DETERMINACIN DE GRUPOS SANGUNEOS. TITULACIN DE ANTISUEROS.

1.- INTRODUCCIN La determinacin del grupo sanguneo es una pr ctica !a"itual e imprescindi"le para la trans#usin de componente !em ticos. La ra$n est en %ue el sistema inmune de algunos indi&iduos rec!a$a los !emates de otros. 'sta reaccin inmunolgica est mediada por anticuerpos ( es # cilmente &isuali$a"le in &itro mediante reacciones de aglutinacin. )e conocen m s de *+ grupos de antgenos eritrocitarios codi#icados en otros tantos loci g,nicos- para los cuales e.isten m/ltiples &ariantes al,licas. 'l resultado son m s de *++ antgenos eritrocitarios identi#ica"les. 'stos antgenos &aran en su inmunogenicidad. Los m s importantes a e#ectos trans#usionales son los antgenos del sistema 0 1 23O ( los del sistema R!esus 4R!5. Sistemas H y ABO Los eptopos responsa"les son car"o!idratos %ue aparecen en glicoes#ingolpidos de mem"rana ( tam"i,n en glucoprotenas. 'l gen 0 codi#ica la en$ima #ucosil trans#erasa- %ue adiciona #ucosa a una cadena oligosacardica precursora. Los tres /ltimos a$/cares de la cadena se denominan antgeno 0 46igura 15. 'n un locus aparte est el sistema 23O- con tres alelos. 'l alelo 2 codi#ica una trans#erasa %ue une N-acetil galactosamina a la cadena 0- mientras %ue el alelo 3 codi#ica una trans#erasa %ue une una galactosa. 'l alelo O no produce trans#erasa ( por tanto no modi#ica la sustancia 0. 'l a$/car unido al car"ono 7 de la galactosa determina la acti&idad antig,nica. La galactosa no acepta a$/car en el car"ono 7 a no ser %ue !a(a #ucosa unida al car"ono *.

Figura 1. 's importante destacar %ue estos genes son codominantes. Los indi&iduos %ue e.presan los alelos 2 ( 3 tendr n oligosac ridos con los dos tipos de modi#icaciones. 2s- se distinguen 8 grupos9 2- 3- 23 ( O. La importancia trans#usional de estos antgenos radica en %ue los indi&iduos de un grupo sinteti$an anticuerpos #rente a los oligosac ridos %ue no est n en sus !emates 4Ta"la 15. 'stos anticuerpos- %ue se denominan isoaglutininas ( %ue suelen ser Ig:- aparecen en grandes cantidades en circulacin sin necesidad de e.posicin pre&ia a sangre de otros grupos. La ra$n

parece estar en la reacti&idad cru$ada de sustancias presentes en "acterias de la #lora intestinal. Tabla 1 Grupo sa gu! "o 2 3 23 O Sistema Rhesus )e !an identi#icado m s de 8+ antgenos del sistema R! aun%ue no se sa"e cuantos genes son responsa"les de este sistema. )on protenas integrales de mem"rana con un contenido lipdico alto. D es el antgeno R! m s inmunog,nico ( por tanto el m s importante a e#ectos trans#usionales. La presencia de D da lugar al R!;- mientras %ue la ausencia 4d5 da lugar al R!-. Los anticuerpos anti D- %ue son Ig<- aparecen en la circulacin de los indi&iduos R!- slo tras una e.posicin pre&ia a sangre D- por e=emplo por una trans#usin de !emates o tras la gestacin de un #eto D. Determinacin de antgenos eritrocitarios y anticuerpos sricos 2ntes de una trans#usin se anali$an los eritrocitos del receptor para 23O ( D mediante antisueros anti-2- anti-3 ( anti-D. )imult neamente se anali$a el suero para detectar anticuerpos contra antgeno eritrocitarios 4isoaglutininas5- mediante !emates 2 ( 3 pre&iamente tipados. Las reacciones positi&as dan lugar a la aglutinacin de los !emates. >ara asignar un grupo sanguneo- am"as prue"as de"en dar un resultado coincidente. Los resultados discrepantes de"en anali$arse cuidadosamente. Un test adicional es la prue"a cru$ada- %ue e.amina la compati"ilidad entre suero del receptor con los !emates del1los donantes. >ara ello- !emates la&ados del donante se me$clan con suero del receptor- se incu"an- se centri#uga ( se e.amina para !emlisis ( aglutinacin *.- O3?'TI@O) 2l #inali$ar la pr ctica el alumno ser capa$ de9 Interpretar reacciones de aglutinacin. Determinar los grupos 23O ( R! 4D5 en !emates. Determinar 23O en suero. O"tener antisueros para tipa=e. Titular un antisuero. G" o#ipo 22- 2O 33- 3O 23 OO A #!g" os "ri#ro$i#arios 2 3 2(3 0 A #i$u"rpos s%ri$os 2nti-3 2nti-2 2nti-2- 2nti-3

7.- 'AUI>2:I'NTO

Centr#uga con rotor para tu"os de 1*.BC 1+.B+ 4alternati&amente- con rotor para placas microtiter5 Centr#uga para tu"os eppendor# 4tipo :ini#uge5 :icroscopio Transiluminador >ortao"=etos o placa microtiter de #ondo en U Tu"os eppendor# Tu"os de 1+.B+ mm >ipetas de C-8+- 8+-*++ ( *++-1+++l ( puntas Lancetas de un solo uso

8.- R'2CTI@O) D :U')TR2) 2ntisueros anti-2- anti-3 ( anti-D )uero salino #isiolgico 4NaCl +.ECF5 :uestras de sangre anticoagulada con 'DT2 4tu"os de * ml descartes rutinarios de los !emogramas5. )e emplear n C o m s tu"os por pare=a de alumnos. 2lgodn ( alco!ol etlico de B+

C.- >ROC'DI:I'NTO PRECAUCIN& To'as las (u"s#ras '"b" $o si'"rars" po#" $ial(" #" i )"$$iosas C.1 Determinacin de 23O ( R! 4D5 en !emates 15 >reparar un portao"=etos ( un tu"o eppendor# rotulado con las iniciales del alumno. 'n este /ltimo se pipetea 1 ml de suero salino #isiolgico. *5 )e limpia un dedo con un algodn !umedecido en alco!ol ( se pinc!a con la lanceta. 2lternati&amente- puede tomarse la sangre de los tu"os anticoagulados con 'DT2. 75 )o"re un portao"=etos se depositan tres gotas de apro.imadamente +.C cm de di metro 4*C-C+ Gl5 "ien separadas. 85 Tomar 1+ Gl de sangre ( pipetearlos en el tu"o eppendor#. <uardar a temperatura am"iente- se procesar al #inal. C5 )o"re cada gota de sangre del porta se pipetean *C Gl de antisuero. 'l orden recomenda"le es anti-2- anti-3- anti-D. H5 :e$clar con una punta de pipeta durante unos segundos B5 Determinar la aglutinacin e interpretar el resultado. >uede &isuali$arse en el transiluminador o utili$ar un microscopio en caso de reaccin mu( d,"il. E5 Determinar la #recuencia de cada grupo en la clase ( compararla con las #recuencias esta"lecidas. <rupo 2 3 23 O R! negati&o F en la clase

C.* La&ado ( preparacin de !emates al *F 15 Rotular el tu"o eppendor# de los 1+ Gl de sangre con el grupo !em tico o"tenido 423- 23- O5. *5 Centri#ugar el tu"o 1 minuto en la :ini#uge a &elocidad alta. 75 Descartar el so"renadante con "om"a de &aco. 85 Resuspender el pellet ( aIadir 1ml de suero #isiolgico. C5 Repetir los pasos * ( 7. H5 Resuspender en 8J+ Gl de suero #isiolgico. 2 esto se denomina !emates al *F 4&1&5. 'stos !emates ser n compartidos por todos los alumnos del grupo. *.7 Determinacin de 23O en suero o plasma 4opcional5 15 *5 75 85 Centri#ugar la sangre C minutos a 8++.g. '.traer el suero 4o plasma5 ( depositarlo en un tu"o eppendor#. La&ar ( diluir !emates 2 ( 3 al *F 4&1&5 en suero #isiolgico 4>rotocolo C.*5. >ipetear C+ Gl de suero en dos tu"os de poliestireno de 1+.B+ o en dos pocillos. >ueden tam"i,n prepararse controles negati&os 4suero #isiolgico5 ( positi&os 4suero anti-2-35. C5 >ipetear *C Gl de !emates 2 en un tu"o 4o pocillo5 ( !emates 3 en el otro ( me$clar. H5 Centri#ugar a 8++.g 1C segundos. B5 Dispersar el pellet ( determinar aglutinacin. C.8 O"tencin ( titulacin de antisueros anti-2- anti-3 ( anti-2-3 a partir de muestras de plasma. 15 Tomar C tu"os de sangre anticoagulada con 'DT2 elegidos al a$ar. *5 Centri#ugar la sangre C minutos a 8++.g. 75 '.traer cuidadosamente el plasma ( depositar en un tu"o eppendor# rotulado con el n/mero de la muestra. 'l pellet celular se reser&a por si #uera necesario posteriormente. 85 'n una gradilla colocar 1C tu"os de poliestireno de 1+.B+ 4C #ilas . 7 columnas5 4o utili$ar una placa microtiter de #ondo en U5 C5 >ipetear C+ Gl de cada plasma en los 7 tu"os 4pocillos5 de cada #ila 4Ta"la de resultados5. H5 'n los C tu"os de la primera columna pipetear *C Gl de !emates 2. 'n las columnas *K ( 7K pipetear *C Gl de !emates 3 ( O respecti&amente. >uede procesarse una 8K columna de tu"os si se !u"ieran encontrado !emates 23 4ser un control positi&o5. B5 Incu"ar C minutos. E5 Centri#ugar a 8++.g 1C segundos. J5 Dispersar el pellet ( determinar aglutinacin. 4)i se !a tra"a=ado en placa- dispersar el pellet con una pipeta ( o"ser&ar al microscopio in&ertido- centr ndose en el #ondo del pocillo5. Cali#icar cada tu"o o pocillo con -- ; ( ;; seg/n la aglutinacin o"ser&ada ( anotar en la ta"la de resultados. 1+5>reparar pooles de antisueros anti-2- anti-3 ( anti-2-3 me$clando todos los o"tenidos en el grupo de pr cticas.

115Titular los pooles de antisueros o"tenidos 4uno cada pare=a de pr cticas5. >ara ellolle&ar a ca"o una dilucin seriada 11* ( anali$ar la aglutinacin de una cantidad constante de !emates 2 o 3- tal ( como se descri"e a continuacin. 1*5Tomar E tu"os ( rotular 1- 11*- 118- 11E- 111H- 117*- 11H8 ( 111*E. 175>ipetear C+ Gl de suero salino #isiolgico en todos los tu"os e.cepto en el rotulado como 1. 185>ipetear C+ Gl de antisuero en el primer ( segundo tu"o ( me$clar. Del segundo tu"o tomar C+ Gl ( pasarlos al siguiente- ( as sucesi&amente. Descartar C+ Gl del /ltimo tu"o. 1C5>ipetear *C Gl de !emates %ue correspondan ( me$clar. 1H5Incu"ar C minutos. 1B5Centri#ugar a 8++.g 1C segundos. 1E5Dispersar el pellet ( determinar aglutinacin. 2notar en la ta"la. 1J5'l ttulo del antisuero ser la in&ersa de la m .ima dilucin aglutinante. Ta"la de resultados 0':2TL') 2 >L2):2 >lasma 1 >lasma * >lasma 7 >lasma 8 >lasma C Titulacin Dilucin9 1 2glutinacin 4;;;- ;1- -- 5 3 +

11*

118

11E

111H

117*

11H8

111*E

>RO6')OR 'ptopos 23O se encuentran en muc!as otras c,lulas aparte de los eritrocitos. )e !an descrito 11 su"grupos de 2. Los m s importantes son 21 ( 2*. Las di#erencias son cuantitati&as. Los !emates 21 tienen en mem"rana apro.. Un milln de copias- mientras %ue los 2* tienen *C+ +++. 2pro.imadamente un BEF de los indi&iduos 2 son 21 ( **F son 2*. La sangre 23 tam"i,n puede di&idirse en tipos 213 ( 2*3. Los 2 o 3 d,"iles dar n aglutinacin con anti-2-3 pero no con los otros antisueros. 2pro.imadamente el 1F de las muestras de sangre elegidas al a$ar contienen aglutininas %ue pueden dar anormalidades en la determinacin de anticuerpos s,ricos.

>ueden ser anti 21- anti-0- autoanticuerpos- o sueros de mieloma %ue producen roleau. o "ien anticuerpos ad%uiridos por trans#usiones o de origen materno en niIos. 'n otros casos los anticuerpos pueden no detectarse- por e=emplo en inmunode#iciencias o en ancianos o en reci,n nacidos. 'n algunos indi&iduos el gen 0 est ausente. 'ste #enotipo ! !omo$igtico se denomina 3om"a(. Los indi&iduos de #enotipo 3om"a( tienen ttulos altos de anti-2anti-3 ( anti-0 en su circulacin. 2ntgeno 29

'.isten &ariantes d,"iles de D denominadas D u %ue pueden no detectarse en an lisis rutinarios- si se identi#ican con antiglo"ulina. No !a( peligro (a %ue los indi&iduos R!no se sensi"ili$an con eritrocitos D u positi&os. La ma(ora de los antgenos sanguneos restantes raras &eces participan en reacciones trans#usionales. Los anticuerpos contra los sistemas Midd- Du##(- Mell ( :N) pueden originar !emlisis si un indi&iduo sensi"ili$ado reci"e sangre positi&a para estos antgenos. 'n general- los anticuerpos !emolticos son Ig< ( reaccionan a 7B C. Casi nunca producen !emlisis los anticuerpos Ig: o de reaccin en #ro. Los antgenos R! est n tan separados en la mem"rana de los R3C %ue los 2c Ig< anti R! no #i=an complemento ni aglutinan los eritrocitos R!4;5. Lisan los R3C por opsoni$acin. >ara detectarlos se emplea anti Ig< !umana 4test de Cooms indirecto5 si aglutinan los Ig:. 'n general- estas prue"as de aglutinacin se lle&an a ca"o en solucin salina. )e sa"e %ue esto disminu(e la sensi"ilidad a la !ora de detectar anticuerpos Ig< de"ido a las #uer$as inicas de repulsin entre los eritrocitos. >ara incrementar la sensi"ilidad puede aIadirse al"/mina o solucin de "a=a #uer$a inica o poli"reno o tratar a los !emates con en$imas. La me=or pr ctica trans#usional es dar sangre isogrupo siempre 4c,lulas- plasma (

pla%uetas5. Cuando esto no se puede- los receptores 2 o 3 pueden reci"ir !emates O ( los 23 de cual%uier grupo. Los receptores O slo reci"en !emates O. 'l plasma con anti-2 o anti-3 raramente causa pro"lemas sal&o en niIos mu( pe%ueIos. 'l plasma O es m s pro"a"le %ue cause pro"lemas ( de"e ser la /ltima eleccin en pacientes de grupo distinto del O. >ara concentrado de pla%uetas 4%ue tienen 230 ( apro.. C+ ml de plasma5 se siguen las mismas indicaciones %ue para !emates. 6R'CU'NCI2) <rupo sanguneo 2 3 23 O R! negati&o 6recuencia 4F5 en cauc sicos U)2 8+ 11 8 8C 1C 6recuencia 4F5 en asi ticos U)2 *E *B C 8+ :enor del 1CF 6recuencia 4F5 en negros U)2 *B *+ 8 8J :enor del 1CF

I)OIN:UNIN2CIN R! La pre&alencia de la #ormacin de 2c anti R! depende de la dosis de c,lulas reci"ida. 1ml de c,lulas sensi"ili$a al 1CF de indi&iduos e.puestos- mientras %ue *C+ ml sensi"ili$an al H+-B+F. Despu,s de la e.posicin- tan pronto como a las 8 semanasse detectan ac Ig: d,"iles- seguido de una con&ersin r pida a Ig<. Una segunda e.posicin a tan solo +.+7 ml de eritrocitos puede desencadenar una #ormacin r pida de Ig<. La en#ermedad !emoltica del RN ocurre por paso de sangre del #eto R!; a la madre R!- 4durante el em"ara$o o durante el parto5. Los 2c Ig< pueden atra&esar la placenta produciendo la !emlisis de los eritrocitos #etales. Inmuni$acin R! se presenta en el E-JF 41HF seg/n Rosen5 de las mu=eres R!- tras el parto del primer !i=o R!; 23O-compati"le ( en el 1.C-*F 4BF seg/n Rosen5 cuando el !i=o R!; es 23O-incompati"le. La inmuni$acin R! puede e&itarse casi totalmente si se administra una dosis alta de anti R! 4R!Ig5 a las *E semanas de gestacin 47++ Gg- %ue no ele&an el ttulo de anti R! materno por encima de 118 ( no daIa al #eto5 ( a las B* !oras del parto 4o de la dosis potencialmente sensi"ili$ante de c,lulas R!;5. Una dosis de 7++ Gg de R!Ig intramuscular pre&iene la inmuni$acin por e.posicin a !asta 7+ ml de c,lulas R!;. >uede utili$arse como pro#ila.is en casos de a"orto o amniocentesis. La administracin de R!Ig a mu=eres em"ara$ads no tiene e#ecto per=udicial para el #eto. Una &e$ %ue el indi&iduo est inmuni$ado- la administracin de R!Ig es ine#ica$.