero y plasma reacciona con el picrato en medio alcalino (reaccin de Jaff), produciendo un cromgeno rojo. Se describir un mtodo cintico con lectura espectrofotomtrica en visible. No se requiere como en la tradicional variante, el paso previo de desproteinizacin. Para realizar este procedimiento es necesario obtener el kit comercial, compatible con la metodologa descrita. 6.8.3 Descripcin del Mtodo

En la reaccin de Jaff, la produccin del cromgeno rojo se puede medir a intervalos de tiempo controlados, siendo esta velocidad de reaccin, una medida de la concentracin de creatinina en la muestra. Se ha observado que la mayora de cromgenos distintos a la creatinina, reaccionan dentro de los primeros 30 segundos de la reaccin, siendo la creatinina la nica que incrementa el color de la reaccin luego de ese tiempo. Esta es la razn por la que se mantiene la medida de la absorbancia entre los 30 segundos y los 5 minutos iniciales. 6.8.4 Tipo de Muestra Primaria

Puede utilizarse suero u orina de 2 y 24 horas de recoleccin.

6.8.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recoleccin 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mnimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recoleccin al vaco(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la seccin de Toma de Muestras para las generalidades de la venopuncin. 6.8.4.2 Recoleccin de Orina Recolectar orina de 2 24 horas en un recipiente limpio, manteniendo el mismo en refrigeracin mientras dure su coleccin. Posteriormente medir el volumen y utiizar una muestra con dilucin 1/50. La recoleccin de orina de 2 horas requiere de la multiplicacin del volumen por 12, simulando una recoleccin de 24 horas.

76

6.8.4.3 Separacin de la Muestra y Preservacin Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero del paquete de glbulos rojos. La creatinina en suero es estable 24 horas en refrigeracin de 2-8C. La orina mantiene creatinina estable por 4 das.

6.8.5 Equipos y Materiales 6.8.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm. En el caso de espectrofotmetros se aconsejan lecturas a 505 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.8.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material. 6.8.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Bao Mara : Para la respectiva incubacin durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 25C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reaccin, en el caso de preparacin de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. e) Reloj o timer.

6.8.6

Reactivos

6.8.6.1 Reactivo Comercial Resulta una prctica muy generalizada la utilizacin de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribucin en el mercado. La nica indicacin sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relacin al uso y preservacin de los

77

mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acpite, se describir el procedimiento estndar utilizado por la mayora de proveedores.

6.8.6.2 Reactivos Provistos en Kits Comerciales Standard : El patrn Standard generalmente se provee en concentraciones de 2.0 mg/dl de solucin de creatinina. Acido pcrico. Reactivo Alcalino de Hidrxido de sodio. Los reactivos arriba indicados expiran en la fecha grabada en la etiqueta del fabricante, mantenidos a temperatura ambiente. Reactivo de Trabajo : Ceirse a las recomendaciones del fabricante en cuanto a proporciones de mezcla de cada uno de los elementos reactivos del kit. Generalmente, el reactivo de trabajo se prepara en partes iguales entre el Acido pcrico y el reactivo alcalino, siendo estable por una semana a temperatura ambiente. Indicios de inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez partculas tanto en el Standard como en el reactivo de trabajo. Adems, vigilar las recomendaciones del proveedor en cuanto a la absorbancia del blanco de reactivo, la cual tiene un lmite .

6.8.7

Procedimientos

El siguiente es un procedimiento que indica proporciones estandarizadas por la mayora de fabricantes : Pipetee en tubos de ensayo de 13 x 100 mm los siguientes componentes :

Standard Reactivo Trabajo Standard Muestra 1 ml 0.2 ml --

Muestra 1 ml -0.2 ml

Mezclar bien e incubar a 25C en bao mara,disparando el cronmetro al mismo tiempo.Medir la absorbancia a los 30 segundos (S1 y M1), continuando la incubacin y luego a los 5 minutos de iniciado el conteo(S2 y M2). El espectrofotmetro debe haber sido blanqueado previamente a cero con agua destilada.

78

Leer las absorbancias citadas del Standard y muestra a 500-505 nm filtro verde (490-530 nm) en fotmetro con filtros.

6.8.8

Clculo de resultados

Calcular la creatinina en suero de la siguiente manera :

Concentracin = (M2 M1) x F Donde F = Concentracin de Standard (2.0 mg/dl) S2-S1

Para clculos en orina, multiplicar por el factor de dilucin y luego calcular de acuerdo al volumen en 24 horas. 6.8.9 Procedimientos de Control de Calidad.

Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.8.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.7 g/dl), bilirrubina (> 20 mg/dl), triglicridos (> 1000mg/dl), glucosa (> 500 mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos.

6.8.11 Intervalos de Referencia Biolgica Cada laboratorio establecer sus rangos referenciales de acuerdo a las sugerencias de su proveedor o al estudio de su poblacin. Se citan los siguientes valores como referencia en la metodologa descrita : Suero : 0.8-1.4 mg/dl Orina : 900-1500 mg/dl

79

6.8.12 Valores de Alerta/Crticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.8.13 Interpretacin de Laboratorio Se observan valores incrementados como reflejo de una disminucin en el rango de filtracin glomerular. Las causas pueden ser : Pre-renales : Insuficiencia cardaca, shock, diarrea, diabetes mellitus, uso de diurticos. Renales : Glomerulopatas. Post-renales : Hipertrofia prosttica, litiasis. 6.8.14 Especificaciones de desempeo 6.8.14.1 Linealidad : Vara segn los fabricantes. Se sita en promedio en 6 mg/dl. 6.8.14.2 Lmite de deteccin : Igualmente, los diferentes productos citan cifras distintas. En promedio 0.03 mg/dl. 6.8.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, esta metodologa arroja coeficientes de variacin entre 0.6 % y 3.9 %. 6.8.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variacin se sitan entre 1.3 y 2.9 % para la metodologa. 6.8.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad El cido pcrico es txico y el hidrxido de sodio custico. Evitar contacto con piel y mucosas. 6.8.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.8.16.1 Controlar la temperatura exacta del bao mara. La variacin no puede ser mayor a +/- 0.1C. 6.8.16.2 Observar que el nivel de agua del bao cubra el nivel superior de los tubos en incubacin. 6.8.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.8.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes. 6.8.16.5 Mantener la temperatura controlada. Una diferencia entre la temperatura de incubacin del Standard y Muestras puede disminuir la precisin de la prueba. 6.8.16.6 Respetar los tiempos de lectura . Deben haber mediciones exactas a los 30 segundos y 5 minutos de iniciada la reaccin. Esto puede afectar la exactitud de la prueba. 6.8.16.7 Aunque no ha sido recomendado, el uso de plasma proporciona resultados disminuidos.

80

6.9

PROTEINAS TOTALES : METODO COLORIMETRICO DE BIURET

6.9.1 Presentacin Las protenas son un gran grupo de macromolculas formadas por aminocidos, cuya funcin es primordial en la vida, siendo parte de estructuras celulares, medios de transporte, mecanismos de defensa, catalizadores y en combinacin con otras molculas. Su presencia se advierte al estudio de enzimas, anticuerpos, hormonas, factores de coagulacin, hemoglobina y transportadores como en el caso de lipoprotenas, haptoglobina, transferrina y una serie de elementos que requieren de su presencia al no ser solubles en sangre. Entre los componentes de mayor presencia, la albmina producida en el hgado reviste una importancia especial por las diversas funciones asignadas, as como por las patologa asociada a su descenso. 6.9.2 Principio del Procedimiento Los enlaces peptdicos, formados por los aminocidos presentes en las protena se unen al in cprico y, en medio alcalino, dan lugar a la formacin de un compuesto coloreado de tonalidad violeta. La medicin de este complejo a 540 nm es proporcional a la concentracin de protenas totales. 6.9.3 Descripcin del Mtodo

Cuando se calienta la rea a una temperatura de unos 180C, se descompone transformndose en un producto llamado biuret, el cual en presenciade Cu++, en solucin alcalina, forma un complejo de color violeta o azul violeta. La reaccin tiene lugar como sigue :

UREA

BIURET

Complejo Cu

Esta reaccin coloreada la dan sustancias que contengan 2 molculas CH2 NH2 unidos entre s o a travs de un tomo de Carbono o Nitrgeno y tambin estructuras peptdicas que contengan como mnimo 2 enlaces peptdicos, caracterstica de cualquier protena. Se han propuesto muchas variantes de la reaccin de Biuret con el objeto de estudiar las concentraciones ptimas de cada uno de los componentes y establecer una estabilidad a temperatura ambiente por tiempo prolongado, previniendo la autorreduccin y formacin de xido cuproso.

81

6.9.4 Tipo de Muestra Primaria Se utiliza suero. 6.9.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recoleccin 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mnimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recoleccin al vaco(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la seccin de Toma de Muestras para las generalidades de la venopuncin. 6.9.4.2 Separacin de la Muestra y Preservacin Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero del paquete de glbulos rojos. La muestra puede conservarse hasta 3 das en refrigeracin de 2-8C o en congelador a 20 C por una semana.

6.9.5 Equipos y Materiales 6.9.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura entre 520 -560 nm. En el caso de espectrofotmetros se aconsejan lecturas a 540 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.9.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material. 6.9.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Matraces, vasos de reaccin, en el caso de preparacin de reactivos. c) Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. d) Reloj o timer.

82

6.9.6

Reactivos

6.9.6.1 Reactivo Comercial Resulta una prctica muy generalizada la utilizacin de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribucin en el mercado. La nica indicacin sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relacin al uso y preservacin de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. 6.9.6.2 Reactivo preparado en Laboratorio Puede acceder a la preparacin de una de las variantes de la reaccin de Biuret mediante la preparacin del siguiente reactivo : a) Solucin de Hidrxido de sodio al 10 %. b) Reactivo de Gornall : Sulfato de cobre con 5 molculas de agua.......... 1.5 g Tartrato de sodio y potasio con 4 H2O ............ 6 g Disolver en 500 ml de agua destilada. Agregar a lo preparado 300 ml del hidrxido de sodio al 10 % y completar con agua destilada a 1000 ml. Etiquetar y almacenar el reactivo a temperatura ambiente por tiempo indefinido. Descartar si presenta turbidez o precipitacin. c) Solucin fisiolgica de cloruro de sodio 0.85 %. d) Standard comercial de protenas totales. 6.9.7 Procedimientos

6.9.7.1 Reactivo comercial Mantenga las recomendaciones del proveedor. Recuerde la necesidad de transferir las mismas en un escrito propio de su manual de Procedimientos. Puede resultar til el modelo adjunto en Anexos. 6.9.7.2 Reactivo preparado en el Laboratorio En 3 tubos de ensayo colocar : Blanco Muestra Standard

Standard Suero Suero Fisiol.. Reactivo

--2 ml 8 ml

-0.1 ml 1.9 ml 8 ml

0.1 ml -1.9 ml 8 ml 83

Mezclar y dejar 20 minutos a temperatura ambiente. Leer a 540 nm o en filtro 520-560 nm, blanqueando a cero con el blanco de reactivo.

6.9.8

Clculo de resultados

Calcular la concentracin de protenas en suero de la siguiente manera :

Concentracin = Absorbancia de Muestra x Concent. Standard Absorbancia de Standard

6.9.9

Procedimientos de Control de Calidad.

Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.9.10 Interferencias Interfieren : bilirrubina (> 10 mg/dl), provocando falso aumento. No se ha observado mayor interferencia con hemlisis ligera a moderada ni turbidez por presencia de triglicridos.

6.9.11 Intervalos de Referencia Biolgica Cada laboratorio establecer sus rangos referenciales de acuerdo a las sugerencias de su proveedor o al estudio de su poblacin. Se citan los siguientes valores como referencia en la metodologa descrita : Suero : 6.0 8.0 g/dl

84

6.9.12 Valores de Alerta/Crticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.9.13 Interpretacin de Laboratorio Disminucin de protenas : Se observa en el caso de desnutricin, prdidas renales, infecciones crnicas, enfermedad heptica. Elevacin de protenas : Hemoconcentraciones (ej. deshidratacin), mieloma mltiple, infecciones .

6.9.14 Especificaciones de desempeo 6.9.14.1 Linealidad : Hasta 12 g/dl 6.9.14.2 Lmite de deteccin : Segn la bibliografa consultada existen detecciones de 0.02 g/dl. 6.9.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, esta metodologa arroja coeficientes de variacin entre 0.39 % y 0.56 %. 6.9.14.4 Repetitibilidad : No se hallan datos bibliogrficos.

6.9.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad El hidrxido de sodio es custico. Tener cuidado especial en su preparacin por la energa que libera la reaccin con agua. Evitar contacto con piel y mucosas. 6.9.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.9.16.1 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.9.16.2 Mantener la temperatura controlada. 6.9.16.3 Considerar variaciones en los tenores de protenas de acuerdo a los estados de hidratacin del individuo. 6.9.16.4 El efecto postural permite una variacin de casi el 20 % entre la posicin erecta a la acostada, siendo mayor para la primera. 6.9.16.5 En relacin a edad, el neonato mantiene cifras algo superiores que el infante y ste a su vez tasas menores frente al adulto en 1-1.5 g/dl.

85

6.10 ALBUMINA : COLORIMETRIA CON VERDE DE BROMOCRESOL

6.10.1 Presentacin La albmina constituye la protena ms abundante en el plasma, aproximadamente 60 % de las protenas totales. Mantiene como funcin principal el mantener la presin onctica del plasma, evitando la salida del componente lquido por fuera del mismo (caudante de edemas). Adems es protena transportadora y fuente de aminocidos no provenientes de la dieta. Su alteracin, bsicamente en forma de descenso tiene significado clnico en numerosas patologas. 6.10.2 Principio del Procedimiento La albmina se une cuantitativamente con el verde de bromocresol en medio cido, resultando en la formacin de un color verde el cual puede ser medido a 630 nm o en filtro rojo. 6.10.3 Descripcin del Mtodo Las tcnicas para la determinacin de albmina por conjugacin con colorantes aprovechan el llamado error de protena de los indicadores. La adicin de protenas a una solucin de ciertos colorantes da lugar a la formacin de un complejo coloranteprotena, que muestra propiedades pticas distintas de las que posee el colorante libre. Al diluir el suero con verde de bromocresol, se lee la disminucin de la absorbancia con respecto a la concentracin de albmina, no siendo interferida bajo el filtro de lectura por la hemoglobina, bilirrubina ni lipemia.

6.10.4 Tipo de Muestra Primaria Se utiliza suero. 6.10.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recoleccin 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mnimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recoleccin al vaco(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la seccin de Toma de Muestras para las generalidades de la venopuncin. 6.10.4.2 Separacin de la Muestra y Preservacin Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero del paquete de glbulos rojos. La muestra puede conservarse hasta 3 das en refrigeracin de 2-8C o en congelador a 20 C por una semana.

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6.10.5 Equipos y Materiales 6.10.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura entre 630 +/- 20 nm. En el caso de espectrofotmetros se aconsejan lecturas a 630 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.10.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material. 6.10.5.3 Otros implementos a)Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero . Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b)Matraces, vasos de reaccin, en el caso de preparacin de reactivos. c)Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. d) Reloj o timer. 6.10.6 Reactivos 6.10.6.1Reactivo Comercial Resulta una prctica muy generalizada la utilizacin de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribucin en el mercado. La nica indicacin sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relacin al uso y preservacin de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. 6.10.6.2 Reactivos provistos en kit comercial a) Reactivo de verde de bromocresol en tampn citrato, detergente. b) Standard o patrn de albmina.La concentracin viene etiquetada en el frasco. c) La conservacin del reactivo es a 15-30C y del standard a 2-8C hasta la fecha de vencimiento. 6.10.7 Procedimientos En 3 tubos de ensayo colocar : Blanco Standard Muestra

Standard Suero Reactivo

--1 ml

0.015 ml -1 ml

-0.015 ml 1 ml 87

Mezclar y dejar 1 minuto a temperatura ambiente. Leer a 630 nm o en filtro rojo 630 +/20 nm, blanqueando a cero con el blanco de reactivo.

6.10.8 Clculo de resultados

Calcular la concentracin de albmina en suero de la siguiente manera :

Concentracin = Absorbancia de Muestra x Concent. Standard Absorbancia de Standard

6.10.9 Procedimientos de Control de Calidad. Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.10.10 Interferencias Interfieren : triglicridos ( > 1250 mg/dl), hemoglobina (> 0.125 g/dl). La bilirrubina no interfiere. 6.10.11 Intervalos de Referencia Biolgica Cada laboratorio establecer sus rangos referenciales de acuerdo a las sugerencias de su proveedor o al estudio de su poblacin. Se citan los siguientes valores como referencia en la metodologa descrita : Suero : 3.5 5.0 g/dl (Adultos) 3.8-5.4 g/dl (Nios)

6.10.12 Valores de Alerta/Crticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

88

6.10.13 Interpretacin de Laboratorio Disminucin de albmina : Se observa en el caso de desnutricin, prdidas renales, enfermedad heptica, malabsorcin, catabolismo aumentado por inflamacin o dao tisular, inflamaciones del tuvo digestivo(coitis ulcerativa), quemaduras extensas, analbuminemia congnita. Elevacin de albmina : Hemoconcentraciones (ej. deshidratacin). No existen casos clnicamente traducibles de hiperalbuminemia. Ante la eventualidad de resultados elevados, descartar la primera posibilidad y error tcnico.

6.10.14 Especificaciones de desempeo 6.10.14.1 Linealidad : Hasta 7 g/dl 6.9.104.2 Lmite de deteccin : detecciones de 0.02 g/dl. 6.10.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, esta metodologa arroja coeficientes de variacin entre 0.9 % y 1.7 %. 6.10.14.4 Repetitibilidad : Coeficientes de variacin entre 0.8 a 1.0%.

6.10.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad

6.10.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.10.16.1 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.10.16.2 Mantener la temperatura controlada. 6.10.16.3 Considerar variaciones en los tenores de protenas de acuerdo a los estados de hidratacin del individuo. 6.10.16.4 La reaccin de la albmina con el verde de bromocresol es inmediata. No demore las lecturas; otras protenas podran reacionar lentamente.

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6.11

BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA: COLORIMETRIA CON REACTIVO SULFANILICO-DIAZOADO.

6.11.1 Presentacin La bilirrubina es formada a partir del fragmento hem de la hemoglobina, liberada por el recambio natural de eritrocitos o por la destruccin de los mismos. El hgado, el bazo y la mdula sea son sitios donde se forma la bilirrubina. La s formadas en los dos ltimos deben ser transportadas al hgado para su ulterior conjugacin. La enfermedad heptica afecta este sistema y permite la acumulacin de la bilirrubina en sangre. Los fenmenos obstructivos a nivel de toda la va biliar intra y extraheptica tambin son causantes de elevacin de niveles de este componente. 6.11.2 Principio del Procedimiento Se basa en la diazorreacin de Ehrlich, que consiste en la copulacin , en medio cido, de la bilirrubina con el cido sulfanlico diazotado ( mezcla de de acido sulfanlico y nitrito de sodio). La bilirrubina directa (una aproximacin a la bilirrubina conjugada, no exactamente igual) reacciona precisamente en forma directa con el diazorreactivo; la bilirrubina no conjugada requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite de manera indirecta su reaccin. De esta manera, se comprende que para que podamos medir la bilirrubina total (la suma de ambas), debe agregarse a la reaccin el benzoato de cafena que, en esta metodologa, acta como el desarrollador acuoso. 6.11.3 Descripcin del mtodo La reaccin de los componentes de la biirrubina en la llamada diazorreaccin se explica de la siguiente manera : Reactivo diazo (Acido Sulfanlico + Nitrito de Sodio)

Reaccin directa con el suero

Se aade Benzoato de cafena

Medicin de Bilirrubina Directa

Se solubiliza la bilirrubina Indirecta.

Medicin de Bilirrubina Indirecta + Bilirrubina Directa BILIRRUBINA TOTAL

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6.11.4 Tipo de Muestra Primaria Se utiliza suero o plasma. 6.11.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recoleccin 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mnimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recoleccin al vaco(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la seccin de Toma de Muestras para las generalidades de la venopuncin. 6.11.4.2 Obteniendo plasma Se prefiere el uso de heparina como anticoagulante. En el comercio se obtiene tubos preparados para fines de recoleccin; adicionalmente, estos elementos permiten una adecuada proporcin entre muestra y anticoagulante. 6.11.4.3 Separacin de la Muestra y Preservacin Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero del paquete de glbulos rojos. La muestra puede conservarse hasta 48 horas en refrigeracin de 2-8C pero es ideal trabajarla lo ms pronto posible. La luz directa puede destruir en una hora hasta el 50 % del tenor de bilirrubina en la muestra; prevenga esta accin protegiendo con papel negro el tubo. 6.11.5 Equipos y Materiales 6.11.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura entre 520-550 nm. En el caso de espectrofotmetros se aconsejan lecturas a 530 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.11.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros y plasma y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material. 6.11.5.3 Otros implementos a)Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero . Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b)Matraces, vasos de reaccin, en el caso de preparacin de reactivos. c)Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. d)Reloj o timer.

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6.11.6 Reactivos

6.11.6.1 Reactivo Comercial Resulta una prctica muy generalizada la utilizacin de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribucin en el mercado. La nica indicacin sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relacin al uso y preservacin de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el caso especfico de la determinacin de biirrubina, resulta prctico el uso comercial para evitar la manipulacin de cido clorhdrico, producto controlado en nuestro medio y necesario como componente del reactivo sulfanlico. 6.11.6.2 Reactivos provistos en kit comercial a) b) c) d) e) Reactivo desarrollador : Solucin acuosa de benzoato de cafena tamponada. Standard de bilirrubina. Verificar la concentracin en la etiqueta. Nitrito de sodio en solucin. Reactivo sulfanlico: Solucin de cido sulfanlico y cido clorhdrico. Preparacin del Diazorreactivo : Mezclar 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanlico. f) Los reactivos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de caducidad. El Diazorreactivo es estable por 3 meses en frasco color caramelo y a refrigeracin de 2-8C.

6.11.7 Procedimientos

En 3 tubos de ensayo colocar :

Blanco

Directa

Total

Muestra Agua destil.

0.2 ml 2.5 ml

0.2 ml 2.5 ml --0.2 ml

0.2 ml -2.5 ml -0.2 ml

Desarrollador -React. Sulfan. 0.2 ml Diazorreact. --

Utilizar el standard como muestra para hallar luego el factor. Mezclar y dejar 5 minutos a temperatura ambiente. Leer a 530 nm o en filtro verde de 520-550 nm, blanqueando a cero con agua destilada. La lectura de la bilirrubina directa debe realizarse a los 5 minutos exactos. La correspondiente a la total puede realizarse entre 4 y 15 minutos de iniciada la reaccin. En caso de ictericia moderada se puede usar un volumen menor de muestra como 0.05

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ml y luego multiplicar el resultado por 3.79. Para el caso de ictericias severas puede utilizarse 0.02 ml, multiplicando el resultado por 9.38.

6.11.8 Clculo de resultados

Calcular la concentracin de bilirrubinas de la siguiente manera :

Factor = Concentracin del Standard Absorbancia Standard Bilirrubina total =( Absorbancia total Absorbancia blanco ) x Factor Bilirrubina directa = (Absorbancia directa Absorbancia blanco) x Factor

6.11.9 Procedimientos de Control de Calidad. Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.11.10 Interferencias Interfieren : La hemlisis moderada o intensa interfiere inhibiendo la reaccin directa y dando valores de bilirrubina total falsamente aumentados. 6.11.11 Intervalos de Referencia Biolgica Cada laboratorio establecer sus rangos referenciales de acuerdo a las sugerencias de su proveedor o al estudio de su poblacin. Se citan los siguientes valores como referencia en la metodologa descrita : Adultos : Bilirrubina total : Hasta 1.0 mg/dl Bilirrubina directa: Hasta 0.2 mg/dl Neonatos a trmino : 2.5 12.0 mg/dl

6.11.12 Valores de Alerta/Crticos Neonatos: Biulirrubina indirecta mayor a 15 mg/dl.

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6.11.13 Interpretacin de Laboratorio 6.111.13.1 Hiperbilirrubinemia indirecta : Ictericia fisiolgica, hemlisis por anemia hemoltica ohematoma extenso, eritropoyesis defectuosa, sndrome de Gilbert, sndrome de Crigler-Najjar. 6.11.13.2 Hiperbilirrubinemia directa : Hepatitis, cirrosis, colestasis extraheptica e intraheptica.

6.11.14 Especificaciones de desempeo 6.11.14.1 Linealidad : Hasta 15 mg/dl 6.11.14.2 Lmite de deteccin : detecciones de 0.03 mg/dl de bilirrubina total. 6.11.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, esta metodologa arroja coeficientes de variacin entre 1.1 % y 4.7 % para bilirrubina total. 6.11.14.4 Repetitibilidad : Coeficientes de variacin entre 1.0 y 3.0 % para bilirrubina total.

6.11.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad Prestar especial cuidado al cido sulfanlico, evitando contacto con ojos, piel y mucosas. 6.11.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.11.16.1 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.11.16.2 La lectura de las reacciones en el caso de bilirrubina directa es de capital importancia. Lecturas antes de los 5 minutos dan valores por debajo de lo esperado, ocurriendo lo contrario con tiempos de lectura posteriores. 6.11.16.3 Se reitera la importancia de la proteccin de las muestras de la luz, sea artificial o natural.Utilizar papel negro para proteger las muestras que no seran analizadas de inmediato. La prolongacin del anlisis en una hora, puede permitir la prdida de hasta el 50 % de la concentracin de la muestra. 6.11.16.4 Los niveles de bilirrubina en los neonatos a trmino alcanzan las cifras de adulto hacia el primer mes de vida. Considerar que en el caso de pretrminos se retarda esta nivelacin, debido a una inmadurez heptica.

94

6.12

TRANSAMINASAS : METODO CINTICO UV OPTIMIZADO (IFCC)

6.12.1 Presentacin Bioqumicamente, las aminotransferasas catalizan la formacin de cido glutmico a partir de 2-oxoglutarato mediante la transferencia de grupos amino. Para ello, la Alanin amino transferasa (ALT) Transaminasa Glutmico Pirvica (TGP) parte de un sustrato con alanina, mientras que la Aspartato amino transferasa (AST) Transaminasa Glutmico Oxalactica lo hace con aspartato. Su importancia clnica radica en que cambios en la permeabilidad de las porciones donde se localizan, provocan aumentos de su concentracin en sangre. As, la AST/TGO se encuentra en citoplasma y mitocondrias, mientras que la ALT/TGP es citoplasmtica. La concentracin de cada una de ellas en las diversas patologas asociadas, implicar la profundidad de las lesiones a nivel celular. 6.12.2 Principio del Procedimiento Existen diversas metodologas para la deteminacin de transaminasas, sin embargo, la laboriosidad de algunas, unida a su poca precisin, lograron trabajos para la estandarizacin metodolgica. En este manual se describir el mtodo optimizado adoptado por la Federacin Internacional de Qumica Clnica (IFCC), la cual propone la utilizacin de la banda ultravioleta para captar la actividad de la enzima va la extincin de NADH(icotin-adenina dinucletido reducido) y su transformacin en NAD. 6.12.3 Descripcin del mtodo Para ambos casos de transaminasas, se mide va un acoplamiento, la velocidad de desaparicin de NADH, medido a 340 nm. 6.12.3.1 Reaccin de determinacin de actividad de ALT/TGP :

ALT/TGP ALANINA + 2-OXOGLUTARATO PIRUVATO + GLUTAMATO

SE ACOPLA AL PIRUVATO : Desshidrogenasa Lctica PIRUVATO + NADH + H+ LACTATO + NAD+

Se mide a 340 nm su desaparicin

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6.12.3.2 Reaccin de determinacin de actividad AST/TGO:

AST/TGO

ASPARTATO + 2- OXOGLUTARATO SE ACOPLA AL OXALACETATO:

Malato Deshidrogenasa

Oxalacetato + Glutamato

OXALACETATO + NADH + H+

MALATO + NAD+

Se mide a 340 nm su desaparicin

6.12.4 Tipo de Muestra Primaria

6.12.4.1 Puede usarse suero y plasma . Para el uso de plasma, obtenerla a partir de heparina como anticoagulante. Ceirse a otras instrucciones impartidas en la seccin de venopuncin en Recoleccin de muestras. 6.12.4.2 Las transaminasas son estables en suero por 3 das a 2-8C. No congelar. 6.12.5 Equipos y Materiales 6.12.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura en rango no visible o ultravioleta (340 nm). Los equipos automatizados suelen poseer estos filtros, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.12.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material. 6.7.6.2 Otros implementos 96

a) Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Bao Mara : Para la respectiva incubacin durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reaccin, en el caso de preparacin de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. e) Reloj o timer.

6.12.6 Reactivos 6.12.6.1 Reactivo Comercial Resulta una prctica muy generalizada la utilizacin de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribucin en el mercado. La nica indicacin sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relacin al uso y preservacin de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acpite, se describir el procedimiento estndar utilizado por la mayora de proveedores. 6.12.6.2 Reactivos Provistos en Kits Comerciales a) Buffer : Solucin de TRIS conteniendo l-alanina (para ALT/TGP) l-aspartato (para AST/TGO). b) Sustrato : viales conteniendo : Para ALT/TGP : 2-oxoglutarato, NADH, LDH. Para AST/TGO : 2-oxoglutarato, NADH, MDH y LDH. d) Preparar el sustrato reconstiruyendo con el buffer. Ceirse a las instrucciones del fabricante. e) Conservar a 2-8 C. El sustrato reconstituido dura 1 mes aproximadamente. f) Verificar indicios de deterioro mediante lecturas de absorbancia del sustrato reconstituido con el espectrofotmetro o fotmetro llevado a cero con agua destilada (a 340 nm). El fabricante dar las pautas de absorbancias que impliquen deterioro. 6.12.7 Procedimientos

a) Colocar en una cubeta o tubo mantenido a 37C las siguientes cantidades: (Vlido para ambas transaminasas)

Sustrato reconstituido.......... 2ml Muestra .......................... 0.2 ml

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b) Mezclar de inmediato y disparar en simultneo el reloj timer. Luego de 1 minuto, registrar la absorbancia inicial. Posteriormente, registrar la absorbancia a los 1, 2, 3 minutos de la primera lectura. c) Determinar la diferencia promedio, restando cada lectura de la anterior y luego promediando dichas diferencias ( A/min).

6.12.8 Clculo de resultados 6.12.8.1Clculo para ALT/TGP : ALT/TGP = A/min x factor

El factor es provisto por el fabricante y calculado de acuerdo a la temperatura de trabajo. Para el procedimiento descrito, dicho factor = 1740 (deber colocarse un signo negativo en los fotmetros automatizados, debido a que es una reaccin por extincin de NADH). 6.12.8.2Clculo para AST/TGO : AST/TGO = A/min x Factor.

El factor es provisto por el fabricante y calculado de acuerdo a la temperatura de trabajo. Para el procedimiento descrito, dicho factor = 1740 (deber colocarse un signo negativo en los fotmetros automatizados, debido a que es una reaccin por extincin de NADH). 6.12.9 Procedimientos de Control de Calidad. Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.12.10 Interferencias Interfieren : Muestras con cetocidos, bilirrubina (>6.0 mg/dl), triglicridos (>550 mg/dl), hemoglobina (> 0.14 g/dl) dan valores falsamente aumentados. Deficiencias de vitaminas, piridoxal fosfato y hemodializados dan valores falsamente bajos.

6.12.11 Intervalos de Referencia Biolgica Cada laboratorio deber establecer sus propios rangos referenciales, en razn a recomendaciones del proveedor o bajo estudio de poblacin. Como cifras de orientacin, se dan las siguentes :

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ALT/TGP: Hombres ( hasta 41 U/l) Mujeres ( hasta 31 U/l) AST/TGO: Hombres (hasta 38 U/l) Mujeres ( hasta 32 U/l)

6.12.12 Valores de Alerta/Crticos No se reporta en la literatura valores de alerta. 6.12.13Interpretacin de Laboratorio 6.12.13.1 Elevacin de ALT/TGP : Hepatitis de diversa ndole, otras alteraciones hepticas-biliares. 6.12.13.2 Elevacin de AST/TGO: Alteraciones hepatobiliares (hepatitis, hepatitis con necrosis), infarto de miocardio, alteraciones musculares.

6.12.14 Especificaciones de desempeo 6.12.14.1 Linealidad : Para el mtodo descrito hasta 500 U/l. 6.12.14.2 Lmite de deteccin : Aproximadamente 1.6 U/l de actividad. 6.12.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, estas metodologas arrojan coeficientes de variacin entre 2.7 a 5.9 %. 6.12.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variacin se sitan entre 1.4 y 2.8 %.

6.12.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad 6.12.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.12.16.1 Controlar la temperatura exacta del bao mara. La variacin no puede ser mayor a +/- 0.1C. 6.12.16.2 Observar que el nivel de agua del bao cubra el nivel superior de los tubos en incubacin. 6.12.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.12.16.4Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes. 6.12.16.5Controlar exactamente los tiempos de lectura de absorbancias para el clculo de A/min.

99

6.13

FOSFATASA ALCALINA : CINTICA OPTIMIZADADIETANOLAMINA

6.13.1 Presentacin La fosfatasa alcalina cataliza bioqumicamentela hidrlisis de monosteres de fosfato orgnicos en medio alcalino. Se encuentra distribuida en hgado, hueso, placenta, intestino, rin. Su importancia diagnstica est dirigida al rea hepato-biliar y sea, por tener mayor concentracin en dichos tejidos. 6.13.2 Principio del Procedimiento Tan igual como en otras determinaciones enzimticas, existen diversos procedimientos para la determinacin de su actividad. Sin embargo, optamos por el mtodo cintico optimizado a 405 nm, utilizado un tampn de dietanolamina. 6.13.3 Descripcin del mtodo La fosfatasa alcalina cataliza en medio alcalino la transferencia del grupo fosfato del 4nitrofenilfosfato a la dietanolamina, liberando 4-nitofenol. A partir de la velocidad de formacin del 4-nitrofenol se relaciona la actividad de la enzima.

4-Nitrofenil fosfato + Dietanolamina 6.13.4 Tipo de Muestra Primaria

Dietanolamina-fosfato + 4-Nitrofenol

6.13.4.1 Puede usarse suero y plasma . Para el uso de plasma, obtenerla a partir de heparina como anticoagulante. Ceirse a otras instrucciones impartidas en la seccin de venopuncin en Recoleccin de muestras. 6.13.4.2 La fosfatasa alcalina es estable en suero por 7 das a 2-8C. 6.13.5 Equipos y Materiales 6.13.5.1 Equipo de Medicin Se requiere un fotmetro o espectrofotmetro con capacidad de lectura a 405 nm. Los equipos automatizados suelen poseer estos filtros, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informndose por el catlogo del mismo. 6.13.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relacin al uso de este material.

100

6.13.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recoleccin de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recoleccin del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Bao Mara : Para la respectiva incubacin durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reaccin, en el caso de preparacin de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotmetro o espectrofotmetro. e) Reloj o timer.

6.13.6 Reactivos 6.13.6.1 Reactivo Comercial Resulta una prctica muy generalizada la utilizacin de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribucin en el mercado. La nica indicacin sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relacin al uso y preservacin de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acpite, se describir el procedimiento estndar utilizado por la mayora de proveedores. 6.13.6.2 Reactivos Provistos en Kits Comerciales a) Buffer : Dietanolamina, cloruro de magnesio. b) Sustrato : 4- nitrofenilfosfato. d) Preparar el sustrato reconstituyendo con el buffer. Ceirse a las instrucciones del fabricante. e) Conservar a 2-8 C. El sustrato reconstituido vara en su vigencia. f) Verificar indicios de deterioro mediante lecturas de absorbancia del sustrato reconstituido con el espectrofotmetro o fotmetro llevado a cero con agua destilada (a 405 nm). El fabricante dar las pautas de absorbancias que impliquen deterioro. 6.13.7 Procedimientos

a) Colocar en una cubeta o tubo mantenido a 37C las siguientes cantidades:

Sustrato reconstituido.......... 1 ml Muestra .......................... 0.02 ml Estas cantidades son a modo de ejemplo. Varan segn el kit comercial.

101

b) Mezclar de inmediato y disparar en simultneo el reloj timer. Luego de 1 minuto, registrar la absorbancia inicial. Posteriormente, registrar la absorbancia a los 1, 2, 3 minutos de la primera lectura. c) Determinar la diferencia promedio, restando cada lectura de la anterior y luego promediando dichas diferencias ( A/min). 6.13.8 Clculo de resultados

Fosfatasa alcalina (actividad) =

A/min x Factor.

El factor es provisto por el fabricante y calculado de acuerdo a la temperatura de trabajo.

6.13.9 Procedimientos de Control de Calidad. Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena prctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el nmero de ellas) , la participacin de al menos un suero control. Depender de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.13.10 Interferencias Interfieren : bilirrubina (>20 mg/dl), triglicridos (>1000 mg/dl), hemoglobina (> 0.5 g/dl) dan valores falsamente aumentados.

6.13.11 Intervalos de Referencia Biolgica Cada laboratorio deber establecer sus propios rangos referenciales, en razn a recomendaciones del proveedor o bajo estudio de poblacin.

6.13.12 Valores de Alerta/Crticos No se reporta en la literatura valores de alerta. 6.13.13 Interpretacin de Laboratorio Se encuentran elevaciones en colestasis biliar, hepatopatas(hepatitis, hepatotoxicidad por medicamentos), carcinoma primario o metastsico seo y heptico, fenmenos osteoblsticos, osteomalacia por deficiencia de vitamina D, enfermedad de Paget, hiperparatiroidismo. Fisiolgicamente durante el desarrollo seo de la niez y en el embarazo.

102

6.13.14 Especificaciones de desempeo 6.13.14.1 Linealidad : Para el mtodo descrito hasta 690 U/l. 6.13.14.2 Lmite de deteccin : Aproximadamente 1.6 U/l de actividad. 6.13.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios das, estas metodologas arrojan coeficientes de variacin entre 2.2 a 4.5 %. 6.13.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variacin se sitan entre 0.7 y 1.1 %.

6.13.15Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la seccin de Bioseguridad 6.13.16Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.13.16.1 Controlar la temperatura exacta del bao mara. La variacin no puede ser mayor a +/- 0.1C. 6.13.16.2 Observar que el nivel de agua del bao cubra el nivel superior de los tubos en incubacin. 6.13.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.13.16.4Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes. 6.13.16.5Controlar exactamente los tiempos de lectura de absorbancias para el clculo de A/min.

103

6.14

HEMOGLOBINA GLICOSILADA: CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO IONICO

6.14.1 Presentacin La hemoglobina en el interior de cada glbulo rojo es capaz de reaccionar qumicamente con la glucosa, proceso no enzimtico que forma una base de Schiff, la cual se transforma posteriormente en una ketoamina irreversible o producto de Amadori. Gracias a esta reaccin existen diversas hemoglobinas glicosiladas, las cuales han sido reunidas en un global llamado Hb A1 . De este colectivo, la de mayor concentracin es la Hb A1 c . La concentracin de Hemoglobina A 1 c es directamente proporcional a la concentracin media de glucosa en sangre durante un periodo de 6-8 semanas. La determinacin de la glicohemoglobina es el mejor indicador disponible actualmente para el control del paciente diabtico. 6.14.2 Principio del procedimiento Est prueba muestra variabilidad entre las diversas metodologas e incluso entre fabricantes . Para garantizar que la informacin obtenida es confiable, resulta indispensable que los laboratorios utilicen mtodos cromatogrficos certificados por el National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP). En la actualidad es recomendable en laboratorios de referencia, la utilizacin de cromatografa de intercambio inico a baja presin. 6.14.3 Descripcin del Mtodo Los sistemas que disponen de cromatografa de intercambio inico a baja presin, utilizan en conjuncin gradientes de elucin para separar subtipos y variantes de la hemoglobina rescatada de sangre hemolizada. Las distintas fracciones de hemoglobina son separadas y monitorizadas por un promedio de valores de absorcin a 415 nm.Se obtiene un cromatograma, el cual es grabado y almacenado por una computadora, la cual realizar la evaluacin y reporte impreso. 6.14.4 Tipo de Muestra Primaria Se recolecta sangre total en tubos con anticoagulante EDTA. Utilize de preferencia el sistema al vaco. Las muestras de sangre completa son estables por siete das a 2-8C. Procure homogenizar adecuadamente mediante inversin de la muestra o en un agitador mecnico. 6.14.5 Equipos y Materiales 6.14.5.1 Equipo de Medicin La metodologa propuesta requiere el uso de analizadores especficos para la determinacin de este componente, los cuales incluyen un software adecuado. Existen

104

en el mercado alternativas de acuerdo al volumen de pruebas de los distintos laboratorios. Se entiende que este es un procedimiento que debera centralizarse en Laboratorios de referencia, dado el costo y complejidad de su performance. 6.14.5.2 Material requerido Dispositivos para pruebas Reactivos diversos para la preparacin del hemolizado. Software Dispensadores, viales muestra. Pipetas para volmenes de muestra y reactivo segn los protocolos de cada fabricante. Impresora y papel de impresin. 6.14.6 Reactivos Los fabricantes proveen reactivos con buffer y reactivos de hemlisis, especfico para cada marca. Adems, debe obtenerse controles. 6.14.7 Procedimientos Los procedimientos varan segn el proveedor, pero existen pasos generales en todos ellos : 6.14.7.1 Iniciar la corrida con un control de Calidad. Utilizar los niveles exigidos. 6.14.7.2 Calibracin : Este paso no suele ser necesario, gracias al apoyo de un software que guarda la informacin de curvas de calibracin leyendolas de cada lote de reactivos. 6.14.7.3 Preparacin de los hemolizados a partir de las muestras de pacientes. 6.14.7.4 Inicio de corrida. 6.14.7.5 Aspiracin de muestra y anlisis. 6.14.7.6 Reporte e impresin de resultados. 6.14.8 Clculo de Resultados 6.14.8.1 Los porcentajes de Hemoglobina glicosilada son calculados por el sistema. 6.14.8.2 Se puede hacer un estimado de Glucosa media basal(MBG) a partir de la cifra de concentracin de HbA1c . MBG= 33.3( % HbA1c) 6 6.14.9 Procedimientos de conrol de calidad. Utilizar en cada corrida los controles internos necesarios para asegurar una ptima performance. Existen programas de Control de Calidad Externo para este anlisis. 6.14.10 Interferencias No se han observado interferencias con triglicridos. La bilirrubina interfiere a partir de valores superiores a 20 mg/dl, dando elevaciones falsas. Otras causas de falsas elevaciones : presencia de bases de Schiff, hemoglobina F, hemoglobina C. 6.14.11 Intervalos de Referencia Biolgica Se precisan niveles no diabticos entre 4.0- 6.3 % 105

6.14.12Valores de Alerta/Crticos No se reportan. 6.14.13Interpretacin de Laboratorio HbA1c Control de Glucosa

> 8% 7-8 % <7% 6-7 % < 6%

Tomar acciones Control bueno Objetivo Cerca de glicemia normal NO diabtico

6.14.14Especificaciones de desempeo 6.14.14.1 Linealidad : Lineal hasta 17 % . 6.14.14.2 Lmite de deteccin : No se obtienen datos. 6.14.14.3 Reproducibilidad: Para la informacin obtenida: Coeficientes de variacin de 1.51 % (interserie). 6.14.14.4 Repetitibilidad: Para la informacin revisada: C.V 3.63% (intraserie). 6.14.15 Precauciones de Seguridad 6.14.15.1 No combinar lotes de ningn reactivo. 6.14.15.2 Las soluciones reactivas contienen azida sdica. No exponer a ojos, piel ni mucosas. 6.14.15.3 Disponer los lquidos de desecho de acuerdo a los procedimientos estndares de seguridad. 6.14.15.4 No permitir que los reactivos con azida sdica entren en contacto con metales pesados o cidos, pues se pueden formar compuestos explosivos o liberarse gases txicos. 6.14.16 Potenciales fuentes de Variabilidad 6.14.16.1 No utilizar anticoagulantes distintos a EDTA en la recoleccin de muestras. 6.14.16.2 Asegurar la incubacin oportuna de las muestras antes del ensayo. 6.14.16.3 Asegurar que todos los reactivos pertenezcan a mismo lote. 6.14.16.4 La posibilidad de diabetes subclnica y/o intolerancia a la glucosa no puede ser eliminada dentro de muestras no diabticas. Analizar con cuidado la informacin.

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SECCION 7 : BIBLIOGRAFIA

7.1 American Diabetes Association : Standards of Medical Care for Patients with Diabetes Mellitus. Diabetes Care, 1996: S8-S9. 7.2 BIO RAD. Programa DiaSTAT. Hemoglobina A1c . 1998. 7.3 Bernabei D. Seguridad. Manual para el Laboratorio. Merck, 1994 ; p. 11-12. 7.4 Castaeda M, Len M, Zambrano F. Manual de Programa de Garanta de Calidad en Qumica Clnica.Red de Laboratorios /Garanta de Calidad. Bogot, 1998. 7.5 College of American Pathologists. Clinical Laboratory Improvement Manual . Surveys Program. 2002. 7.6 College of American Pathologists.So Youre Going to Collect a Blood Specimen: An Introduction to Phlebotomy. 9ed, 2002. 7.7 Gonzlez de Buitrago J. Tecnologa y Mtodos del Laboratorio Clnico, Salvat, Mxico, 1992. 7.8 Henry Bernard. Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio. 9 ed. , Salvat, Barcelona, 1993. 7.9 Henry R.J., Cannon Dc, Winkelman JW. Qumica Clnica. Bases y Tcnicas, 2 ed., Editorial Jims, Barcelona , 1980. 7.10 Instituto de Salud Pblica de Chile. Manual de Control de Calidad en el Laboratorio Clnico. 1998. 7.11 Instituto Nacional de Salud. Manual de Bioseguridad para los Laboratorios. Serie de Normas Tcnicas N0. 18.Lima, 2002. 7.12 Ivine, Selva. El Laboraorio en la Clnica. Metodologa analtica, Fisiologa e Interpretacin, 3 ed., Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, 1985. 7.13 Ministerio de Salud. Manual de Procedimientos de Laboratorio para la obtencin y envo de Muestras (I). Serie de Normas Tcnicas No. 15, Lima, 1995. 7.14 NCCLS. Clinical Laboratory Safety. Approved Guideline. Document GP 17-A. 1996. 7.15 Nio H, Barrera L. Garanta de Calidad en el Laboratorio Clnico, Ed. Panamericana, Bogot, 1993. 7.16 Organizacin Mundial de la Salud. Serie de Informes Tcnicos. Prevencin de la Diabetes Mellitus. 1994.

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7.17 Terrs-Speziale. Confiabilidad y Aplicabilidad de los Nuevos Criterios internacionales para el diagnstico de Diabetes Mellitus. Revista Mexicana de Patologa Clnica, Vol. 49, N0. 4, Octubre-Diciembre 2002. 7.18 University of Michigan Hospitals. Laboratory Critical Values.2001. 7.19 World Health Organization. Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications. Report of a WHO Consultation. Geneva, 1999. 7.20 World Health Organization. Regional Office for South East Asia. Guidelines on Standard Operating Procedures for Clinical Chemistry. 2001.

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ANEXO A

MODELO DE HOJA DE PROCEDIMIENTOS

LABORATORIO CLINICO

HOJA DE PROCEDIMIENTOS

1.NOMBRE DE LA PRUEBA

2. METODOLOGIA

3. MARCA DEL FABRICANTE

4. INSTRUMENTO UTILIZADO LECTURA A : 5. PROCEDIMIENTO : a. Muestra: b. Preparacin de Reactivos: nm

c. Procedimiento tcnico:

6. CALCULO DE RESULTADOS

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7. RANGO DE REFERENCIA

8. PERFORMANCE

Linealidad : Lmite de deteccin; Reproducibilidad : Repetitibilidad: Otros :

9. SUSTANCIAS INTERFERENTES

10. CONTROL DE CALIDAD

Suero Control Utilizado: Nivel 1 Nivel 2 Frecuencia de uso :

Control de Calidad Externo Si

No

NOMBRE Elaborado Revisado Aprobado

CARGO

FIRMA

FECHA

110

ANEXO B

TABLA DE CONVERSION DE UNIDADES TRADICIONALES A UNIDADES SI

Unidad Convencional

Unidad SI

Factor Conversin

ALBUMINA

g/dl

g/L

10

ALT/TGP AST/TGO BILIRRUBINA COLESTEROL CREATININA GLUCOSA PROTEINAS TOTALES TRIGLICERIDOS UREA

U/L U/L mg/dl mg/dl mg/dl mg/dl g/dl mg/dl mg/dl

ukat/L ukat/L umol/L mmol/L umol/L mmol/L g/L mmol/L mmol/L

0.017 0.0167 17.1 0.026 88.4 0.0555 10 0.0113 0.763

111