BIORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS UTILIZANDO BACTERIAS ANTARTICAS SICROTOLERANTES

Ruberto, Lucas1; Vazquez, Susana1; Lo Balbo, Alfredo2; Mac Cormack, Walter3 FFyB, UBA. Junn 956 6 piso (C1113AAD) Buenos Aires, Argentina. lruberto@ffyb.uba.ar, svazquez@ffyb.uba.ar, lbalbo55@hotmail.com 2 IAA, Cerrito 1248 (C1010AAZ) Buenos Aires, Argentina. wmac@ffyb.uba.ar
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Palabras clave: biorremediacin, bacterias sicrotolerantes Keywords: bioremediation, psychrotolerant bacteria RESUMEN La biorremediacin es la herramienta ms adecuada para la recuperacin de suelos contaminados con hidrocarburos. En la Antrtida las condiciones climticas y las reglamentaciones internacionales exigen la utilizacin de cepas autctonas sicrotolerantes. En este trabajo se muestran ensayos a campo en donde se evalu la eficiencia de la bioestimulacin y la biomagnificacin sobre suelos antrticos contaminados en forma aguda y crnica con hidrocarburos. ABSTRACT Bioremediation is the best tool for the clean up of hydrocarbons contaminated soils. In Antarctica, climate conditions and regulations determine the use of indigenous psychrotolerant strains. In this work we show field assays evaluating the efficiency of biostimulation and bioaugmentation on Antarctic soils under acute and chronic hydrocarbon contamination. INTRODUCCIN El tratamiento de suelos contaminados con hidrocarburos es esencial para mantener la calidad del medio ambiente. Debido a limitaciones en los recursos, los procesos de limpieza son prohibitivos. Los costos elevados se exacerban en regiones de clima fro como la Antrtida, debido al difcil acceso para la maquinaria pesada y la falta de infraestructura (Reynols y col. 1997). Adems, el uso de los hidrocarburos, en las regiones de clima fro, para la generacin de electricidad, calor y movimiento de vehculos, resulta en infinidad de pequeos o medianos derrames. A esto se suma la necesidad de transporte de estos combustibles, con el riesgo potencial que esto implica. Esta situacin hace indispensable la aplicacin de tratamientos de bajo costo que sean logsticamente posibles. La biorremediacin es una herramienta efectiva para mejorar la degradacin de contaminantes

en suelo. La temperatura es un factor limitante de estos procesos, por lo que resulta adecuado el uso de bacterias sicrotolerantes (Whyte y col. 2001). Se ha propuesto a la biomagnificacin como la estrategia ms efectiva (Collerman 1997, Coulon y Delille 2003, Cuningham y Philp 2000); sin embargo, la optimizacin de factores fsicos y/o qumicos del suelo contaminado mejora la actividad degradadora de la microflora autctona, haciendo innecesaria la aplicacin de tcnicas de biomagnificacin (Ruberto y col. 2003). En Argentina, muchas reas de clima fro muestran contaminacin por hidrocarburos. Este problema incluye las inmediaciones de las bases Antrticas, donde las condiciones climticas y las regulaciones internacionales hacen indispensable el uso de microorganismos autctonos. Los objetivos de este trabajo son: analizar el efecto de la bioestimulacin y la biomagnificacin en la eficiencia de la biorremediacin de un suelo antrtico con historia de contaminacin; caracterizar las cepas y consorcios bacterianos utilizados y desarrollar un sistema de biorremediacin aisladas de la Antrtida. METODOLOGA Se realizaron ensayos en diferentes escalas: microcosmos (Duarte da Cunha y Ferreyra, 2000) de 0.25 kg en frascos, microcosmos de 3 kg en bandejas y parcelas de 50 kg de suelo, todos expuestos a las condiciones ambientales antrticas. Los suelos crnicamente contaminados se obtuvieron de las reas de manejo de combustible de las bases Jubany y Marambio . El suelo se tom de la capa superficial, hasta los 20 cm de profundidad. Los ensayos de contaminacin aguda se realizaron utilizando suelos de las mismas reas y contaminndolos con diferentes hidrocarburos puros o mezclas complejas segn el objetivo de cada ensayo. En los sistemas con biomagnificacin, se utilizaron como inculo, cepas y consorcios bacterianos sicrotolerantes aislados de suelos con historia de contaminacin con Gas Oil y/o JP1 provenientes de la bases antes nombradas. Se utilizaron las siguientes cepas: ADH (Rhodococcus sp.), DM1-41 (Stenotrophomonas maltophilia), MP2-4 (Stenotrophomonas sp.), M10dp (Pseudomonas sp.) y los consorcios bacterianos M10 y J13. Todas las cepas y consorcios tienen capacidad para utilizar distintos hidrocarburos (alifticos y aromticos) como nica fuente de carbono y energa (Bej y col. 2000; Mac Cormack, 1999, Margesin y Schinner 1997). Se evalu la desaparicin abitica de hidrocarburos, la respuesta de la microflora autctona a la presencia de los contaminantes (Aislabie y col. 2001), el efecto de la bioestimulacin con N y P y la biomagnificacin con cepas y consorcios de bacterias sicrotolerantes con capacidad degradadora de hidrocarburos conocida. Se realizaron recuentos en placa de de suelos contaminados con hidrocarburos, logstica y econmicamente viable, utilizando bacterias sicrotolerantes

microorganismos viables, concentracin de hidrocarburos totales por espectroscopa infrarroja (IR) y anlisis cualitativo y cuantitativo de hidrocarburos por cromatografa gaseosa y espectrometra de masa (MS-GC). RESULTADOS En todos los ensayos se observ que las condiciones climticas antrticas producen una importante eliminacin abitica de los contaminantes que oscil entre el 40% y el 60% de la carga inicial. Los ensayos en frascos mostraron que, cuando el suelo prstino fue sometido a una contaminacin aguda con gasoil existi una significativa respuesta de la microflora autctona (35% de remocin comparado con el control abitico). Sin embargo la presencia de un inculo externo produjo una significativa reduccin en la concentracin final de los contaminantes (81,1% de remocin). Ensayos en bandejas utilizando suelo contaminado con un hidrocarburo aromtico policclico (fenantreno) mostraron resultados similares. Cuando se analizaron suelos crnicamente contaminados en sistemas de bandejas, la flora autctona fue muy efectiva en la remocin de hidrocarburos al ser bioestimulada con N y P (81% de remocin en 45 das). El sistema inoculado con un consorcio bacteriano aislado del mismo suelo a biorremediar (M10) mostr una remocin del 86%, mientras que un consorcio aislado de un suelo distinto (J13) mostr una baja eficiencia, similar a la mostrada por la flora autctona sin bioestimular (62%). (Fig 1). En todos los casos, la eficiencia de un sistema para eliminar los hidrocarburos se correlacion con un incremento de la actividad biolgica, observada como mayores valores de recuento de bacterias aerobias totales y fundamentalmente de bacterias degradadoras de hidrocarburos las cuales llegaron a representar mas de un 90% de las cuentas totales. Los cambios cualitativos inferidos a partir de los anlisis de GC y MS pueden observarse en la (Fig. 2) donde se muestran los cromatogramas correspondientes a los sistemas abitico e inoculado con el consorcio M10. En los estudios con parcelas los cambios en la actividad biolgica mostraron un comportamiento similar a los ensayos en frascos y bandejas, sugiriendo que la metodologa desarrollada es aplicable a escala total sin perjuicio de la eficiencia del sistema. El seguimiento de las parcelas, actualmente en desarrollo, permitir comprobar la capacidad del sistema para sobrellevar las condiciones invernales antrticas y observar la capacidad para reanudar la actividad degradadora en el siguiente perodo estival. De estos resultados se ha podido inferir que en los eventos de contaminacin aguda, la aplicacin de procesos de biomagnificacin con microorganismos autctonos es la alternativa de eleccin para lograr una efectiva biodegradacin. Sin embargo, cuando el suelo presenta una historia de contaminacin previa, la bioestimulacin con adecuadas

cantidades de N y P es suficiente para una efectiva eliminacin de los contaminantes. Estas aseveraciones son vlidas tanto para hidrocarburos alifticos como para aromticos. Finalmente, este estudio muestra la factibilidad de aplicar en la Antrtida un sistema de biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos aprovechando la actividad de las bacterias autctonas sicrotolerantes. Considerando los resultados obtenidos y la factibilidad tanto logstica como econmica, puede considerarse a la biorremediacin como la estrategia ms adecuada para la eliminacin de suelos antrticos contaminados con hidrocarburos del petrleo. REFERENCIAS Aislabie, J., Fraser, R., Duncan, S. y Farrell, R.L., 2001. Effect of oil spills on microbial heterotrophs in Antarctic soils. Polar Biology, 24, 308-313. Bej, A.K., Saul, D. y Aislabie, J., 2000. Cold-tolerant alkane-degrading Rhodococcus species from Antarctica. Polar Biology, 23, 100-105. Reynolds, C., Bhunia, A P., y Koenen B., 1997. Soil Remediation Demonstration Project: Biodegradation of Heavy Fuel Oils. Special Report 97-20. US Army Corps of EngineersCold Regions Research &Engineering Laboratory Collerman, E., 1997. Uses of bacteria in bioremediation. In SHEENAN, D., ed. Bioremediation protocols. New Jersey: Humana Press, 3-22. Coulon, F., y Delille, D., 2003. Effects of biostimulation on growth of indigenous bacteria in sub-Antarctic soil contaminated with oil hydrocarbons. Oil & Gas Science and Technology, 58, 469-479. Cunningham, C. J. y Philp, J.C., 2000. Comparison of bioaugmentation and biostimulation in ex situ treatment of diesel contaminated soil. Land Contamination & Reclamation, 8, 261-269. Duarte Da Cunha, C. y Ferreyra Leite, S.G. 2000. Gasoline biodegradation in different soil microcosms. Brazilian Journal of Microbiology, 31, 45-49. Mac Cormack, W.P. 1999. Seleccin, caracterizacin y evaluacin del potencial biotecnolgico de bacterias sicrotrficas degradadoras de hidrocarburos. Ph.D thesis, University of Buenos Aires, 192 pp. Margesin, R. y Schinner, F., 1997. Efficiency of indigenous and inoculated cold-adapted soil microorganisms for biodegradation of diesel oil in Alpine soils. Applied and Environmental Microbiology, 63, 2660-2663. Ruberto, L., Vazquez, S.C. y Mac Cormack, W.P., 2003. Effectiveness of the natural bacterial flora, biostimulation and biodegradation on the bioremediation of a hydrocarbon contaminated Antarctic soil. International Biodeterioration &.Biodegradation, 52, 115-125. Whyte, L.G., Goalen, B., Hawari, J., Labbe, D., Greer, C.W. y Nahir, M., 2001. Bioremediation treatability assessment of hydrocarbon-contaminated soils from Eureka, Nunavut. Cold Regions Science and Technology, 32, 121-132.

Hidrocarburos Totales vs Tiempo

14000 12000 10000 8000 ppm AUTOCTONO + N 6000 4000 2000 0 0 10 20 DIAS 30 40 50 J13 + N CEPAS + N CONTROL ABIOTICO AUTOCTONO

Fig 1: concentracin de hidrocarburos a lo largo de un experimento de biorremediacin de suelos contaminados con Gas Oil en forma crnica

M10 + N

TI C: TF A1 . D

Abund anc e 9 0000 00

TIC: TFE1.D Abundance 1.05e+07 1e+07 9500000 9000000 8500000

8 5000 00

8 0000 00

7 5000 00

7 0000 00

6 5000 00

8000000
6 0000 00

7500000 7000000 6500000 6000000 5500000

5 5000 00

5 0000 00

4 5000 00

4 0000 00

5000000
3 5000 00

4500000 4000000 3500000 3000000 2500000

3 0000 00

2 5000 00

2 0000 00

150 00 00

2000000
100 00 00 50 00 00

1500000 1000000

Ti me >

0 5. 0 0 10 . 00 1 5. 0 0 20 . 0 0 25. 0 0 30 . 00

500000 Time--> 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

Fig 2: cromatogramas de los sistemas abitico (derecha) y biomagnificado con el consorcio M10 a los a los 45 das de iniciado el experimento