Grado en Qumica

2 Curso



QUIMICA ANALITICA II


Guiones de Prcticas






2


QUIMICA ANALTICA II
Grado en Qumica
2 Curso


UTILES A TRAER POR EL ALUMNO
Bata
Gafas de Seguridad
Cuaderno de Laboratorio
NORMAS DE TRABAJO
Antes de empezar
Antes de empezar cada prctica, el profesor comprobar que el alumno ha
ledo el guin correspondiente y contestado las preguntas previas.
Durante las sesiones
Cada alumno tendr asignada una mesa.
Trabajar siempre en la mesa, salvo que se necesite la campana de gases.
Mantener siempre limpia la mesa de trabajo.
Al acabar
Limpiar la mesa y el material utilizado.
Dejar el equipo individual en la mesa de trabajo.
Avisar al profesor antes de abandonar el laboratorio.


3


QUIMICA ANALTICA II
Grado en Qumica
2 Curso


INDICE
pgina

Prctica n 1.- Extraccin lquido-lquido: equilibrio de reparto. Extraccin
simple de I
2
en disolucin acuosa con CCl
4
. Extraccin mltiple............................. 4
Prctica n 2.- Separacin de Fe y Al en una muestra acuosa mediante extraccin
selectiva con oxina .................................................................................................... 11
Prctica n 3.- Identificacin y cuantificacin de vitaminas por Cromatografa
Lquida de Alta Resolucin (HPLC) ........................................................................... 18
Prctica n 4.- Determinacin de hidrocarburos en agua de mar mediante
cromatografa de gases ............................................................................................ 25
Prctica n 5.- Determinacin de cafena en diferentes muestras (caf, t y
bebidas de cola) mediante HPLC con deteccin UV............................................... 31

4


QUIMICA ANALTICA II
Grado en Qumica
2 Curso

Prctica n 1

EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO: EQUILIBRIO DE
REPARTO. EXTRACCIN SIMPLE DE I
2
EN DISOLUCIN
ACUOSA CON CCl
4
. EXTRACCIN MLTIPLE

OBJETIVOS

Los objetivos fundamentales de la prctica se centran en familiarizar al alumno
con:
1. El fundamento de la extraccin lquido-lquido
2. Las operaciones prcticas de extraccin: Extraccin simple y mltiple.
3. Los clculos relacionados con la eficacia de la extraccin
.

INTRODUCCIN

EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO: EQUILIBRIO DE REPARTO

La extraccin puede definirse como un proceso de separacin en el cual un soluto
se reparte o distribuye entre dos fases diferentes. Lo ms comn es realizar la
extraccin entre dos fases lquidas, aunque tambin pueden realizarse
extracciones slido-lquido.
La extraccin lquido-lquido se utiliza con frecuencia para separar especies
moleculares simples (I
2
, Br
2
, ...), compuestos de coordinacin y compuestos
orgnicos, de las disoluciones acuosas en las que se encuentran inicialmente. El
procedimiento consiste en agitar las disoluciones acuosas con un disolvente
orgnico inmiscible con el agua y dejar separar ambas fases. Se establece entonces
un equilibrio o reparto de los solutos entre las dos fases gobernado por la
solubilidad relativa de los solutos en las fases acuosa y orgnica.
Recuerda, pues, el fundamento de la extraccin: un equilibrio de solubilidad entre
dos fases inmiscibles.
5


Representacin Esquemtica de la Extraccin













Desde el punto de vista cuantitativo de la Termodinmica Qumica, el equilibrio de
reparto o extraccin es muy sencillo. Formalmente, es anlogo al caso del equilibrio
qumico. Supongamos un nico soluto S que establece un equilibrio de reparto
simple:
S (aq) S (org)

En el equilibrio, el potencial qumico del soluto es el mismo en ambas fases y la
relacin de actividades en cada fase nos da la constante de equilibrio de reparto,
ms conocida como el coeficiente de reparto K. En la prctica, se aproxima el
coeficiente de reparto por un cociente de concentraciones en vez de actividades.

( )
( )
| |
| |
aq
org
S aq
S org
T
S
S
a
a
K ~ =

Para un sistema dado (pareja de disolventes + soluto), el correspondiente
coeficiente de reparto K slo depende de la temperatura. Si el soluto no participa
en ningn otro equilibrio secundario (como un equilibrio cido-base en disolucin
acuosa), el rendimiento del proceso de extraccin puede obtenerse a partir de K.

Analiza el siguiente ejemplo:

El coeficiente de reparto del I
2
entre agua y disulfuro de carbono es
K= 410 a 25 C. Halla la fraccin de I
2
que permanece en disolucin acuosa
despus de que volmenes iguales de agua y CS
2
hayan alcanzado un equilibrio
de reparto.
I
2
(aq) I
2
(CS)
La fraccin de I
2
que permanece en disolucin acuosa puede escribirse como:



R-COOH, R-NH2
R-OH, R-COO-R', R-CHO
I
2
, hidrocarburos

Disolvente Orgnico
Disolucin Acuosa

Sales Inorgnicas


Disolvente Orgnico

(hexano,ter,CCl
4
)
Disolucin Acuosa
I
2
,hidrocarburos (trazas)

R-OH, R-COO-R', R-CHO
R-COOH, R-NH
2

Sales Inorgnicas


Equilibrio
de
Reparto
6

o
eq
aq
V
o
aq
V
eq
I
n
n
n
n
= =
/
/
2
o [1]

donde n son los moles totales de iodo inicialmente en disolucin acuosa y n
eq

son los moles de iodo que permanecen en la fase acuosa una vez alcanzado el
equilibrio de reparto.

Por otro lado, el coeficiente de reparto puede escribirse como:
| |
| |
( )
aq eq
CS
eq o
aq
CS
V n
V n n
I
I
K
/
/
2
2
2
2

= = [2]
Como Vaq=V
CS2
, podemos despejar neq en [2] y sustituir en [1]:

3
10 43 2
1
1
2 1

- =
+
=
+
= ,
K
I
K
o
n eq
n
o


En trminos de rendimiento, se extrajo un 1000.243=99.756 % del I
2
.


REACTIVOS Y MATERIAL

MATERIAL
1 Embudo de decantacin
3 vasos de precipitados de 100 mL
1probeta de 100 mL
1 probeta de 25 mL
Cuentagotas y varilla

REACTIVOS
Disolucin acuosa de iodo saturada
Disolvente CCl4
Indicador de almidn: disolucin acuosa de almidn + KI(s)


PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Parte 1.- EXTRACCIN SIMPLE DE I
2
EN DISOLUCIN ACUOSA
CON CCl
4


A continuacin, vas a realizar un experimento de extraccin simple de iodo
molecular en una disolucin acuosa saturada empleando como fase orgnica el
7
tetracloruro de carbono. Este sistema te permite apreciar visualmente cmo se
alcanza el equilibrio de distribucin. Debes realizar las siguientes operaciones:

1) Asegrate de que el embudo de decantacin est limpio y seco. Colcalo en el
soporte sujetndolo con el aro con nuez. Comprueba que la llave del embudo est
cerrada. Si es necesario, refuerza el tapn del embudo con cinta de tefln.

2) Con la probeta de 100 mL mide 50 mL de la disolucin saturada de iodo y
adelos al embudo.

3) Toma un volumen de CCl
4
de la botella hacia un vaso de precipitados (aprox. 20-
25 mL). Con la probeta de 25 mL, mide 15 mL del CCl
4
y adelos al embudo de
decantacin.

LOS VAPORES DE CCl
4
SON NOCIVOS
EVITA SU INHALACIN DIRECTA

4) Tapa entonces el embudo y tmalo con ambas manos. El embudo debe
manejarse con ambas manos: con una se sujeta el tapn y con la otra se manipula
la llave. Inclina el embudo con el tapn hacia arriba. Agita suavemente durante
unos segundos. Afloja el tapn para liberar el exceso de presin en el interior del
embudo. Vuelve a agitar y vuelve a abrir ligeramente el tapn. Por ltimo agita con
fuerza durante 20 segundos.

5) Repite la agitacin fuerte y deja entonces al embudo situado en el soporte y con
el tapn abierto. Espera hasta que las dos fases se distingan ntidamente.

6) Separa fsicamente ambas fases. Coloca un vaso de precipitados de 100 mL
debajo del embudo. Abre la llave y recoge lentamente la fase ms densa hasta
observar que la interfase se acerca a la llave. En un segundo vaso recoge una
pequea porcin de ambas fases. Recoge por ltimo la fase menos densa en un
tercer vaso de precipitados.

A juzgar por los cambios de color el rendimiento de la extraccin simple debe ser
alto. Sin embargo, puedes comprobar de un modo sencillo si el rendimiento es
realmente del 100 % sin ms que aadir un indicador visual de iodo, a saber, la
conocida disolucin de almidn que en presencia de I
2
molecular y anin I
-
(aq)
forma un complejo de color violeta intenso.

7) Toma un tubo de ensayo e introduce unos 2 mL de la disolucin acuosa y aade
10 gotas de la disolucin acuosa de almidn. Disuelve tambin un pequeo cristalito
de KI(s). Agita el contenido y comprueba entonces la coloracin de la disolucin
observndola contra un fondo blanco.



8
DEPOSITA LA FASE ORGNICA EN EL FRASCO DE RESIDUOS
NO LA TIRES POR EL DESAGE


Parte 2.- EXTRACCIN MLTIPLE


Si el valor del coeficiente de reparto K es elevado (> 100), con una sola extraccin
se puede pasar prcticamente todo el soluto a la fase orgnica. No es ste el caso
de la extraccin simple de iodo con CCl
4
que resulta ser incompleta, pues an queda
iodo en disolucin acuosa. No obstante, puede conseguirse una extraccin completa
de iodo con 15 mL de CCl
4
, pero en tres porciones, es decir, realizando varias
extracciones consecutivas (extraccin mltiple). Vas a comprobarlo
experimentalmente.

1) Repite los pasos del anterior procedimiento, pero aadiendo los 15 mL de CCl
4

en tres veces, es decir, haciendo tres extracciones con 5 mL de CCl
4
.

2) Ten en cuenta que cada vez que completes una extraccin, debes extraer slo la
fase orgnica del embudo de decantacin en un vaso de precipitados.

3) Realizada la ltima extraccin, repite la prueba del almidn en la disolucin
acuosa. Se detecta finalmente iodo en la disolucin acuosa?

Como acabas de comprobar, para un cierto volumen de disolvente orgnico, es ms
eficiente dividirlo en porciones y realizar varias extracciones que realizar una
nica extraccin simple utilizando todo el disolvente.


En realidad, el rendimiento mayor de la extraccin mltiple es una consecuencia
termodinmica de los equilibrios consecutivos. Dados el volumen total de fase
acuosa Vaq y el volumen de fase orgnica Vorg empleado en cada extraccin, puede
demostrarse que la fraccin o de soluto que permanece en disolucin acuosa
despus de n extracciones viene dada por:

n
aq
org
aq
V
V
K
|
|
|
|
|
.
|

\
|
+
=
1
1
o

Resultados:
Contesta a las cuestiones siguientes.
9
Prctica 1: Extraccin lquido-lquido: equilibrio de reparto. Extraccin simple
de I
2
en disolucin acuosa con CCl
4
. Extraccin mltiple.

Grupo: Nombres ...
...

CUESTIONES

Cuestiones parte introduccin:

1.- Explica si el etanol CH
3
CH
2
OH puede ser un buen disolvente para la extraccin
de un componente orgnico en disolucin acuosa.

2.- Por qu las sales inorgnicas como el NaCl(aq) no son extradas por un
disolvente orgnico?

3.- Los cidos orgnicos R-COOH son solubles tanto en fase acuosa como en fase
orgnica Por qu?

4.- En el ejemplo de reparto del I
2
entre agua y disulfuro de carbono por qu
el iodo es mucho ms soluble en la fase orgnica?

5.- Si en vez de iodo quisiramos extraer cido actico, Cmo influira el pH de la
disolucin acuosa sobre el rendimiento del proceso de extraccin?

Cuestiones parte 1 experimental:

1.- En la etapa 5 Por qu es necesario agitar?

2.- Qu cambios de color has observado? Cmo los interpretas?
Identifica inequvocamente las fases en el embudo. Qu fase es menos densa?

3.- Describe aqu tus observaciones sobre el test del almidn.

Cuestiones parte 2 experimental:

1.- Supn que K= 85 para la extraccin de iodo con CCl
4
. Calcula el rendimiento de la
extraccin simple y de la extraccin mltiple que has realizado
2.- Crees que el coeficiente de reparto es el mismo en una extraccin simple que
en una mltiple?
10
Observaciones:

...

11


QUIMICA ANALTICA II
Grado en Qumica
2 Curso

Prctica n 2

SEPARACIN DE Fe Y Al EN UNA MUESTRA ACUOSA
MEDIANTE EXTRACCIN SELECTIVA CON OXINA.

OBJETIVOS

Los objetivos fundamentales de la prctica se centran en familiarizar al alumno
con:
1. Efecto del pH sobre la selectividad de la extraccin
2. Efecto de la formacin de complejos en la eficacia y selectividad de la
extraccin

INTRODUCCIN

La 8-hidroxiquinolena u oxina de frmula:





(simbolizada por OxH) es un reactivo orgnico soluble en cloroformo y poco soluble
en agua en medio neutro. Dado su carcter cido-base, tiene carcter anftero,
por lo cual la solubilidad de la oxina en agua se incrementa tanto en medio cido
como en medio bsico.

Puede comportarse como cido segn:

= = +
R HR R H
81 , 9 pK 91 , 4 pK
2
2 1

N
O
12
El pH de la disolucin acuosa tiene, por tanto, una importancia decisiva en el
comportamiento de la oxina como ligando de extraccin, ya que afecta tanto a la
propia extraccin del ligando como a la formacin del quelato.
A pH entre 5,5 y 9,9 la oxina se halla fundamentalmente en forma molecular,
neutra ( OxH ) por lo que es extrada casi en su totalidad al cloroformo.

Forma quelatos metlicos (oxinatos) con un gran nmero de cationes, y dichos
oxinatos metlicos son neutros y por tanto son poco solubles en agua, pero muy
solubles en cloroformo, de forma que, al agitar una fase acuosa que contiene al
metal con una disolucin de la oxina en cloroformo, se produce la siguiente
reaccin:

donde se observa que la formacin de oxinatos, MOx
n
, depende del pH de la fase
acuosa y solo para K
f
elevadas se formar el complejo a pH bajos (alta [H
+
]).

En esta prctica se abordar el estudio de la separacin de los oxinatos de hierro
y aluminio. El oxinato de Fe (III) se extrae totalmente a partir de pH 2,8,
mientras que el oxinato de aluminio no empieza a extraerse hasta pH 3,5, siendo su
extraccin total a partir de pH 4,5 (ver Figura 1). En consecuencia, controlando de
modo adecuado el pH de la fase acuosa es posible extraer selectivamente el
oxinato frrico sin extraccin del Al (III).

Por todo lo expuesto, el pH debe fijarse con precisin, pues a un valor superior a 3
comienza a extraerse algo de Al (III) junto con el Fe (III). Por ello se recomienda
un ajuste estricto del pH entre los lmites 2,8-3,0.

El oxinato de Fe (III) extrado en cloroformo puede determinarse
espectrofotomtricamente a las longitudes de onda 470 y 580 nm.

La oxina libre presenta un mximo de absorcin a 320 nm, sin embargo, es
recomendable medir las absorbancias frente a blancos anlogos (sin el metal a
determinar) de los reactivos.




Fase
orgnica
Fase
acuosa
OxH
(cloroformo)
nOxH +M
n+
MOx
n
+n H
+
MOx
n(cloroformo)
13





REACTIVOS Y MATERIAL


Instrumentacin:

Espectrofotmetro equipado con cubetas de vidrio para la muestra. Las medidas
de absorbancia se realizan a 470 nm (hierro) .
Medidor del pH con electrodo combinado vidrio-calomelanos.

Material :

6 embudos de separacin
2 matraces aforados de 100 mL
2 matraces aforados de 250 mL
4 vasos de precipitados de 400 mL
4 vidrios de reloj (2 grandes y dos pequeos)
2 pipetas de 10 mL
1 probeta
Papel de filtro
a) Extraccin cuantitativa de Fe(III) 2,4 <pH < 3,00
E%
Efecto del pH sobre la extraccin del Fe(III) y Al(III)
a) b)
a) Extraccin cuantitativa de Fe(III) 2,4 <pH < 3,00
E%
Efecto del pH sobre la extraccin del Fe(III) y Al(III)
a) b)
14


Reactivos:

1.- Disolucin indicadora de oxina al 0,6 % en cido actico del 0,2 % ( 0,6 g
disueltos en 2 mL de AcH concentrado, diluidos a 100 mL).

2.- Amonaco 5 M (100 mL).

3.- Disolucin reguladora cido actico/acetato amnico 0,1 M de pH 2,85: Se
ponen en un vaso de precipitados aproximadamente 200 mL de la disolucin de
NH
4
Ac 0,1 M y se ajusta el pH a 2,85 utilizando un pHmetro con la disolucin de
AcH, se trasvasa a un matraz de 250 mL y se lleva a volumen con agua destilada.

4.- Disolucin de oxina al 0,4 % en Cl
3
CH. Preparar 250 mL que se compartirn
entre los dos grupo. Esta disolucin debe protegerse del contacto con la luz.

5.- Disolucin patrn de Fe (III) de 1000 g.mL
-1
.


PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Parte 1.- Curva de calibrado para el Fe

1.-Se ponen en cinco embudos de separacin 20, 30, 50, 60 y 80 g totales de Fe
(III) procedentes de diluciones de la disolucin patrn de Fe (III) y contenidos en
un volumen no superior a 4 mL, y la cantidad de agua necesaria para completar un
volumen de 4 mL; y en un embudo adicional, que se utilizar como blanco de
reactivo, 4 mL de agua destilada.

2.- Se aade en cada embudo 1 mL de la disolucin indicadora de oxina (disolucin
1) y mientras se agita se neutraliza lentamente con amonaco 5 M (de una a dos
gotas cada vez), evitando el exceso local de reactivo hasta que se inicia la
formacin del oxinato de hierro (color azul sucio).

3.-A continuacin, aadir 5 mL de la disolucin reguladora y mezclar bien las
disoluciones.

4.-Extraer con 10 mL de disolucin de oxina en cloroformo (utilizar una bureta
para aadir la disolucin), se tapa el embudo y se agita vigorosamente 2 o 3
minutos. Tras dejar separar las fases (quitando el tapn del embudo), filtrar la
fase orgnica (papel de filtro en el esprrago del embudo) sobre la cubeta de
medida.

15
5.- La absorbancia de dicha fase se mide a 470 nm frente a un blanco preparado de
forma anloga exento de Fe (III).


Parte 2.- Determinacin de Fe (III)

Proceder con la muestra problema tal y como se especifica en la curva de calibrado
del Fe (III) (tomar 1 mL de muestra y aadir 3 mL de agua, y realizar tres rplicas
de la determinacin) con lo cual a pH 2,85 se extrae selectivamente este metal y
queda en la disolucin la totalidad del Al (III). Se mide la absorbancia a 470 nm de
dicho extracto que permite determinar la concentracin de Fe (III) en la
disolucin problema

Resultados:

a) Representar grficamente la absorbancia a 470 nm frente a los g.mL
-1
de Fe
(III) y ajustar la recta por mnimos cuadrados.

b) Determinar la concentracin de Fe (III) en la muestra problema por
interpolacin sobre la curva de calibrado obtenida anteriormente.

16
Prctica 2: Separacin de Fe y Al en una muestra acuosa mediante extraccin
selectiva con oxina.

Grupo: Nombres ...
...

Resultados para la Determinacin de Fe:

Muestra Problema:.

Ajuste por mnimos cuadrados:
Ecuacin de la recta:















Muestra Problema : . . g/mL Fe


Nota: Incluir todas las representaciones grficas
mL de Fe
1000 mg/l
g/mL Fe absorbancia






Medida
muestra
absorbancia g/mL Fe
1
2
3
17
Observaciones:

...

18



QUIMICA ANALTICA II
Grado en Qumica
2 Curso

Prctica n 3

IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE VITAMINAS
POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN
(HPLC)


OBJETIVOS

1. Familiarizar al alumno con la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC):
manejo de instrumentacin, control de las separaciones, identificacin de picos.
2. Iniciar al alumno en la determinacin cuantitativa: El objeto de esta
prctica es realizar la determinacin de vitaminas liposolubles, A (Retinol), D
2

(Ergocalciferol) y E (o-Tocoferol), en un preparado farmacutico

INTRODUCCIN

El estudio de vitaminas liposolubles (A, D
2
, E y K) es de gran importancia
tanto en Qumica Clnica como en Nutricin. Dichas vitaminas presentan una
estructura qumica isoprenoide (Figura 1). Son sensibles a la luz, sufriendo
procesos de isomerizacin u oxidacin, y degradndose si se someten a altas
temperaturas. Estas propiedades hacen que su determinacin por
Cromatografa de Capa Fina (TLC) y por Cromatografa de Gases (GC) est
limitada. Sin embargo, la Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC)
resulta adecuada ya que evita el contacto de los analitos con el aire y la luz,
llevndose a cabo la determinacin a temperatura ambiente.



19

VITAMINA A





VITAMINA D
2



VITAMINA E
Figura 1
20



REACTIVOS Y MATERIAL

Reactivos

1.- Se suministrarn ya preparados las siguientes disoluciones stock en metanol

Vitamina A 1500 g mL
-1

Vitamina D
2
1000 g mL
-1

Vitamina E 19000 g mL
-1


2.- Metanol grado HPLC

Material
5 Matraces aforados de 10 mL
3 pipetas de 5 mL

Condiciones instrumentales

Columna Fase Inversa C18
Detector de absorbancia Longitud de onda 254 nm
Fase mvil 100 % Metanol
Elucin Isocrtica
Flujo 1-2 mL min
-1
(depende del equipo)
Inyector Rheodyne Vlvula de 6 puertas y bucle de muestra de 20 L


PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Parte 1.- Preparacin de patrones.
1. Para la determinacin de tiempos de retencin se preparan 10 mL en metanol
de disoluciones individuales de vitamina A y vitamina D
2
de las siguientes
concentraciones:
21

Vitamina A 75 g mL
-1

Vitamina D
2
50 g mL
-1


Nota: Ser necesario calcular los volmenes correspondientes de los patrones
stock que llevados a 10 mL den la concentracin requerida.

2. Para la curva de calibrado: Preparad 10 mL en metanol de mezclas de los tres
patrones de las siguientes concentraciones

Concentraciones (g mL
-1
)
Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3
Vitamina A 75 150 225
Vitamina D
2
50 100 150
Vitamina E 950 1900 2850

Nota: Ser necesario calcular los volmenes correspondientes de los patrones
stock que llevados a 10 mL den la concentracin requerida.

Parte 2.- Identificacin: Inyeccin individual de 2 de los 3 patrones de vitaminas
para determinar el tiempo de retencin de cada compuesto en las condiciones
cromatogrficas utilizadas. El tiempo de retencin del tercer compuesto se
deducir en las inyecciones de la mezcla de patrones.

Parte 3.-Medidas para la cuantificacin (construccin de la curva de
calibrado): Inyeccin por duplicado de tres niveles de concentracin de una mezcla
conteniendo las tres vitaminas. Se representar las reas del pico cromatogrfico
con la correspondiente concentracin para cada caso.

Parte 4.-Anlisis de un preparado farmacutico. Determinacin cualitativa de
las vitaminas consideradas en el extracto metanlico de una muestra real. Se
inyectar por duplicado la muestra y se determinar la concentracin de cada
vitamina segn la curva de calibrado
22

Nota: Se suministrar el extracto metanlico de un preparado farmacutico.

Resultados:

1. Realiza los clculos necesarios para preparar las disoluciones de patrones y
psalos al informe. Qu volumen de cada una de las vitaminas tienes que tomar
de cada disolucin concentrada para preparar cada uno de los niveles de
calibrado?.
2. Identifica cada una de las vitaminas mediante su tiempo de retencin.
3. A partir del rea de los picos cromatogrficos de la mezcla de patrones
establecer las rectas de calibrado correspondientes a cada patrn mediante
anlisis de regresin lineal (mnimos cuadrados). Se ajustan los datos al
modelo lineal?.
4. A partir de las rectas de calibrado calcular la concentracin de cada uno de los
componentes del preparado farmacutico.
23
Prctica 3: Identificacin y cuantificacin de vitaminas por Cromatografa
Lquida de Alta Resolucin (HPLC).

Grupo: Nombres ...
...

1.- Clculos para preparar las disoluciones de patrones:
mL vit A mL vit D
2
mL vit E
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3

2.- Identificacin de las vitaminas:
tR (min)
Vit A
Vit D
2

Vit E

2.- Rectas de calibrado (ajuste por mnimos cuadrados):






Ecuacin de la recta vit A:
R
2
=
Vit D
2
rea (iny 1) rea (iny 2) rea media
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
Ecuacin de la recta Vit D2:
R
2
=
Vit A rea (iny 1) rea (iny 2) rea media
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
24
Vit E rea (iny 1) rea (iny 2) rea media
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
Ecuacin de la recta Vit E
R
2
=

3.- Clculo de las concentraciones de vitaminas en el extracto problema:

Medida de la
muestra
rea (iny 1) rea (iny 2) rea media
Vit A
Vit D
2

Vit E

Muestra Problema : . . g/mL vit A
. . g/mL vit D
2

. . g/mL vit E



Nota: Incluir todas las representaciones grficas


Observaciones:

...

25


QUIMICA ANALTICA II
Grado en Qumica
2 Curso

Prctica n 4

DETERMINACIN DE HIDROCARBUROS ALIFTICOS EN
AGUA DE MAR MEDIANTE CROMATOGRAFA DE GASES

OBJETIVOS
1. Familiarizar al alumno con la cromatografa de gases como tcnica
separativa, identificativa y cuantificativa de especies volatilizables en
muestras complejas: manejo de la instrumentacin, medida y control de los
flujos de fase mvil, caractersticas de las fases estacionarias, modos de
inyeccin, control de la temperatura, deteccin.

2. Aplicacin de la tcnica a la determinacin de hidrocarburos alifticos en un
extracto de agua de mar contaminada.
INTRODUCCIN
La cromatografa de gases es la tcnica de eleccin en la separacin de especies,
fundamentalmente de naturaleza orgnica, voltiles o volatilizables, como los
hidrocarburos alifticos de cadena media. La reproducibilidad en los tiempos de
retencin de las especies cromatografiadas en las mismas condiciones
experimentales que los patrones puros de las mismas, constituye una herramienta
identificativa. Por otra parte, la medida del rea de los picos correspondientes a
cada uno de los componentes separados puede relacionarse con su concentracin.
MATERIAL Y REACTIVOS
Instrumentacin:
Cromatgrafo de gases con detector de ionizacin de llama (FID)
Columna con fase estacionaria de 5% difenil dimetilpolisiloxano:
A) Equity-5 15 m x 0.25 mm D.I. x 0.25 m fase (cromatgrafo 1)
26
B) HP-5 15 m x 0.53 mmm D.I. x 1.5 m fase (cromatgrafo 2)
Microjeringa de inyeccin
Medidor de flujos de burbuja

Reactivos:
Hexano
Hidrocarburos (patrones puros 0,3 %):
tetradecano, pentadecano y hexadecano
Mezclas de patrones: 0,010 %, 0,020 %, 0,030 %
Extracto de muestra de agua problema

Material:
Viales de 10 mL

PARTE EXPERIMENTAL
1. Encender el cromatgrafo de gases y comprobar las presiones de salida en las
bombonas de los gases.
2. Medida de los flujos de gas portador (nitrgeno): purga, split y columna (en el
detector apagado y con la electrnica en OFF).
Como referencia tomar los siguientes valores (aunque pueden cambiar de
acuerdo con las indicaciones del profesor):

Flujos (mL/min) Columna Split Purga
Cromatgrafo 1 1 15 4
Cromatgrafo 2 15 15 4

3. Encender el detector. Establecer la temperatura del inyector a 200C y del
detector a 250 C. La temperatura del horno se programa de la siguiente
forma:
Cromatgrafo 1: T
inicial
: 100C, T
final
: 210C con una rampa de 20C/min.
Cromatgrafo 2: T
inicial
: 100C, tiempo
inicial
: 1 min, T
final
: 200C con una
rampa de 15C/min.

4. Inyectar 1 L de hexano.
5. Inyectar sucesivamente 1 L de cada patrn individual de hidrocarburo. Una
vez inyectado, tener la precaucin de lavar varias veces la jeringa con hexano.
Registrar los tiempos de retencin de cada hidrocarburo.
27
6. Preparacin de la curva de calibrado: Inyectar por duplicado 1 L de la mezcla
de patrones de cada uno de los 3 niveles de concentracin.
7. Inyectar por duplicado 1 L del extracto del agua problema.

Tratamiento de los resultados y cuestiones:

1. Identificar cada uno de los hidrocarburos estudiados en el cromatograma del
extracto de la muestra. En qu parmetro te basas para realizar este estudio
cualitativo?.

2. Calcular el nmero de platos tericos y la altura equivalente a un plato terico
de la columna utilizada a partir de los datos del pico del hexadecano. Qu se
pretende evaluar mediante estas medidas?

3. Calcular la resolucin de los 2 componentes que eluyen primero.

4. Calcular la media de las reas para cada nivel de concentracin y representar las
curvas de calibrado sobre el mismo papel milimetrado, realizando el ajuste por
mnimos cuadrados.

5. A partir de las curvas de calibrado, calcular la concentracin de los
hidrocarburos en la muestra de agua, suponiendo que 1 litro de la misma ha sido
extrado con 25 mL de n-hexano (extracto a partir del cual se realizan las
inyecciones).

6. Es adecuada la fase estacionaria de esta columna para la separacin de los
hidrocarburos? Qu columna utilizaras para la separacin de una mezcla de
pesticidas? Y de aldehdos y cetonas?. Consulta algn catlogo (disponible en el
laboratorio) para responder.

7. Por qu el inyector de un cromatgrafo de gases se calienta a temperaturas
relativamente altas?

8. Qu es un programa de temperaturas y cul es su finalidad?.

28
Prctica 4: Determinacin de hidrocarburos en agua de mar mediante
cromatografa de gases

Grupo: Nombres ...
...

1.- Identificacin de los hidrocarburos en el cromatograma: parmetro utilizado:




2.- Clculo de N y H (tener en cuenta la longitud de la columna utilizada en
cada caso)

tR (min) Wb (min) N H


3.- Clculo de la resolucin


Rs=


4.- Rectas de calibrado (ajuste por mnimos cuadrados):

Tetradecano rea (iny 1) rea (iny 2) rea media
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3

Ecuacin de la recta Tetradecano
R
2
=

29

Pentadecano rea (iny 1) rea (iny 2) rea media
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
Ecuacin de la recta Pentadecano
R
2
=

Hexadecano rea (iny 1) rea (iny 2) rea media
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3 -
Ecuacin de la recta Hexadecano
R
2
=

5.- Clculo de las concentraciones de hidrocarburos en el extracto problema:










Muestra Problema : . . g/mL Tetradecano
. . g/mL Pentadecano
. . g/mL Hexadecano


Nota: Incluir todas las representaciones grficas

Medida de la
muestra
rea (iny 1) rea (iny 2) rea media
Tetradecano
Pentadecano
Hexadecano
30
6.- a) Es adecuada la fase estacionaria de esta columna para la separacin
de los hidrocarburos?



b)Qu columna utilizaras para la separacin de una mezcla de
pesticidas? Y de aldehdos y cetonas?



7.- Por qu el inyector de un cromatgrafo de gases se calienta a
temperaturas relativamente altas?




8.- Qu es un programa de temperaturas y cul es su finalidad?






Observaciones:

...




31


QUIMICA ANALTICA II
Grado en Qumica
2 Curso

Prctica n 5

DETERMINACIN DE CAFENA EN DIFERENTES MUESTRAS
(CAF, T Y BEBIDAS DE COLA) MEDIANTE HPLC CON
DETECCIN UV

OBJETIVO

1. Familiarizar al alumno con la cromatografa de lquidos de alta resolucin
(HPLC): manejo de la instrumentacin, preparacin de la fase mvil, control del
flujo de fase mvil, deteccin.

2. Aplicacin de la tcnica a la determinacin de la concentracin de cafena en
diferentes muestras (caf, t y bebidas de cola) por HPLC en fase inversa.


INTRODUCCIN

El mtodo tradicional para la determinacin de cafena es medir su
absorbancia con un espectrofotmetro. La Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin (HPLC) es un mtodo de separacin que se utiliza fundamentalmente
para la determinacin de sustancias no voltiles, generalmente polares y/o
trmicamente lbiles. Con HPLC se consigue separar ms fcil y rpidamente la
cafena de otras sustancias, tales como: cido tnico, cido cafeico y azcares, que
tambin se encuentran en este tipo de bebidas.
Una vez conectado el cromatgrafo y estabilizado el flujo, se procede a la
inyeccin de disolucin patrn de cafena de distintas concentraciones (2
inyecciones por lo menos de cada nivel). De los cromatogramas resultantes se
obtienen los datos de tiempo de retencin (t
R
)

y rea de pico. Si el flujo y la
presin de la bomba se han mantenido constantes a lo largo de todo el
experimento, t
R
podr utilizarse como medida cualitativa y el rea de pico como
medida cuantitativa. Se construye la curva de calibrado (rea de pico vs.
concentracin de los patrones de cafena) y posteriormente se inyecta la muestra,
pudindose calcular la concentracin del analito presente en la misma.
32

REACTIVOS Y MATERIAL

Instrumentacin:

Cromatgrafo de lquidos de alta resolucin.
Columna cromatogrfica de fase Inversa: C
18
.
Detector de absorbancia UV (= 254 nm)

Reactivos:

Cafena (patrn puro)
Metanol
Agua Milli-Q
cido actico

Material:

1 matraz aforado de 1000 mL
5 matraces aforados de 100 mL
1 matraz aforado de 50 mL
1 matraz aforado de 25 mL
1 pipeta de 10 mL y otra de 25 mL
Viales de 10 mL
Filtros de muestra compatibles con metanol


PARTE EXPERIMENTAL

1.-Preparar 1 L de una disolucin: 20 % metanol/ 0.1 % cido actico/ 79.9 % agua
(~ pH 3.5).
Esta disolucin se utilizar para preparar los patrones para el calibrado; la
misma disolucin se utiliza como fase mvil en el sistema cromatogrfico,
pero se da preparada porque hay que desgasificarla convenientemente, ya
sea con una corriente continua de Helio o en un bao de ultrasonidos
durante 5 minutos, y este proceso no puede realizarse en el laboratorio de
prcticas.

2.-Preparacin de la curva de calibrado: A partir de la disolucin patrn
concentrada de cafena de 1,000 g/L preparar en 5 matraces de 100 mL,
disoluciones de 0,025 g/L, 0,050 g/L, 0,075 g/L, 0,100 g/L y 0,125 g/l, utilizando
como disolvente la disolucin preparada en el punto 1, y agitando convenientemente
para asegurar su homogeneidad.

33
3.- Preparar y conectar el sistema cromatogrfico:

a) Encender la bomba: Fase movil: Metanol / agua milliQ ( 20:80)
acidulada a pH 3.5
Flujo: 2.0 mL/min.
b) Encender el detector de absorbancia: Longitud de onda: 254 nm
c) Enceder ordenador e impresora

[Antes de inyectar los patrones en la columna, dejar pasar fase mvil durante 5-10
min, registrando simultneamente la respuesta en el detector, para asegurarse de
que no quedaron sustancias retenidas en la columna procedentes de experimentos
previos y de que la lnea de base es estable|.

4.- Realizar 2 inyecciones de cada nivel de concentracin de cafena, de menor a
mayor concentracin: cargar la muestra con la vlvula en posicin LOAD (20 L) e
inyectar girando a la posicin INJECT.

5.- Preparacin de las muestras de bebida:

Caf: 0.5 g de caf en 150 mL de agua caliente. Tomar 10 mL de caf,
enrasar a 25 mL con metanol/agua/actico (20:79,9:0,1) y filtrar 5 mL
de la disolucin resultante.

T: 1 bolsa en 150 mL de agua caliente. Tomar 7-10 mL de t, enrasar a
25 mL con metanol/agua/actico (20:79,9:0,1) y filtrar 5 mL de la
disolucin resultante.

Bebidas de cola: 15 mL de bebida de cola (Eliminar carbnico por
agitacin con varilla). Inyeccin directa, filtrando.

6.- Inyectar las muestras de bebida por duplicado.


TRATAMIENTO DE LOS DATOS Y CUESTIONES


Tratamiento de los datos:
1. Determinar a partir del tiempo de retencin medio del pico de cafena
patrn qu pico en el cromatograma de la muestra es originado por la
cafena.
2. Construccin de la curva de calibrado: Concentracin frente a rea del pico
(valor medio de las 2 inyecciones).
3. Calcular la concentracin de la muestra segn la curva de calibrado: tomar
el rea media de pico de la muestra e interpolar el valor en la curva de
calibrado para determinar la concentracin de cafena en mg/mL. Incluir
correcciones por dilucin en los clculos.
34

Prctica 5: Determinacin de cafena en diferentes muestras (caf, t y
bebidas de cola) mediante HPLC con deteccin UV

Grupo: Nombres ...
...

1.- Identificacin de la cafena en el cromatograma:



2.- Rectas de calibrado (ajuste por mnimos cuadrados):

Cafena Area (iny 1) Area (iny 2) Area media
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3

Ecuacin de la recta Cafena
R
2
=

3.- Clculo de las concentraciones de cafena en las muestras problema:







Muestra Problema : . . mg/mL Cafena
. . mg/mL Cafena
. . mg/mL Cafena

Medida de la
muestra
rea (iny 1) rea (iny 2) rea media
Caf
Te
Cola
35
Nota: Incluir todas las representaciones grficas

Cuestiones
1.- A qu trmino ingls corresponden las siglas HPLC y cul es su
significado?

2.- En qu se diferencian HPLC en fase normal y en fase inversa?




3.- En qu se diferencian elucin isocrtica y elucin en gradiente? Y en
qu se parecen la elucin en gradiente en HPLC y la programacin de
temperaturas en GC?.





4.- Los picos (ms o menos definidos) que aparecen antes de la cafena en las
inyecciones de las muestras: A qu pueden deberse? Son ms o menos
polares que la cafena?.





Observaciones:

...