UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

CURSO : UNIDAD : TEMA : PROFESOR :

FISIOLOGIA Y GENETICA MICROBIANA CUARTA RECOMBINACION BACTERIANA DR. PEDRO MERCADO MARTINEZ

RECOMBINACION BACTERIANA INTRODUCCIN En las poblaciones bacterianas constantemente estn surgiendo mutaciones a causa de los errores que aparecen durante la replicacin. Si existe cualquier ventaja selectiva para una mutacin en particular (ej. resistencia a antibiticos), la mutante enseguida se convertir en el principal componente de la poblacin, debido a la rpida tasa de crecimiento de las bacterias. Adems, dado que las bacterias son organismos haploides, an las mutaciones que normalmente podran ser recesivas sern expresadas. Por ello, en poblaciones bacterianas las mutaciones pueden representar un problema en el tratamiento de las infecciones causadas por bacterias. No solo son problema las mutaciones, las bacterias tienen mecanismos por los cuales sus genes pueden transferirse de una clula a otra. Por tanto, una mutacin que surge en una clula siempre puede ser transmitida a las otras. La transferencia gentica en bacterias es unidireccional y va de una clula donadora a una receptora y la donadora usualmente cede solamente una pequea parte de su DNA a la receptora. Por tanto, no se forman cigotos completos; en su lugar se forman cigotos parciales (merocigotos). Los genes bacterianos usualmente se transfieren a miembros de la misma especie aunque ocasionalmente puede ocurrir transferencia hacia otras especies. En bacterias encontramos los siguientes tipos principales de recombinacin: 1. Recombinacin general u homloga Puede ocurrir en cualquier lugar del genomio, por emparejamiento entre pares de secuencias que presenten una homologa suficientemente extensa. Depende de la intervencin de un equipo enzimtico caracterstico, en el que la protena RecA (o equivalente) es central en el proceso. 2. Recombinacin especfica legtima (conservativa) Requiere cortas secuencias de homologa entre el exogenote y el endogenote (por eso se llama tambin especfica de sitio), que son reconocidas por protenas especficas. Es independiente de RecA.
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Este tipo de recombinacin es tpica de la integracin de genomios de fagos en sitios concretos del genomio de bacterias hospedadoras. 3. Recombinacin especfica ilegtima: fenmenos de transposicin No depende de homologas (ni siquiera cortas) entre el exogenote (en este caso, un elemento gentico transponible, como IS o Tn) y el endogenote. Tambin es independiente de RecA. El elemento transponible codifica una enzima (genricamente se les denomina transposasas) que reconoce secuencias especficas inversamente repetidas en los extremos del propio elemento, lo cual se requiere para el proceso de transposicin. Muchos elementos transponibles (pero no todos) poseen un mecanismo replicativo de transposicin: es decir, al transponerse dejan una copia de s mismos en el sitio original, y generan una copia nueva en el sitio a donde se transponen (recombinacin especfica duplicativa).

Fig. 1 Recombinacin General. recombinantes

Fig. 2 Aislamiento de

MECANISMOS DE TRANSFERENCIA GENTICA EN BACTERIAS A. TRANSFORMACIN La transformacin es la transferencia gentica que resulta de la incorporacin de DNA desnudo por una clula receptora desde una clula donadora. Ciertas bacterias (ej. Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Pneumococcus) son capaces de tomar DNA del medio ambiente y ese DNA que
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es introducido puede llegar a ser incorporado al cromosoma de la clula bacteriana receptora. Todo comenz con los trabajos de Griffith (1928) sobre el neumococo. Recurdense sus clsicos experimentos con las cepas S (lisas, capsuladas y virulentas) y R (rugosas, no capsuladas y avirulentas), inoculadas en ratones: cepas S vivas inoculadas en ratones, ratn muere cepas R vivas inoculadas en ratones, ratn vive cepas S muertas por calor, ratn vive cepas S muertas por calor + R vivas, ratn muere. La autopsia revela la presencia de neumococos vivos virulentos (tipo S).

Fig. 3 Experimentos de Griffith (1928) Ni Griffith ni los investigadores de la poca se dieron cuenta de la importancia de este resultado, ni sacaron la conclusin pertinente En 1944 el equipo formado por Avery, Mac Leod y Mc Carty descubri la naturaleza del misterioso principio transformante: el cido desoxirribonucleico
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(ADN). Ellos lograron desarrollar un sistema in vitro, en el que iban ensayando diversas fracciones (con diferentes componentes) procedentes de las clulas S virulentas frente a clulas R vivas. A pesar de los elegantes experimentos, la comunidad cientfica no los acept inmediatamente.

Fig. 4 Experimento de Avery, MacLeod y McCarthy (1944) 1. Factores que afectan la transformacin. a. Tamao del DNA Funciona mejor el DNA de doble cadena de al menos 5 X 105 daltones. Por tanto, la transformacin es sensible a las nucleasas del medio ambiente. b. Competencia de la clula receptora Algunas bacterias son capaces de incorporar DNA en forma natural. Sin embargo, estas bacterias solo toman al DNA en una etapa particular de su ciclo celular, cuando producen una protena especfica llamada factor de competencia. Cuando la bacteria se encuentra en este estadio se dice que es competente. Otras bacterias no son capaces de incorporar el DNA naturalmente, sin embargo en estas bacterias la competencia puede ser inducida in vitro mediante tratamiento con sustancias qumicas (ej. CaCl2). 1. Pasos de la transformacin. a. Incorporacin del DNA La incorporacin del DNA por las bacterias Gram+ y Gram- es diferente. En las bacterias Gram+ el DNA se introduce en forma de molculas de cadena sencilla y la cadena complementaria se sintetiza dentro de la clula receptora. En contraste, las bacterias Gramincorporan DNA de doble cadena. b. Recombinacin General/Legtima/Homloga Luego de que el DNA de la clula donadora se ha incorporado, ocurre un evento de recombinacin recproca entre el cromosoma y el DNA de la clula donadora. Esta recombinacin requiere que exista homologa entre el DNA del donador y

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el cromosoma receptor, lo que finalmente resulta en la substitucin de DNA entre la receptora y la donadora. Esta recombinacin requiere de los genes de la recombinacin bacteriana (recA, B y C) y de que exista homologa entre los DNAs involucrados. Este tipo de recombinacin se denomina recombinacin general, legtima u homloga. Debido al requerimiento de homologa entre las clulas donadora y husped, solo el DNA de una bacteria cercanamente relacionada se esperara que transformara exitosamente, aunque en raras ocasiones se ha demostrado que s ocurre transferencia gentica de este tipo entre bacterias relacionadas de forma ms bien distante. 2. Importancia La transformacin ocurre en la naturaleza de manera normal y es un mecanismo que puede conducir al incremento de la virulencia bacteriana. Por otra parte, la transformacin in vitro ha sido ampliamente utilizada en la tecnologa del DNA recombinante.

Fig. 5 Transformacin bacteriana

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B. TRANSDUCCIN La transduccin es la transferencia de informacin gentica desde un donador a un receptor y est mediada por un bacterifago ( fago). La cubierta del fago protege al DNA del medio ambiente, as es que la transduccin, a diferencia de la transformacin, no se ve afectada por las nucleasas en el medio ambiente. No todos los fagos pueden mediar la transduccin. En la mayora de los casos la transferencia gentica se realiza entre miembros de las mismas especies bacterianas. Sin embargo, si un fago en particular posee un amplio rango de huspedes que l es capaz de infectar, entonces la transferencia entre las especies puede ocurrir. La capacidad del fago para mediar la transduccin, est relacionada con el ciclo de vida del mismo.

Fig. 6 Ciclo del fago 1. Tipos de Transduccin a. Transduccin Generalizada - La transduccin generalizada es el mecanismo por el cual potencialmente cualquier gene bacteriano de la donadora puede ser transferido a la clula receptora. Los fagos que median la transduccin generalizada, normalmente cortan el DNA de la clula husped en pequeas piezas y empacan ambos DNAs al interior de la partcula fgica mediante un mecanismo llamado head full o llenado de las cabezas del fago. Ocasionalmente una de las piezas del DNA de la bacteria husped resulta empacada al azar dentro de una cubierta de fago. Por lo tanto cualquier gene de la bacteria donadora
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puede ser potencialmente transferido, pero solamente se transferir tanto DNA como pueda caber en una sola cpside. Cuando la clula receptora se infecta con un fago que contiene DNA de una donadora, el DNA de la donadora puede entrar a la receptora. Ya dentro de la clula receptora puede ocurrir el evento de la recombinacin generalizada, en el cual se substituye el DNA de la clula donadora por el de la receptora.

Fig. 7 El mecanismo de la transduccin generalizada b. Transduccin especializada La transduccin especializada es la transduccin en la cual solo ciertos genes del donador pueden ser transferidos al receptor. Diferentes fagos pueden transferir diferentes genes pero un fago individual solamente puede transferir unos pocos genes. La transduccin especializada est mediada por fagos lisognicos o fagos temperados y los genes que se llegan a transferir dependern del lugar donde el profago queda insertado en el cromosoma. El mecanismo de la transduccin especializada se ilustra en la Figura 4. Durante la escisin (separacin) del profago, un error llega a ocurrir ocasionalmente en el cual un poco del DNA del husped escinde (se separa del cromosoma) junto con el DNA del fago. Solo puede ser transferido el DNA del husped que est flanqueando cada lado del sitio donde el profago se ha insertado, (ej. transduccin especializada). Despus de la replicacin y la liberacin del fago y a travs de la infeccin de la clula receptora, puede ocurrir una lisogenizacin de la receptora
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dando como resultado la transferencia estable de los genes de la donadora. La receptora ahora tendr dos copias de los genes que le fueron transferidos. Tambin es posible que se lleve a cabo una recombinacin legtima entre los genes de la donadora y de la receptora. 2. Importancia La conversin lisognica (mediada por fago) ocurre en la naturaleza y es la fuente de donde proceden las cepas virulentas.

Figura 8. El mecanismo de la transduccin especializada. C. CONJUGACIN La conjugacin es la transferencia de DNA de una donadora a una receptora, mediante contacto fsico directo entre las clulas. En las bacterias existen dos tipos de clulas y son las donadoras (macho) y las receptoras (hembras) y la direccin de la transferencia gentica es en un solo sentido; as el DNA se transfiere desde la donadora hacia la receptora. EXPERIMENTOS DE LEDERBERG Y TATUM Joshua Lederberg y Edward Tatum (1946) mezclaron dos cepas doblemente auxotrofas, dotadas de distintos marcadores genticos:

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Cepa A (Met--, Bio--, Thr+, Leu+)

cepa B (Met+, Bio+, Thr--, Leu--)

Sembrar 2108 cls de A Sembar 108 cls de A + Sembrar 2108 cls de B 108 cls de B plaquear en medio mnimo e incubar varios das No crecimiento Colonias prototrofas a No crecimiento una frecuencia de 10-5 10-6, muy superior a la frecuencia esperada de doble reversin (10-14). Estos prototrofos deban haber surgido por recombinacin

Fig. 9 Qu proceso de transferencia gentica haba dado origen a los recombinantes? Se descart que fuera por transformacin: No haba recombinantes si se usaban extractos libres de una cepa y se mezclaban con clulas enteras de la otra cepa. Si en el experimento original se aada DNasa, no cambiaban los resultados. Se vio que se necesitaban contactos directos entre las clulas de las dos cepas, mediante el experimento del tubo en U de Davis: si en cada rama de la U se coloca una cepa distinta, y ambas estn separadas fsicamente (en la base de la U) por un filtro con poros de tamao inferior al del dimetro de las bacterias, no aparecan recombinantes.

1. Tipos de clulas acopladas (mating cells) en las bacterias a. Donadora La capacidad de una bacteria de ser el donador es consecuencia de la presencia en dicha clula de una pieza extra de DNA, llamada factor F, factor de fertilidad o factor sexual. El factor F es una pieza circular de DNA que es capaz replicar en forma autnoma en la clula; es un replicn independiente. Las piezas de DNA extracromosomal que pueden replicar autnomamente, reciben el nombre genrico de plsmidos. El factor F posee los genes necesarios tanto para su replicacin como para su habilidad de transferir DNA a la clula receptora. Una de las cosas que el factor F codifica es la capacidad de producir una estructura llamada pilus sexual (pilus F) sobre la superficie de la bacteria. Este pilus es importante en el proceso de conjugacin. El factor F no es el nico plsmido que puede mediar la conjugacin pero generalmente se toma como modelo.

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b. Receptora La capacidad de actuar como receptora es consecuencia de la carencia de esta clula del factor F.

Fig. 10 Fases de la conjugacin

2. Estados fisiolgicos del factor F a. (F+) Autnomo El factor F en este estado lleva solamente aquellos genes necesarios para su replicacin y para la transferencia de DNA. No hay genes cromosomales asociados con el factor F en las cepas F+. En los cruces del tipo F+ X F- el F- se convierte en F+ mientras que F+ permanece como F+. Por lo tanto, el factor F es infeccioso. Por otra parte, solamente se presenta un bajo nivel de transferencia de los genes cromosomales de la donadora. b. (Hfr) Integrado - En este estado el factor F se encuentra integrado en el cromosoma bacteriano, va un evento de recombinacin. En los cruces del tipo Hfr X F- el F- raramente se convierte en Hfr y la clula Hfr permanece como tal. En ste caso existe una alta frecuencia de

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transferencia de los genes cromosomales del donador, de ah que el nombre de la cepa sea hfr, del ingls high frequency of recombination.

Figura 11 Estados fisiolgicos del factor F

Fig. 12 Fases de la conjugacin

PLSMIDOS Definicin Los plsmidos son elementos genticos extra-cromosomales que pueden llevar a cabo una replicacin autnoma. Un episoma es un plsmido que adems es capaz de integrarse al cromosoma bacteriano.

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Clasificacin de los Plsmidos 1. Propiedades de Transferencia a. Plsmidos Conjugativos Los plsmidos conjugativos son aquellos que son los mediadores del proceso de la conjugacin. Estos plsmidos usualmente son grandes, tienen todos los genes necesarios para una replicacin autnoma y para la transferencia del DNA hacia una clula receptora (ej. genes para el pilus sexual). b. Plsmidos No-conjugativos Los plsmidos no-conjugativos son aquellos que no pueden mediar el proceso de la conjugacin. Estos son plsmidos usualmente ms pequeos que los plsmidos conjugativos y carecen de uno o ms de los genes necesarios para la transferencia del DNA. Un plsmido no-conjugativo puede transferirse por conjugacin si la clula tambin alberga a un plsmido conjugativo. 2. Efectos en el fenotipo a. Plsmido de Fertilidad (factor F) b. Plsmidos Bacteriocinognicos - Estos plsmidos poseen genes que codifican para substancias que matan a otras bacterias. Dichas substancias se llaman bacteriocinas o colicinas. c. Plsmidos de Resistencia (factores R) Estos plsmidos acarrean genes de resistencia a los antibiticos. El origen de los factores R no se conoce. Es probable que hayan evolucionado con otros propsitos y que el advenimiento de la era de los antibiticos haya proporcionado una ventaja selectiva para su amplia diseminacin. Los plsmidos R son plsmidos conjugativos en los cuales los genes para la replicacin y la transferencia se localizan en una parte del factor R y los genes de resistencia estn localizados en otra parte del mismo.

Figura 13 Estructura del Plsmido R CURSO: FISIOLOGIA Y GENETICA MICROBIANA MICROBIANA 12 PRIMERA UNIDAD: FISIOLOGIA

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RTF (Resistance Transfer Factor) acarrea los genes de transferencia. Determinante R acarrea los genes de resistencia. Los genes de resistencia frecuentemente forman parte de transposones. ENLACES http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/19transduccion.htm http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/17transforma.htm

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