Captulo 9 PRODUCCION DE PENICILINA

Introduccin Los antibiticos son por definicin molculas con actividad antimicrobiana, que incluyen una gran cantidad de compuestos pertenecientes a diferentes familias qumicas. Son metabolitos secundarios, producidos en la mayora de los casos despus de la fase de crecimiento. Los primeros procesos para la produccin de penicilina, que fue el primer antibitico conocido, implicaban el crecimiento de Penicillium notatum sobre la superficie de un medio lquido (Czapek-Dox-glucosa). El perodo de incubacin era usualmente de 6-12 das y posteriormente la penicilina se extraa con solventes previa separacin del micelio. La historia de las innovaciones en la produccin de penicilina comenz en 1945 con el descubrimiento de una nueva especie, P. chrysogenum, la cual permiti incrementar los rendimientos del producto y trabajar en cultivo sumergido empleando lactosa como fuente de carbono y energa, y agua de macerado de maz (corn-steep liquor) como fuente de nitrgeno. De esta poca es tambin el hallazgo de que precursores tales como el fenilacetato incrementan los rendimientos del antibitico, producindose en este caso predominantemente penicilina G en lugar de una mezcla de distintos tipos. En la Figura 23 se muestra un esquema de la biosntesis de penicilina. Las distintas penicilinas son producidas a partir de P. chrysogeizuin por adicin de una apropiada cadena carboxlica en cantidad adecuada en el medio de cultivo, pero solamente tienen valor teraputico la penicilina G y la V. Ambas tienen un espectro y actividad similar, pero la penicilina V es ms estable a pH cido, lo que permite su administracin por va oral. La produccin de penicilina como otros procesos biotecnolgicos est dominada por su aspecto competitivo entre los grandes laboratorios productores, que realizan permanentes esfuerzos de mejoramiento en cada rea del proceso: cepa, fermentacin y separacin. El proceso a grandes rasgos implica el cultivo de P. chrysogenum en reactores de volumen creciente hasta una escala de 500.000 1, separacin del micelio por filtracin y extraccin del antibitico del caldo, seguida por la cristalizacin o precipitacin cida del mismo. Cepas, medios de mantenimiento e inculos Normalmente la cepa de produccin es mantenida como esporos, liofilizados o en nitrgeno lquido. Otra alternativa es mantener el desarrollo vegetativo en N2 lquido o congelado a -70 C. Antes de comenzar un proceso a partir de un cultivo, el operador debe realizar una exhaustiva evaluacin que asegure el mantenimiento de las caractersticas de la cepa, lo cual implica determinar el grado de esporulacin, la productividad y caractersticas morfolgicas, lo que incluye ensayos en agitadores y en fermentadores de laboratorio. Muchos son los factores que se asocian en la sntesis de antibiticos, tales como esporulacin, velocidad de crecimiento y niveles de intermediarios, todos los 82

cuales son regulados de una manera compleja por muchos genes. Esto puede. ser el motivo por el cual las mutaciones con agentes fsicos (luz UV, rayos X) y qumicos, han tenido un gran xito en el mejoramiento de cepas. Entre 1950 y 1980 la concentracin de penicilina obtenida fue incrementada desde 1000 U ml -1 a cerca de 60.000 - U ml-1 (0.5 a 35 mg ml -1 ). Este mejoramiento fue posible no solamente por modificaciones en la cepa, sino tambin por la tecnologa del proceso, como la ingeniera de aireacin y sistema de mezclado en fermentadores, alimentacin continua de glucosa, empleo de electrodos de pH para el control del mismo, y utilizacin del sistema continuo. Las tcnicas genticas se han utilizado de dos formas para el mejoramiento del proceso. En primer lugar el empleo de mutantes bloqueados ha permitido el conocimiento de las rutas biosintticas y de apropiadas tnicas de seleccin. En segundo lugar, las tcnicas de fusin de protoplastos y procesos parasexuales fa= cilitaron la obtencin de recombinantes con rendimientos superiores a los de las cepas originales y con expresiones estables. Adems esto permiti la obtencin de organismos productores de nuevos antibiticos. El empleo de tcnicas de mejoramiento gentico posibilit entonces el aumento de rendimientos y la obtencin de nuevas cepas que no producen pigmentos, lo cual ha sido de gran importancia en las etapas de extraccin y purificacin. Otro aspecto importante en el mejoramiento de cepas se refiere a la morfologa celular. En este sentido, si bien es conocido que la morfologa de un hongo en 83

cultivo sumergido puede ser controlada por el nivel de inculo y por el medio, es posible influir sobre la misma por alteracin del genotipo. As se han seleccionado cepas de P. chrysogeytum, que dan menor viscosidad en los caldos, incrementando la transferencia de oxgeno. Las tcnicas de recombinacin tienen una cierta ventaja sobre las de mutacin y seleccin, porque en este caso se deben estudiar un menor nmero de mutantes. Las etapas de desarrollo del inculo se llevan a cabo a 25 C en erlenmeyers y fermentadores agitados. Los medios empleados en estas etapas incluyen "corn steep liquor" como fuente de nitrgeno, glucosa o sacarosa 2% (p/v), carbonato de calcio 0.5 - 1% (p/v) como "buffer" y sales inorgnicas. Cuando la fuente de carbono empleada en la escala de produccin es la lactosa, se la incluye a menudo en la etapa final con glucosa o sacarosa, de forma de inducir la B-galactosidasa y permitir as una rpida iniciacin del proceso en el fermentador de produccin. Requerimientos nutricionales y especficos Adems de glucosa y lactosa, Peiticillittm chrysogenum puede utilizar una gran variedad de fuentes de carbono y energa. Alternativamente se han usado sacarosa, almidn, dextrinas, melaza, aceites vegetales y animales, etanol y glicerol. Un medio de cultivo en sistema batch puede contener entre 30 y 40 g. 1 -1 de lactosa, en tanto que si se emplea un cultivo con alimentacin de fuente de carbono, se puede utilizar glucosa o melaza a una concentracin final de 100 g 1-1 . La principal fuente nitrogenada empleada hasta la dcada del 70 fue "cornsteep liquor" debido a que aumentaba los rendimientos del antibitico probablemente al suministrar compuestos como aminocidos, factores de crecimiento, precursores de la cadena lateral, adems de elementos trazas. Sin embargo, dada la variabilidad del producto entre distintas partidas, los problemas de suministro, y tambin debido a la introduccin de precursores especficos de la cadena lateral, las industrias buscaron reemplazarlo. Los productos alternativos son la harina de semilla de algodn, extractos y peptonas, y la harina de soja. Sin embargo en algunos casos estos productos son igualmente variables y tanto o ms caros. En 1976 se demostr la importancia de un suministro continuo de amonio (por alimentacin con (NH 4 )2 SO 4 ), que permitiese mantener niveles del mismo de aproximadamente 20 mM. Trabajando en cultivos alimentados y modificando la relacin nitrgeno/carbono en la alimentacin, se comprob que cuando el cultivo estaba limitado en nitrgeno cesaba la produccin de penicilina, la cual se restableca al ser la fuente de carbono la limitante. El requerimiento de grandes cantidades de NH 4 podra reflejar su necesidad para la sntesis de glutamato, el cual es requerido para producir valina y cistena. El azufre se incorpora como (NH 4) 2 SO4 y con la fuente de nitrgeno orgnica (extractos, peptona). El fsforo en forma inorgnica se adiciona como sales de fosfato y se aconseja mantener su concentracin entre 250 y 500 mg 1-1 con alimen tacin continua. Adems se debe tener en cuenta que el "corn-steep liquor" es una fuente importante de fsforo. Si se desea obtener un determinado tipo de penicilina, se debe incluir inicialmente, o bien por alimentacin en los medios, una cantidad relativamente grande de precursor. El requerimiento terico de fenilacetato sdico, es 0.47 g g-1 de penicilina G cida, y de fenoxiacetato de sodio, 0.50 g g-1 de penicilina V cida.
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Es aconsejable efectuar una alimentacin continua de estos componentes para evitar la toxicidad de los mismos sobre la cepa y la hidroxilacin por accin del organismo. Parmetros de produccin La cantidad de penicilina obtenida en un fermentador ( PV) es funcin de la concentracin de clulas (X), de la velocidad especfica de produccin de penicilina (q p ), del tiempo de fermentacin (t) y del volumen de medio de cultivo (V). (1)

donde P = concentracin de penicilina al tiempo t f Po = concentracin inicial de penicilina velocidad especfica de produccin de penicilina (unidades mg-1 h-1 ) t = tiempo de inoculacin

t f = tiempo de cosecha Vo = volumen inicial V = Volumen al tiempo t Evidentemente el objetivo es alcanzar altos valores de X y de q p . Desde 1950 la velocidad de produccin de las cepas (q p X) se ha incrementado 40 veces (desde 10 unidades ml -1 h-1 a 400 unidades ml -1 h-1 ). Entre los factores que afectan q p se tienen el pH, la temperatura, la aireacin y la velocidad especfica de crecimiento. El pH ptimo debe ser mantenido alrededor de 6.5, lo cual permite adems minimizar la hidrlisis de penicilina a cido peniciloico. Se debe tener en cuenta que el pH puede no ser constante debido a que el valor ptimo para crecimiento puede ser diferente del de formacin de producto. Los pocos estudios realizados con respecto a la temperatura indican que el valor ptimo para crecimiento es de aproximadamente 30 C, en tanto que el ptimo de produccin oscila entre 20 y 25 C. Para un proceso "betch" la temperatu ra puede variar entre 23 y 28 C, en tanto que para el "batch" alimentado esa variacin est entre 25 y 27 C. La aireacin presenta un problema especial en esta fermentacin, debido a que al incrementarse la biomasa, y por consiguiente la demanda de 0 2 , aumenta tambin la viscosidad del medio, lo cual crea una resistencia importante para la transferencia de oxgeno. Por lo tanto puede ocurrir que por encima de un cierto valor de X el suministro de oxgeno pueda ser insuficiente para mantener un q p mximo por un determinado tiempo. Para superar estos problemas se puede incrementar la potencia de agitacin, el caudal de aire, la presin dentro del reactor, cambiar las condiciones de cultivo o incluso trabajar con cepas modificadas 85

que no aumenten la viscosidad. Todo esto indica la necesidad de un adecuado manejo del proceso y del diseo del reactor. En un cultivo "batch" la velocidad especfica de produccin de penicilina alcanza valores altos al final del crecimiento exponencial, cayendo posteriormente como se muestra en la Figura 24.

Si la produccin se opera en sistema "batch" alimentado el objetivo es obtener tanta biomasa como sea posible (trmino X de la ecuacin 1) la cual debera producir penicilina a una alta velocidad especfica (qp en ecuacin 1) por el mayor tiempo posible. Se ha observado que el mximo valor de q p es de aproximada-1 mente 15 unidades por mg h-1 , el cual se alcanza al comienzo de la fermentacin y luego declina. Por otra parte los productores obtienen alrededor de 60.000 unidades ml -1 en 200 h de proceso, lo que significa una productividad media de 300 unidades ml -1 h -1 . Por lo tanto si la mxima biomasa alcanzada es de 50 mg ml -1 para un q p de 15 unidades mg-1 h-1 , la mxima productividad debera ser de 750 unidades ml-1 h-1 , lo que indica que el promedio obtenido es menos de la mitad del mximo. Lo expuesto indica la importancia de mantener un q p elevado. En este sentido se ha determinado cmo influye sobre este valor, la velocidad especfica de crecimiento. El valor de u para la fase de produccin, tiene un lmite superior, el cual si es superado, la biomasa requiere un exceso de oxgeno que lleva a una disminucin de qp , si existe una limitacin del mismo en el reactor. El lmite inferior de u para la produccin vara con la cepa utilizada. En sistemas de cultivo con alimentacin con glucosa, el valor de qp vara linealmente con u hasta una velocidad de alimentacin de glucosa cuyo valor oscila alrededor de 0,33 m moles de glucosa (g biomasa) -1 h-1 , el cual corresponde a un u de 0,015 h-1 . A mayores valores de velocidad de alimentacin u se incrementa linealmente pero qp permanece constante (Figura 25). El valor mnimo de u debajo del cual q p desciende linealmente con u se denomina u crtico (u c ). No se conocen con precisin las causas de esta disminucin. 86

El problema por lo tanto es determinar qu factores de la biomasa o del entorno limitan el valor de q p para tratar de superarlos. Si el oxgeno es el limitante del crecimiento, se demuestra una relacin lineal entre el valor de u y la velocidad especfica de consumo de oxgeno (qo2). De lo anteriormente expuesto se deduce que durante la fase de produccin o crecimiento lento en un sistema de produccin industrial "batch" alimentado (la glucosa es el sustrato limitante) se debern mantener valores adecuados de u y q02 para lograr un qp apropiado. Para la mayora de las fermentaciones industriales el u de produccin es menor de 0.01 h-1 . Se debe cuidar en esta fase no tener un exceso de glucosa debido a que el mismo puede ocasionar una inhibicin de la actividad o de la sntesis de enzimas involucradas en la biosntesis de penicilina. A pesar de que la limitacin de hexosa disponible es esencial para el xito del proceso, el valor de u puede ser controlado por otros nutrientes, habindose demostrado que la eleccin del nutriente limitante (oxgeno, fsforo, sulfato, amonio, magnesio) tiene un efecto marcado sobre el metabolismo energtico. La relacin entre q p y u podra indicar la necesidad de prolongar un estado fisiolgico particular de las clulas. Se ha comprobado por estudios en cultivo continuo que existe una correlacin entre la velocidad especfica de crecimiento y la morfologa celular, la cual corresponde a un estado fisiolgico determinado. Para un valor de p mayor de 0,023 h -1 se observa solamente crecimiento vegetativo, en tanto que debajo de 0,014 h -1 comienza a tener lugar la formacin de conidias. Debido a que bajas velocidades de crecimiento son de gran importancia en muchos procesos fermentativos, es una necesidad dilucidar para esos casos que funciones celulares tienen lugar. Luego, se podra estabilizar la funcin deseada, como produccin de penicilina, por perodos prolongados de tiempo. Un valor mnimo de u podra indicar tambin la necesidad de reemplazar clulas viejas o alteradas, las cuales han perdido irreversiblemente su capacidad de sntesis de penicilina. La duracin de la fermentacin de penicilina puede estar limitada por la capacidad de transferencia de oxgeno del reactor. Como ya se indic, en algn momento la concentracin celular puede exceder el suministro de oxgeno necesario para mantener un valor alto de qp y la sntesis disminuye. En algunos procesos la presencia de txicos, inhibidores o factores no conocidos pueden causar una disminucin en el valor de qp, sobre todo al final de la fase de produccin. Tecnologa del proceso La tecnologa de produccin de penicilina presenta a nivel comercial aspectos particulares que son mantenidos en reserva por los productores, a pesar de que existe abundante bibliografa en el tema. Un esquema del proceso se observa en la Figura 26. 87

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La produccin de penicilina G o V es llevada a cabo por fermentacin en medios lquidos, empleando reactores cuyo volumen oscila entre 40,000 y 500,000 1. Este proceso es aerbico y en general se emplea una relacin de 0,5 - 1,0 volme nes de aire (volumen de lquido) -1 min 1 . En una fermentacin de penicilina tpica, la mayora de la masa celular es obtenida durante las primeras 40 horas de fermentacin, a partir de un inculo de 10% (v/v) de un cultivo vegetativo de 20 g 1 -1 . Luego el crecimiento contina a un valor mnimo de p, el cual se debe regular si se quiere mantener un qp elevado. Durante la fermentacin se debe controlar si el suministro de oxgeno es el requerido para mantener el valor deseado de qp. Otro parmetro importante es la temperatura, y en este caso el diseo y operacin del reactor es importante por el calor generado por el crecimiento y la agitacin. Los agitadores utilizados son en general de tipo turbina. La potencia introducida al cultivo es del orden de 1 - 4 W 1 -1 . Durante el proceso se controla la temperatura, caudal de aire, velocidad de agitacin, pH y velocidad de agregado de nutrientes. La duracin de la etapa de produccin en el caso de operarse un sistema "batch" alimentado es del orden de las 200 h. Actualmente la extraccin con solventes es la base para la separacin y purificacin de la penicilina. El primer paso consiste en separar el micelio del medio de cultivo empleando un filtro rotatorio a vaco tipo cilndrico. El filtrado rico en penicilina es luego enfriado en un intercambiador de calor a 0 - 4 C con el objeto de disminuir la degradacin enzimtica y qumica durante las etapas de extraccin posteriores. Las penicilinas G y V son cidos fuertes (pKa entre 2.5 - 3.1). Las formas cidas son solubles en muchos solventes orgnicos y se pueden extraer con un alto rendimiento en acetato de amilo o de butilo a pH 2.5 - 3.0. La extraccin se puede realizar en operaciones continuas, a contracorriente en extractores centrfugos en etapas mltiples, a temperaturas de 0 - 3 C. Otra posibilidad es el empleo de mezcladores estticos o decantadores, los cuales tienen en menor costo de inversin. Se debe tener en cuenta que tanto la penicilina G como la V se degradan en medio cido con una cintica de primer orden a una velocidad proporcional a la temperatura y recproca con respecto al pH. Esto hace que la vida media en condiciones de eficiente extraccin en medio cido sea muy reducida. Sin embargo como la forma V en tales condiciones es ms estable que la G, si el objetivo es obtener 6-amino penicilnico (6-APA) la produccin de penicilina V es ms aconsejable. La extraccin de penicilina se puede realizar en una o ms etapas sucesivas, con una acidificacin del caldo filtrado con H2 SO 4 o H 3 PO 4 al 10% P/V y con el agregado de un agente surfactante (0,003 - 0,1% P/P, en el solvente), realizndose la extraccin y concentracin en extractores centrfugos. Dependiendo de las especificaciones de uso final, el solvente conteniendo penicilina se puede tratar con carbn para separar pigmentos y otras impurezas. Esta etapa actualmente no se realiza debido a las bajas impurezas de los caldos y a los altos rendimientos obtenidos. La cristalizacin se puede realizar desde la fase acuosa si se desea, siendo los valores crticos las concentraciones de sodio o potasio, la temperatura, la concentracin de penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalizacin a partir de un solvente se requiere tambin un exceso de Na + o K+ , siendo los cristales recuperados en un filtro rotatorio a vaco. Estos cristales son lavados y presecados con 89

un solvente voltil que tambin separa impurezas coloreadas. El secado definitivo se puede realizar con aire caliente, vaco o calor radiante. La penicilina cristalina G o V as obtenida puede ser empleada como tal o como intermediario que es convertido a 6-APA para obtener nuevas penicilinas semisintticas, cuidando en todos los casos que los productos debern tener un grado farmacutico. El cido 6-APA puede ser obtenido por va enzimtica (penicilin acilasa) o qumica; sin embargo todas estas etapas escapan al alcance de esta monografa, por lo tanto se remite al lector interesado a la bibliografa.

Economa del proceso Se atribuye un 80% del costo de produccin de penicilina al proceso de fermentacin y un 20% a las etapas posteriores de extraccin y purificacin. A su vez en el proceso fermentativo, un elevado porcentaje en los costos corresponde al medio de cultivo, en el cual la glucosa es el componente de mayor valor. El mximo rendimiento mencionado en esta fermentacin es aproximadamente 0.1 g de penicilina por gramo de azcar. El balance de materia para glucosa es el siguiente:

glucosa = consumida

consumo para biomasa +

consumo para energa de mantenimiento +

consumo para penicilina

Podemos entonces escribir la siguiente ecuacin:

donde Y'p/s es el rendimiento en producto que se obtendra cuando no hay crecimiento ni mantenimiento, y los dems trminos tienen el significado ya mencionado. Se ha estimado que de la cantidad total de glucosa consumida, el 20% se utiliza en la formacin d biomasa, el 10% para la produccin de penicilina, y el resto, o sea el 70% para mantenimiento. El valor de Y'p/s se puede estimar tericamente mediante el conocimiento de la ruta biosinttica que conduce al producto. En el caso de la penicilina el valor mximo terico posible ha sido calculado en 1.1 g de penicilina g-1 de glucosa Tomando en cuenta el elevado consumo de glucosa para mantenimiento es evidente que deben realizarse todava estudios fisiolgicos con el objeto de reducir ese porcentaje. En 1980 la produccin mundial de penicilina alcanz las 17,000 toneladas con un valor estimativo de 380 millones de dlares. Estos dos valores son mayores que los de cualquier otro antibitico y no son fijos sino que la produccin tiene una significativa velocidad de crecimiento anual. Esto se debe a su baja toxicidad y la posibilidad de modificar qumicamente la molcula, lo cual incrementa su utilidad. 90

A pesar de los avances logrados, muchos problemas fundamentales sobre el control de la fermentacin de penicilina permanecen todava sin resolver. Las futuras mejoras en la produccin deberan considerar: El aumento de qp max y la biomasa (X), la disminucin de uc, la inhibicin de la hidrlisis de la penicilina, la disminucin de la viscosidad de los caldos y del porcentaje de carbono destinado a mantenimiento, la obtencin de cepas con fenotipos y productividad estables, y finalmente el mejoramiento de los sistemas de operacin como el batch alimentado y el continuo.

Lecturas recomendadas: 1. Comprehensive Biotechnology. The practice of Biotechnology:

2.

3.

Current Commodity Products, Vol. 3. Ed. Harvey W, Blanch; Stephen Drew, Daniel C. Wang. Pergamon Press, 1985. Microbial Growth. Benchmark Papers in Microbiology. Ed, P.S.S. Dawxon. Dowden, Hutchinson-Ross, Inc. Pennsylvania, 1974. Microbial Technology. Microbial Processes. Second Edition/Volume I. Ed. H.J. Peppler and D. Perlman. Academic Press, N. Y., 1979.

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