Desarrollo de mtodos de diagnstico para la

Piroplasmosis equina y su uso en animales de campo

Trabajo de tesis para optar al grado de
Doctor en Biologa Molecular y Biotecnologa de la
Universidad Nacional de General San Martn


Tesista: Gustavo Daniel Asenzo
Direccin: Mnica Ofelia Jacobsen de Florin Christensen
Co-Direccin: Silvina Wilkowsky

Instituto de Virologia, CICV y A, INTA Castelar

Junio de 2009

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1. Resumen
La Piroplasmosis equina es una enfermedad producida por dos protozoos Apicomplexa: Theileria
equi y Babesia caballi, transmitidos por garrapatas. En el equino invaden los eritrocitos provocando
anemia durante la fase aguda de la enfermedad. En nuestro pas, los datos de prevalencia encontrados
en la bibliografa son escasos y realizados con mtodos poco sensibles.
Argentina posee una industria hpica importante, exportando caballos para deportes a varios pases
de Europa. Al ser nuestro pas endmico para la piroplasmosis equina, los exportadores deben
entregar una certificacin de que los caballos estn libres de la enfermedad. En la actualidad esta
certificacin se realiza por medio de un cELISA individual para cada uno de estos parsitos.
En este trabajo de Tesis, se desarroll un ELISA indirecto para la deteccin de anticuerpos contra
cada uno de estos protozoos con valores de k lo suficientemente altos como para considerarlos tiles
para el empleo en estudios epidemiolgicos. Asimismo, estos ensayos tienen potencial para su futura
utilizacin para las certificaciones necesarias para la exportacin de equinos.
Por otro lado, se realizaron 4 sondeos preliminares de Theileria equi y 3 sondeos para B. caballi para
el diseo de futuros estudios epidemiolgicos.
Se utiliz un nuevo anticuerpo IgY de huevo anti-IgG equinas conjugado a peroxidasa, elaborado en
nuestro Instituto, con resultados positivos que permitirn su utilizacin en una futura validacin de
los mtodos desarrollados en esta Tesis.
Se comprob la presencia de B. bovis en equinos de nuestro pas, confirmando a estos animales
como reservorios de este parsito.
De igual manera, se encontraron equinos positivos a Babesia bigemina, siendo este el primer reporte
de la presencia de este parsito en caballos.

3


















Por Marta y Rodolfo

Con Eugenia

Para Camila y Matas


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INDICE
1. Resumen........2
Indice de secciones.......3
2. Introduccin.....6
2.1. Generalidades de la piroplasmosis equina....6
2.2. Antecedentes histricos6
2.3. Distribucin geogrfica.7
2.4. Importancia de la piroplasmosis equina en Argentina..8
2.5. Clasificacin filogentica..9
2.6. Transmisin.10
2.7. Ciclo de vida ..13
2.8. Patognesis .....16
2.9. Patologa.........18
2.10. Diagnstico.......18
2.11. Inmunidad ........21
2.12. Tratamiento.......22
2.13. Prevencin................23
2.14. Equinos como resevorios de Babesia bovis y Babesia bigemina.....24
2.15. Hiptesis de trabajo...25
2.16. Objetivos del trabajo.....25

3. Materiales y mtodos .27
3.1. Anlisis bioinformtico...27
3.1.1. Seleccin in silico de regiones de los genes ema-1 y ema-2
de Theleria equi y rap-1 de Babesia caballi para la produccin
de pptidos recombinantes....27
3.1.2. Bsqueda de genes de T. equi codificantes para posibles
nuevos antgenos de diagnstico......28
3.1.3. Diseo de cebadores.29
3.2. Obtencin de muestras....30
3.3. Extraccin de ADN.31
3.4. Produccin y purificacin de formas recombinantes de antgenos
para diagnstico........33
3.4.1. Amplificacin de los genes de inters por PCR........33
3.4.2. Clonado en vector de expresin y transformacin de clulas competentes......34
3.4.3. Preparacin de clulas competentes......35
3.4.4.. Seleccin de clones positivos.......36
3.4.5. Induccin de la expresin en los clones seleccionados.....37
3.4.6. Purificacin de plsmidos.....39
3.4.7. Purificacin de protenas recombinantes.......40
3.4.7.1. Cromatografa de afinidad, buffer no desnaturalizante.......41
3.4.7.2. Cromatografa de afinidad, buffer desnaturalizante...42
3.4.7.3. Electroelucin..........42
3.5. Anlisis de antigenicidad....43
3.6. Muestreo de los animales de campo...44
3.7. cELISA para el diagnstico de Theileria equi y Babesia caballi...49
3.8. Criterios para la puesta a punto de los ELISAs..50
3.9. Determinacin del punto de corte...........53

5

3.10. Anlisis de concordancia..53
3.11. Ensayo de PCR en Tiempo Real..54
3.12. Reverse Line Blot Hybridization, RLB55

4. Resultados ......59
4.1. Seleccin y produccin de antgenos..59
4.1.1. Seleccin in silico de regiones en los genes ema-1 y ema-2 de Theileria
equi y rap-1 de Babesia caballi para la produccin de pptidos recombinantes.............59
4.1.2. Bsqueda de nuevos candidatos de diagnstico para T. equi...............64
4.1.3. Produccin de formas recombinantes de los antgenos seleccionados.............70
4.1.3.1. Amplificacin por PCR de los genes de inters......70
4.1.3.2. Clonado y seleccin de clones recombinantes.73
4.1.3.3. Induccin de la expresin de las protenas recombinantes..75
4.1.3.4. Anlisis de las secuencias obtenidas...............79
4.1.4.5. Antigenicidad de los antgenos producidos.84
4.1.3.6. Purificacin de protenas recombinantes.86
4.2. ELISA indirecto (ELISAi) para T. equi..92
4.2.1. Puesta a punto de distintos parmetros del ELISAi......92
4.2.1.1. Titulacin de antgeno y suero.93
4.2.1.2. Tipo y concentracin de bloqueante...95
4.2.1.3. Concentracin de detergente....95
4.2.1.4. Temperatura de incubacin......96
4.2.1.5. Neutralizacin de los sueros....97
4.2.2. Determinacin del punto de corte.98
4.2.3. Anlisis de concordancia.....100
4.2.4. Diagnstico de Theileriosis equina en Buenos Aires, Entre Ros,
Formosa y Salta..101
4.3. ELISA indirecto para Babesia caballi..103
4.3.1. Puesta a punto del ELISAi..103
4.3.2. Determinacin del punto de corte...105
4.3.3. Anlisis de concordancia.105
4.3.4. Diagnstico de babesiosis equina en Buenos Aires, Entre Ros y Formosa...........106
4.4. Uso de un nuevo anticuerpo anti-equino conjugado a peroxidasa....106
4.5. Determinacin de co-infeccin de caballos con otros piroplsmidos...110
4.5.1. Real Time PCR....110
4.5.2. Reverse Line Blot Hybridization (RLB).....112
4.5.3. Anlisis de posibles reacciones serolgicas cruzadas.....112

5. Discusin y Conclusiones.115
6. Bibliografa125
7. Lista de abreviaturas....133
8. Agradecimientos...135

6

2. Introduccin

2.1. Generalidades de la Piroplasmosis equina
La Piroplasmosis Equina es una de las enfermedades infecciosas parasitarias de caballos
ms comunes en el mundo. Los agentes etiolgicos son dos protozoos intraeritrocticos,
Theileria equi y Babesia caballi. Ambos protozoos pueden infectar a un equino en el
mismo momento. El nombre Piroplasmosis se debe a que la forma de estos parsitos al
microscopio asemeja a la de una pera. La infeccin pasa por una etapa aguda y una
crnica (Phipps 1996, Ribeiro 1999, de Waal 2004). Tambin puede haber infeccin
neonatal y causar aborto en yeguas (Heerden 1996, de Waal 2004). Caballos, burros,
mulas y cebras son susceptibles a infecciones de Theileria equi y Babesia caballi,
aunque los casos clnicos se producen principalmente en los caballos (Schein 1988,
Heerden 1996, de Waal 2004). En general, las infecciones producidas por Babesia
caballi son clnicamente leves y menos comunes que las causadas por Theileria equi
(Phipps 1996, de Waal 2004).

2.2. Antecedentes histricos
Laveran en 1901, fue el primer cientfico en describir a un parsito equino dentro de un
eritrocito al examinar con microscopio, una gota gruesa de caballos de Sudfrica. A
este microorganismo lo llam Piroplasma equi.
En 1904, Koch identific una segunda especie de Piroplasma equi, ms grande que la
descubierta por Laveran (de Waal 2004). Ms tarde, Nuttall y Strickland demostraron
que ambos parsitos eran causantes de babesiosis equina. Ellos llamaron al mayor de los
parsitos Babesia caballi y al ms pequeo Nuttallia equi. Sin embargo, como el gnero
Nuttallia ya haba sido asignado a un molusco, se lo reclasific dentro del gnero
Babesia, nombre que llev por mucho tiempo (Schein 1988).
En 1962, durante una epidemia de estos parsitos en el sur de Florida (Estados Unidos),
se demostr que la garrapata tropical del caballo Dermacentor nitens poda transmitirlos
de un animal a otro (Holbrook 1969).

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Despus de mucha controversia en los ltimos aos, por caractersticas concernientes al
ciclo de vida y estudios filogenticos, se reclasific a Babesia equi dentro del gnero
Theileria (Mehlhorn 1998, de Waal 2004, Uilenberg 2006).
En nuestro pas, el primer informe de la presencia de piroplasmosis equina fue realizado
por Bachman en 1923. No se encuentran otros informes de la enfermedad hasta 1973 y
1974, en que Ibez confirma la presencia de T. equi y de B. caballi mediante
diagnstico parasitolgico (Aguirre 2004).

2.3. Distribucin geogrfica
Al igual que otros patgenos transmitidos por garrapatas, la distribucin de T. equi y B.
caballi coincide con la distribucin geogrfica de estas ltimas. Posteriormente a los
estudios mencionados en 2.2., se comprob que estos parsitos pueden ser transmitidos
por una gran cantidad de especies de garrapatas, por lo que la distribucin de la
piroplasmosis equina es muy grande, abarcando casi todas las regiones tropicales y
subtropicales del planeta (Donnellan 2003, de Waal 2004).
Sin embargo, Gummow ha informado la falta de correlacin entre la prevalencia de la
babesiosis equina y la distribucin de garrapatas en el sur de frica (Gummow 1996), lo
que podra estar indicando otros tipos de transmisin.
Se han reportado hallazgos de T. equi y B. caballi en Espaa (Camacho 2005), Portugal,
Francia, Blgica, Polonia, gran parte de la antigua URSS (Joyner 1981) e Italia (Schein
1988, de Waal 2004). Asimismo, se han encontrado en Asia (Donnelly 1980), donde
hubo estudios recientes en China (Xu 2003) y en Mongolia (Boldbaatar 2005); y en
Medio Oriente (Hailat 1997). Del mismo modo, se distribuyen ampliamente en frica
(Gummow 1996, Heerden 1996, de Waal 2004). Se ha informado su presencia en el
Caribe (Rampersad 2003), Amrica Central (Holbrook 1968, Carbrey 1971 ) y en todos
los pases de Amrica del Sur (Ribeiro 1999).
Se estima que slo el 10% de la poblacin caballar mundial habita en regiones que estn
libres de piroplasmosis. Esto comprende solo unos pocos pases declarados ser libres de
la enfermedad: Estados Unidos, Nueva Zelanda, Canad, Europa del Norte, el Reino
Unido, Irlanda y Japn (Donnelly 1980, Phipps 1996).

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En Argentina se encuentra publicado un trabajo referido a la presencia de la enfermedad
en la localidad de Cerrillos (Salta, Argentina) (Aguirre 2004). En este artculo se hace
referencia a varios estudios de prevalencia obtenidos con anterioridad, utilizando la
tcnica de inmunodifusin en gel de agar para el diagnstico (ver Tabla 1.1).




2.4. Importancia de la piroplasmosis equina en Argentina
Segn el Censo Nacional realizado por el INDEC en el ao 2002, se estim la poblacin
equina argentina en 1.517.143 animales
(www.indec.mecon.ar/agropecuario/cna_defini.asp, cuadro 19).
La industria hpica moviliza aproximadamente de 6,7 millones de dlares por ao en
concepto de exportaciones (INDEC 2002). La Argentina es el segundo exportador
mundial de carne de caballo, detrs de los Estados Unidos. En los aos 1999, 2000 y
2001 se exportaron por ao en el orden de 30.000 toneladas de carne, por un valor de 60
millones de dlares. (Mora y Araujo 2000).
Nuestro pas ocupa actualmente el sexto lugar en el mundo en la cra de Pura Sangre de
Carrera, existiendo 11.000 caballos de esta raza en entrenamiento en los hipdromos de
San Isidro, Palermo, La Plata e hipdromos del interior del pas (Mora y Araujo 2000).
Tabla 2.1: Porcentajes de prevalencia en distintas regiones de
Argentina reportados en Aguirre 2004.

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Por su parte el polo rene aproximadamente 20.000 caballos que participan en 240
torneos anuales. La exportacin de caballos de polo ha cobrado importancia en los
ltimos aos, habindose exportado aproximadamente 15.000 caballos de polo a
diversos pases en el ao 1999 y 2000, representando un ingreso de divisas del orden de
15 millones de dlares (Mora y Araujo 2000).
La importancia que ha tomado la piroplasmosis equina en nuestro pas, se ve reflejada
en el Programa de Control y Erradicacin de las Enfermedades Equinas (Resolucin N
617/2005) que promulg la Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos en
el ao 2005. Dentro del Reglamento de Control Sanitario, cuando se refiere a
Piroplasmosis, establece en el punto 7.11.1. que La Direccin Nacional de Sanidad
Animal implementar estudios serolgicos peridicos a fin de determinar la distribucin
y prevalencia regional de la enfermedad.
Los pases libres de Piroplasmosis ante la amenaza de brotes de la enfermedad dentro de
su territorio, ponen serias restricciones al movimiento internacional de caballos. Es por
eso que es un requisito obligatorio mostrar certificados de diagnstico de piroplasmosis
que avalen la ausencia de enfermedad de todo animal que se quiera trasladar al exterior
(de Waal 1992, Friedhoff 1996). Esto constituye un importante problema veterinario en
Argentina, debido principalmente al alto valor de los mtodos de diagnstico usados
para tal fin. Actualmente la Organizacin Internacional de Sanidad Animal (OIE)
recomienda el uso de los kits Babesia equi antibody test y Babesia caballi antibody
test (VMRD, Inc.), que consisten en dos ELISAs competitivos, que deben ser
importados desde USA (ver punto 2.10)

2.5. Clasificacin filogentica
Theileria equi y Babesia caballi pertenecen ambas al super reino Eucariota; grupo
Alveolata; phylum Apicomplexa, clase Aconoidasida, subclase Piroplasmasina, orden
Piroplasmida. Luego, se diferencian, siendo T. equi un miembro de la familia
Theileriidae, gnero Theileria (Allsopp 1994) y B. caballi, miembro de la familia
Babesiidae, gnero Babesia (de Waal 2004).
Babesia equi, como se conoci por muchos aos, ha sido reclasificada como Theileria
equi (Mehlhorn 1998). Dos importantes caractersticas del ciclo de vida, marcan la

10

diferencia entre estos dos protozoos y determinan la pertenencia de ambos parsitos a
sus respectivos gneros:
1. Theileria equi, como todos los miembros de ese gnero, tiene una etapa de
esquizogonia intralinfoctica en el mamfero hospedador antes de la etapa
intraeritroctica. Esto no ocurre en Babesia ssp. (Mehlhorn. 1998)
2. Babesia caballi, al igual que el resto de las Babesia ssp., en la garrapata forma
kinetos que invaden ovocitos. Por este motivo, tiene una transmisin transovrica;
caracterstica que no ocurre en Theileria ssp. (Phipps 1996, Mehlhorn 1998, Uilenberg
2006).
Adems, estudios filogenticos utilizando la secuencia de la subunidad pequea del
ribosoma (rARN) sugirieron un grupo parafiltico para T. equi (Brning 1996).

2.6. Transmisin
La transmisin de ambos protozoos se produce a travs de la picadura de una garrapata
infectada y la consiguiente inoculacin de fluidos salivales (Phipps 1996, Uilenberg
2006, Vial 2006). La garrapata slo es infectiva pocos das despus de la unin al
equino, debido a la maduracin que deben sufrir los esporozoitos dentro de la glndula
salival (Uilenberg 2006). Dependiendo de la garrapata, el perodo de incubacin vara
de 2 a 21 das (Mehlhorn 1998).
T. equi tiene solo transmisin transestadial. Es decir, cuando la larva se infecta la ninfa
es infectiva y cuando la ninfa se infecta, la garrapata adulta puede infectar (Phipps 1996,
Mehlhorn 1998, Uilenberg 2006). En B. caballi se ha visto que puede transmitirse
durante todos los estadios de Rhipicephalus evertsi evertsi y transovricamente en
Hyalomma truncatum (de Waal 2004)
Por otro lado, la infeccin puede ocurrir despus de la inoculacin de sangre infectada
en animales susceptibles. Por tal motivo, es comn la transmisin iatrognica, por el uso
de agujas o material quirrgico contaminado. Por otra parte, la transmisin mecnica
por insectos hematfagos an no ha sido demostrada (Donnellan 2003).
La infeccin de fetos equinos en el tero ha sido observada en ambos parsitos (Phipps
1996, de Waal 2004).

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Luego que un animal infectado con T. equi se recupera de la enfermedad, permanece
como portador asintomtico de por vida, lo que implica tener un permanente reservorio
del parsito para su transmisin. En estos casos solo puede diagnosticarse la infeccin
por medio de mtodos serolgicos (Schein 1988).
En general T. equi y B. caballi son transmitidas por garrapatas de la familia Ixodidae. T.
equi es transmitida por Ammblyoma cajennense, Dermacentor nitens, D. marginatus, D.
reticulatus, Hyalomma marginatum, H. uralense, H. anatolicum excavatum, H.
dromedari, Rhipicephalus bursa, R. sanguineus, R. evertsi, y R. (Boophilus) microplus
(Mehlhorn y Schein 1998). Por su parte, B. caballi es transmitida por garrapatas del
gnero Dermacentor, Hyalomma, y Rhipicephalus.
En particular, se ha comprobado que las garrapatas del gnero Dermacentor transmiten
B. caballi en Europa Central y Asia Central (Phipps 1996). Por su parte, Rhipicephalus
evertsi evertsi transmite tanto T. equi como B. caballi en frica (Heerden 1996, Phipps
1996). Tambin se ha informado que R. microplus transmite T. equi en Brasil
(Guimaraes 1998). R. bursa es vector de ambos protozoos tanto en el sur de Europa
como en Asia Menor (Phipps 1996). R. sanguineus se ha informado que transmite T.
equi y B. caballi, y R. turanicus a T. equi en el sur de frica (de Waal 2004). El gnero
Hyalomma transmite T. equi y B. caballi en el sur de Europa, Medio, Cercano y Lejano
Oriente y en frica del Norte (Phipps 1996). Hyalomma truncatum es responsable de la
transmisin transovrica de B. caballi en el sur de frica (Donnellan 2003, de Waal
2004).
En la Argentina no hay informacin de que tipo de garrapata es el principal vector de
estos parsitos, sin embargo entre las garrapatas que se acaban de mencionar, se tiene
conocimiento de su distribucin en nuestro pas para Rhipicephalus microplus, R.
sanguineus, Ammblyoma cajennense y Dermacentor nitens. La distribucin de estas
garrapatas se muestra en la Figura 1.1., junto con una foto de cada una de ellas.

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Las garrapatas, en su mayora necesitan un clima clido y hmedo para completar su
ciclo de vida. En las zonas tropicales, con lluvias regulares, alta humedad y clima
clido, se dan las condiciones ptimas para el desarrollo de varias generaciones de
garrapatas por ao, de modo que la plaga se hace sentir constantemente. En regiones
subtropicales, caracterizadas por temporadas de lluvias y sequas, la intensidad de la
plaga es fluctuante. Un aumento de infestaciones se presenta cada vez que, despus de
un perodo de condiciones climticas adversas, sobreviene una temporada calurosa y
hmeda. Es en ese momento que se produce una explosin con invasin masiva de
larvas y ninfas de garrapatas. En zonas de clima moderado, el desarrollo de las
diferentes fases se inhibe considerablemente en invierno. Sin embargo, se dan casos de
hipobiosis, (la interrupcin temporal del desarrollo de un parsito) de modo que el ciclo
evolutivo completo puede durar de uno a dos aos
(http://www.senasa.gov.ar/contenido.php?to=n&in=878&io=4547).
Desde la sancin de la ley de Polica sanitaria animal, se han desarrollado exitosas
campaas de erradicacin de R. microplus, logrando con ellas la erradicacin hasta el
lmite actual que cruza el centro de Corrientes, norte de Santa Fe y Crdoba y sur de
Santiago del Estero. Sin embargo, la situacin actual de lucha ha sufrido cambios
sustanciales con el virtual estancamiento en zonas indemnes de las provincias de
Corrientes, Entre Ros y Santa Fe. Un factor importante ha sido el incremento en la
Figura 2.1: Distribucin de Rhipicephalus microplus, R.
sanguineus, Ammblyoma cajennense y Dermacentor nitens
en nuestro pas y una foto de cada una de ellas.

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presentacin de resistencia a los plaguicidas y garrapaticidas que obliga a un cambio de
enfoque de campaa, junto a la incorporacin de nuevas opciones de control (SENASA
2009).
2.7. Ciclo de vida
Los Apicomplexa atraviesan al menos tres etapas reproductivas: gamogonia (formacin
y fusin de gametos en el interior del intestino de la garrapata.), esporogonia
(reproduccin asexual en las glndulas salivales de la garrapata) y merogonia
(reproduccin asexual en los eritrocitos del husped vertebrado) (Homer 2000). En el
caso de Theileria equi, adems, sufre una esquizogonia (reproduccin asexual en los
linfocitos del husped vertebrado)

Theileria equi:
En el equino: cuando una garrapata pica a un caballo, inocula la forma infectiva del
parsito, que es el esporozoito. Estos entran al sistema circulatorio e invaden linfocitos.
Dentro de ellos, el parsito se desarrolla primero en forma de macroesquizonte (forma
de reproduccin nuclear) y ms tarde de microesquizonte (tabicamiento de los ncleos).
Los esquizontes de T. equi pueden ser encontrados en ndulo linftico 14 das despus a
la picadura de la garrapata. Los microesquizontes contienen alrededor de 200
merozoitos, los cuales, despus de la ruptura del linfocito son liberados al torrente
sanguneo para poder invadir a los eritrocitos. (Schein 1988, Brning 1996, Uilenberg
2006). Dentro de los eritrocitos, los merozoitos se dividen por fusin binaria una o dos
veces dando lugar a dos o cuatro merozoitos (Schein 1988, Vial 2006). Una
caracterstica muy llamativa cuando ocurren dos divisiones simultneas, es que los
merozoitos resultantes forman una ttrada, unidos nicamente por su extremo apical. A
esta estructura se la conoce como Cruz de Malta, por su parecido a la insignia que
lleva ese nombre. Esta peculiaridad es usada como confirmacin de especie.


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Los merozoitos pueden invadir nuevos eritrocitos, manteniendo de esta forma un ciclo
replicativo dentro del husped (Schein 1981, Melhorn 1998). Alguno de estos
merozoitos al entrar en los eritrocitos toman una forma esfrica, asemejando una
estructura en forma de anillos similar a las que se ve en Plasmodium falciparum, por lo
que son considerados gamontes (Melhorn 1998)
La estructura de los macroesquizontes y microesquizontes es similar a las vistas en otras
especies de Theileria. Sin embargo la estructura de los merozoitos es muy variada,
pueden encontrarse desde pequeas con forma de esfera de coma que van de uno a
dos m, hasta formas ameboideas con tamao de dos a tres m.

En el vector: luego de que la garrapata toma sangre de un animal portador de T. equi,
los gamontes llegan al intestino. Permanecen ah durante 48 horas, luego sufren una
gametognesis, en las que se ve que los gamontes comienzan a crecer y multiplicar su
ncleo, formando estructuras en forma de flecha conocidas como Strahlenkrper o
cuerpos rayados. Estas estructuras luego se dividen y dan formacin a las
microgametas. Los gamontes que no sufren cambios, se considera que son las
macrogametas. Las microgametas se juntan con las macrogametas y forman los zigotos.
Esto ocurre entre el da cuatro y seis despus de la entrada del parsito en la garrapata.
Los zigotos maduran y se transforman en kinetos que egresan al hemocele (aparato
circulatorio de la garrapata). Llegan a las glndulas salivales, donde invaden las clulas
tipo III. Ac sufren una esporogonia, resultando en nuevos esporozoitos infectivos
(Melhorn 1998). Como se mencion antes, a diferencia de Babesia sp. , Theileria sp.
tiene transmisin transestadial y solo de una etapa a otra, luego pierde su poder
infectivo (Uilenberg 2006).

Babesia caballi:
Figura 2.2: Eritrocitos equinos infectados con merozoitos
de T. equi, formando una Cruz de Malta.

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En el equino: en el momento que la larva de la garrapata se alimenta de la sangre del
equino, los esporozoitos presentes en las glndulas salivales pasan al torrente sanguneo.
Por los cambios morfolgicos que se observan en esta etapa del ciclo cambian el
nombre a merozoitos. A diferencia de lo que ocurre con T. equi, los merozoitos
buscarn invadir nicamente eritrocitos (Schein 1988, Brning 1996, de Waal 2004). La
entrada se produce por endocitosis en varias etapas. Los parsitos del gnero Babesia
son los nicos miembros Apicomplexa que pierden la vacuola parasitfora dentro del
eritrocito. Aqu, el merozoito comienza a dividirse por fisin binaria, formando dos
clulas hijas. Es comn observar esta divisin en un extendido de sangre al microscopio
como se muestra en la Figura 2.1, en donde se puede apreciar la estructura piriforme de
dos merozoitos unidos en su extremo apical, formando un ngulo agudo (Schein 1988;
de Waal 2004). El merozoito haciendo protrusin sobre la membrana, lisa al eritrocito y
vuelve al torrente sanguneo para invadir nuevos glbulos rojos (Igarashi 1988).




En el vector: cuando una garrapata pica un animal portador, los glbulos rojos
infectados llegan al intestino, donde el parsito comienza a sufrir gametogenesis. Como
en el caso anterior, se visualizan en esta etapa los cuerpos rayados o Strahlenkrper,
que posiblemente corresponden a las gametas. Una vez que las gametas se han
fusionado formando zigotos, estos invaden las clulas basfilas del epitelio intestinal,
donde comienzan a dividirse. Esta divisin de los zigotos no ocurre en Theileria
(Uilenberg 2006). Toman entonces una forma de bastn llamado esporoquineto. Estos
esporoquinetos son liberados a la hemolinfa que los conduce a otras clulas de la
garrapata a las cuales infecta y en las cuales vuelve a dividirse para formar nuevos
esporoquinetos. Dentro de las clulas infectadas se encuentran los oocitos. Esto
significa que hay una transmisin transovrica de la garrapata hembra a su
Figura 2.3: Eritrocitos equinos infectados con
merozoitos de B. caballi.

16

descendencia. Esto tampoco sucede en T. equi. Iguales ciclos de divisin mencionados
ocurren en los estados de larva, ninfa y adulto de la garrapata. Un ltimo proceso de
divisin ocurre en las glndulas salivales, donde comienza un ciclo de mltiples
divisiones que dan lugar a la formacin de un esporoblastos multinucleados. Luego por
gemacin surgen los esporozoitos que llegarn a la madurez solo despus que la larva
comienza a alimentarse, y constituyen las formas infectivas. Es importante aclarar que
solo en el estado larval de la garrapata puede transmitirse Babesia, en estado de ninfa ya
pierde esta capacidad, a pesar de mantener la infeccin. (Friedhoff 1988).
Todos los Apicomplexa poseen en su regin apical un grupo de organelas, llamadas en
conjunto complejo apical, de ah la derivacin de su nombre. Las principales organelas
de este complejo son tres: roptrias, micronemas y grnulos densos. A diferencia del
resto de los Apicomplexa, ni T. equi , ni B. caballi poseen conoides en el extremo
apical. El contenido de las roptrias, micronemas y grnulos densos es exocitado durante
la invasin a la clula hospedadora, por lo cual se ha postulado que el complejo apical
tiene un rol fundamental en el proceso de invasin. Se han identificado algunas
protenas presentes en estas organelas, tales como la familia de protenas MIC en los
micronemas, la familia de protenas ROP y las protenas RAP en roptrias y la familia de
protenas GRA en los grnulos densos (de Sousa 2006).

2.8. Patognesis y signos clnicos
La actividad estacional de las garrapatas predispone a una mayor frecuencia de signos
clnicos durante los meses de verano (de Waal 2004). El perodo de incubacin (tiempo
transcurrido entre la infeccin y la aparicin de los sntomas de la enfermedad) de T.
equi es entre 23 y 33 das. El perodo de latencia (tiempo transcurrido entre la infeccin
con el parsito, hasta que se torna infectivo para otro hospedador) se cree que es entre
los 12 y 14 das posteriores a la infeccin, porque es cuando comienzan a encontrarse
merozoitos dentro de los eritrocitos. El perodo de incubacin de B. caballi va de 10 a
30 das (Phipps 1996, de Waal 2004).
La forma aguda de la enfermedad se caracteriza por fiebre, anorexia, depresin,
ictericia, anemia hemoltica, petequias hemorrgicas de las mucosas y aumento de la
frecuencia respiratoria (Schein 1988, de Waal 2004). La hemoglobinuria, a menudo se

17

describe como sntoma de la babesiosis en otras especies, sin embargo es menos
frecuente en equinos con piroplasmosis (Phipps 1996).
Durante la fase crnica los animales muestran una leve inapetencia, bajo rendimiento,
prdida de peso, esplenomegalia y ocasionalmente un color rosa plido en las mucosas
(de Waal 2004).
Theileria equi es altamente patgena en la etapa aguda de la infeccin y puede infectar
hasta el 80 % de eritrocitos (Mehlhorn 1998). La salida de este parsito de adentro de
los glbulos rojos provoca la ruptura de las clulas infectadas provocando cuadros
graves de anemia (de Waal 2004). En caballos gravemente afectados, la hemlisis puede
dar lugar a hemoglobinemia, nefrosis y uremia (de Waal 2004). Diversos grados de
trombocitopenia, hipofosfatemia, hipoferronemia e hiperbilirrubinemia estn
acompaados por los picos de parasitemia (de Waal 2004).
Babesia caballi, a diferencia de T. equi, suele causar muy bajas parasitemias, con menos
del 1 % de eritrocitos infectados (de Waal 2004). Las infecciones con Babesia caballi
suelen ser clnicamente inaparentes y rara vez conducen a una anemia grave. En
ocasiones, contribuye a la inapetencia crnica, bajo rendimiento, prdida de peso
corporal, color rosa plido de las mucosas, taquicardia leve y esplenomegalia (de Waal
2004). Este parsito, por otra parte, est relacionado con la acumulacin de eritrocitos
parasitados en capilares, lo que provoca la disfuncin del rgano afectado (de Waal
2004). Las infecciones por este parsito llevan en muy pocos casos a un estado de
hipotensin aguda que puede causar la muerte. Tambin se observa desarrollo de
laminitis, es decir la detencin de los movimientos peristlticos en el intestino.
Sin embargo, ambos parsitos causan frecuentemente infecciones subclnicas, que se
presentan con una disminucin en el volumen celular y de plaquetas (de Waal 2004).
La piroplasmosis neonatal en potros se caracteriza por debilidad en el momento del
nacimiento o la rpida aparicin de apata, as como el desarrollo de la anemia, ictericia
severa, malestar general, fiebre y petequias poco despus (de Waal 2004).
Signos nerviosos son rara vez vistos en la piroplasmosis equina, pero ataxia, temblor
generalizado y de leves a moderados espasmos tnico-clnicos se han informado para
potros infectados con T. equi. Otras complicaciones de la piroplasmosis equina son la
insuficiencia renal aguda y enteritis; prdida de fertilidad en sementales y aborto en
yeguas (de Waal 2004).

18

La tasa de mortalidad puede ser mayor al 20% en animales que nunca estuvieron
expuestos al parsito (de Waal 2004).
2.9. Patologa
La patologa clnica revela una disminucin en la concentracin de hemoglobina,
eritrocitos y plaquetas (de Waal 2004, Camacho 2005), as como neutropenia y
linfopenia en los casos agudos (de Waal 2004). Hay aumento en los niveles sricos de
bilirrubina, urea, aspartato aminotransferasa (AST), creatina quinasa (CK), -
glutamiltransferasa (GGT) y lactato deshidrogenasa (LDH), en particular en caballos
infectados con Theileria equi, indicando anemia hemoltica y degeneracin
centrolobular y necrosis de hepatocitos (Camacho 2005).
Lesiones post-mortem: luego de una infeccin aguda, es comn encontrar edemas
subcutneos en la parte inferior del cuerpo y las extremidades, exudados serosos en
todas las cavidades corporales, esplenomegalia (Schein 1988, Phipps 1996, de Waal
2004), as como hepato y renomegalia (Schein 1988, Phipps 1996). Se observa amplio
dao renal: degeneracin del epitelio tubular con la deposicin de hemoglobina en los
tbulos renales, necrosis celular centrolobular y la infiltracin de sinusoides.
Pronunciada ictericia de las membranas serosas y edema pulmonar son ms frecuentes
en infecciones de Babesia caballi que de Theileria equi, mientras que linfodenopata
general se ha observado en el segundo (Schein 1988, Phipps 1996).
Fetos abortados y potros neonatos presentan anemia e ictericia de moderada a severa,
petequias en vsceras, hidrotrax, congestin y edema de pulmn, espleno y
hepatomegalia (de Waal 2004).

2.10. Diagnstico
El diagnstico de la piroplasmosis equina puede hacerse mediante la combinacin de
signos clnicos, examen de frotis teidos al microscopio, pruebas serolgicas,
subinoculacin de sangre a un animal sano (Phipps 1996), o xenodiagnstico (de Waal
2004) y reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Rampersad 2003, Alhassan 2005,
Vial 2006)

19

La demostracin del parsito en frotis de sangre es a menudo muy difcil, por tal
motivo, la preparacin del portaobjeto en gota gruesa es una tcnica recomendada
para la deteccin de parsitos, sobre todo en casos de baja parasitemia (de Waal 2004).
La subinoculacin consiste en la transfusin de 500 ml de sangre de un animal infectado
a otro susceptible, preferiblemente esplenectomizado. Este animal es mantenido bajo
observacin de los signos clnicos de la enfermedad. El diagnstico es confirmado por
la presencia de parsitos en sus eritrocitos. Claramente es un mtodo muy caro y que
solo es empleado en ocasiones que se quiere confirmar la etiologa de la enfermedad.
Adicionalmente, en el xenodiagnstico, una garrapata libre del parsito se alimenta del
animal sospechado y posteriormente se analiza la presencia del protozoo en la garrapata.
El xito en la implementacin de cultivos in vitro de T. equi y B. caballi puede ser una
alternativa para complementar los mtodos arriba descritos, con el fin de confirmar la
presencia del parsito (de Waal 2004). Mediante estos mtodos se ha llevado a la
identificacin de T. equi y B. caballi en caballos microscpica y serolgicamente
negativos. Es un mtodo muy sensible, como para detectar parasitemias tan bajas como
10
-10
% (de Waal 2004).
Sin embargo, para anlisis de rutina, la OIE recomienda el uso de anlisis serolgicos
como mtodo de diagnstico.
La prueba de fijacin del complemento (CF) fue una tcnica ampliamente utilizada a
nivel mundial, y solo en pocas regiones es todava empleada debido a su bajo costo
(Brning 1996, de Waal 2004). Dado que la CF no puede identificar todos los animales
infectados, especialmente los que han sido tratados; y debido a reacciones inespecficas
del complemento producidas por algunos sueros, y a la incapacidad de IgG (T) (el
principal isotipo de inmunoglobulina equina) para fijar complemento (McGuire 1971),
el IFA y las pruebas de ELISA han sido aceptados para su utilizacin como pruebas
prescritas para el comercio internacional (Waal 2004).
La inmunofluorescencia indirecta (IFA) se ha aplicado con xito para el diagnstico
diferencial de infecciones con T. equi y B. caballi (Madden 1968). El reconocimiento de
una fuerte reaccin positiva es relativamente sencillo, sin embargo cualquier
diferenciacin entre dbil positiva y reacciones negativas requiere una considerable
experiencia en la interpretacin (de Waal 2004).

20

La produccin de antgenos recombinantes para el uso en pruebas de ELISA ha sido
descrita en varios casos. La protena recombinante EMA-1 (equi merozoite antigen-1)
se ha producido en Escherichia coli (Knowles 1992) y en clulas de insectos como
baculovirus (Xuan 2001).
Tambin ha sido producida en E. coli la protena de B. caballi RAP-1 (rhoptry
associated protein-1) (Kappmeyer 1999 y Ikadai 2002). Los antgenos recombinantes
producidos en E. coli o en baculovirus tienen la ventaja evidente de no tener que
infectar caballos para la produccin del test, y proporcionan una fuente de protenas
para diagnstico que puede ser normalizada y distribuida internacionalmente. Este
antgeno se ha utilizado en un ELISA indirecto (ELISAi) para B. caballi (Ikadai 2002) y
en un ELISA competitivo (cELISA) (Kappmeyer 1999). EMA-1 y un anticuerpo
monoclonal especfico (mAb) (Knowles 1992) se han utilizado en un cELISA para T.
equi (Knowles 1991). Este cELISA supera el problema de la pureza del antgeno, ya
que la especificidad de esta prueba slo depende del mAb utilizado. Un 94% de
correlacin fue observado entre el cELISA y la prueba de CF en la deteccin de
anticuerpos frente a T. equi. Los sueros que dieron resultados discrepantes fueron
evaluados por su capacidad de immunoprecipitar productos traducidos de mRNA de
merozoito de T. equi marcados in vitro con metionina-
35
S. Las muestras que fueron
cELISA-positivas y negativas por CF, claramente precipitaron las protenas de T. equi.
Sin embargo, la inmunoprecipitacin con muestras cELISA-negativas y CF-positivas no
fueron concluyentes. Los escasos datos analizados sugieren que el cELISA es especfico
para T. equi (Knowles 1991). Este cELISA para T. equi tambin se valid en
Marruecos e Israel, donde dieron una concordancia de 91% y 95,7% con la prueba de
IFA, respectivamente (Rhalem 2001 y Shkap 1998 respectivamente).
De manera similar se ha desarrollado un cELISA utilizando la protena recombinante de
B. caballi RAP-1 y un mAb especfico. Los resultados de 302 muestras de suero
diagnosticadas con este cELISA y con la prueba del CF mostraron un 73% de
concordancia. De las 72 muestras que fueron CF negativas y cELISA positivas, 48
(67%) mostraron ser positivas con IFA, mientras que cuatro de las cinco muestras que
fueron CF positivas y cELISA negativas fueron positivas en el IFA (Kappmeyer 1999).
La especificidad aparente de los cELISA para T. equi y B. caballi mostr ser de 99,2%
y 99,5%, respectivamente, cuando se analizaron sueros de 1.000 caballos provenientes
de zonas presumiblemente libres de piroplasmosis. Otros mil caballos de distintos

21

orgenes y con estado de infeccin desconocido fueron probados por el cELISA y la
prueba de CF con una aparente mayor sensibilidad de cELISA. Los resultados
mostraron un incremento del 1,1% (T. equi) y un 1,3% (B. caballi) para los animales
seropositivos detectados por cELISA comparado con los detectados por CF. Los
resultados positivos adicionales fueron confirmados por IFA. Ocho caballos infectados
experimentalmente (cuatro para T. equi, cuatro de B. caballi) fueron probados durante
90 das post-infeccin. Los dos cELISA detectaron la presencia de anticuerpos ms
tempranamente que CF. Ambas pruebas fueron altamente reproducibles entre pocillos,
entre placas y en distintos das, con una variacin global de 1,2% y 1,6% para el B.
equi y B. caballi, respectivamente (OIE ).
Tambin se han desarrollado sondas para la deteccin directa de ADN de Babesia spp.
tanto en sangre del animal infectado (Phipps 1996), como en la garrapata (Brning
1996). Parasitemias de T. equi equivalentes a menos del 0.0025% son detectables con
sondas de ADN (Posnett 1991).
Una multiplex PCR para la deteccin simultnea de T. equi y B. caballi, tambin se ha
desarrollado, pareciendo ser una herramienta muy prometedora para el diagnstico de
laboratorio de rutina de la piroplasmosis equina (Alhassan 2005).
Ms recientemente, ha aparecido una nueva tcnica para la amplificacin de ADN
llamada Loop-mediated isothermal amplification (LAMP amplificacin isotrmica
mediada por loop), que solo emplea cuatro primers y una ADN polimerasa a una
temperatura fija, sin la necesidad de un termociclador. Esta tcnica ha sido usada
exitosamente para el diagnstico de la piroplasmosis equina (Alhassan 2007).

2.11. Inmunidad
Los caballos pueden permanecer portadores por un mximo de cuatro aos despus de
una infeccin con B. caballi o probablemente de por vida despus de una infeccin con
T. equi (Phipps 1996, de Waal 2004). Como reservorios para la infeccin de garrapatas,
estos animales juegan un papel importante en la epidemiologa de la piroplasmosis
equina (de Waal 2004).
Se pueden detectar anticuerpos maternos en potros de hasta cinco (de Waal 2004) o seis
(Phipps 1996) meses de edad. Los potros son protegidos por inmunidad pasiva

22

transmitida en el calostro de la madre (de Waal 2004). Las picaduras de garrapatas
portadoras suelen producir enfermedades subclnicas slo durante este tiempo,
conduciendo a una inmunidad estable con constantes infecciones (Phipps et al. 1996).
En un estudio realizado en Brasil, encontraron anticuerpos en caballos de todas las
edades, aunque fueron menos frecuentes en potros de seis meses de edad o ms jvenes
(Ribeiro 1999).
No se ha informado inmunidad cruzada (Schein 1988, Donnellan 2003, de Waal 2004),
pero puede ocurrir la infeccin simultnea con ambas especies (Donnelly 1980).

2.12. Tratamiento
T. equi es generalmente ms resistente al tratamiento que B. caballi (Kuttler 1980 y
1988, Schein 1988, Lindsay 2001). Se encontr que diferentes frmacos como
derivados del quinuronio, derivados de acridina y azul tripn son eficaces en la
eliminacin de ambos parsitos (Kuttler 1988, Brning 1996, de Waal 2004). Por otra
parte, el tratamiento de infecciones por T. equi con clorhidrato de tetraciclina y
oxitetraciclina o parvacuona no fue tan efectivo (de Waal et al. 2004).
Otro nuevo enfoque en el tratamiento son las drogas que se dirigen a las vas
biosintticas de fosfolpidos (Vial 2006). Triclosn es un ter sinttico que ha mostrado
tener efecto inhibidor en el crecimiento de B. caballi y T. equi en un estudio in vitro. Su
papel se cree apunta a la biosntesis de cidos grasos de tipo II dentro de estos parsitos
(Vial 2006).
Diamidinas aromticas y compuestos relacionados, incluyendo aceturato de diminazeno,
amicarbalida y dipropionato de imidocarb han demostrado ser los ms eficientes
piroplasmicidas (Schein 1988, Brning 1996, de Waal 2004). Los tratamientos repetidos
pueden ser necesarios para el control de T. equi, ya que la mayora de estos compuestos
no pueden esterilizar la infeccin (Kumar 2003, Donnellan 2003, de Waal 2004). De
igual manera, el tratamiento nunca debera tratar de esterilizar la infeccin en reas
endmicas, a menos que los caballos vayan a ser trasladados a un rea libre de la
enfermedad (Kuttler 1988, Heerden 1996, de Waal 2004).
Aunque hay diferentes drogas piroplasmicidas, el dipropionato de imidocarb (1,3-bis(3-
(4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il)fenil )urea Dipropionato de 3, 3' bis-2-imidazolin-2-il-

23

carbanilida) es el frmaco ms utilizado (Vial 2006). El imidocarb es una diamidina
aromtica. Un estudio demostr que el imidocarb atraviesa la placenta equina y alcanza
altas concentraciones en el feto (Lewis 1999). Se recomienda que se administre por va
intramuscular o subcutnea, pero no por va intravenosa (Vial 2006). El modo exacto de
accin contra la piroplasmosis an no se puede entender claramente (Kuttler 1988,
Brning 1996, Vial 2006). Se cree que causa el parcial desenrollamiento y
desnaturalizacin de la doble hlice de ADN del parsito. El imidocarb tambin inhibe
la entrada de inositol en los eritrocitos parasitados y, por lo tanto, conduce a la
"inanicin" del parsito (Vial 2006). La dosis teraputica del dipropionato de imidocarb
es entre 2 a 4 mg / kg de peso corporal, con una repeticin a las 24 horas (Phipps 1996).

2.13. Prevencin
Aunque se realiz una vacunacin exitosa de burros contra T. equi en un estudio
reciente (Kumar 2002), no hay vacunas para la piroplasmosis equina disponibles
comercialmente (Brning 1996, de Waal 2004). Por lo tanto, el control de la
enfermedad en zonas endmicas se realiza mediante la exposicin a las garrapatas
infectadas. Como se hizo referencia en el captulo sobre inmunidad, en el caso de los
potros menores a seis meses que tienen inmunidad pasiva, sufren la enfermedad de
manera subclnica, convirtindose en portadores crnicos. En los animales adultos, esto
se logra mediante el tratamiento preventivo con algn babesicida antes de la infeccin
natural (Kuttler 1987). Para mantener esta inmunidad natural en un animal, debe existir
una elevada tasa de transmisin (tasa de inoculacin) del parsito entre el vector y el
hospedador de manera de mantener el sistema inmune activo frente al patgeno.
Regular la aplicacin de acaricidas es la estrategia de control ms comnmente
empleada en pases desarrollados. Pero a largo plazo, el uso de esta metodologa resulta
en el desarrollo de resistencia por parte de las garrapatas. Adems de ser un mtodo
costoso, el tratamiento de acaricidas tiene como desventaja la contaminacin del medio
ambiente. Ms recientemente, nuevas estrategias biolgicas han sido empleados para el
control de garrapatas en el ganado y prometen ser de gran utilidad. Estas estrategias se
basan en inmunizar a los animales con protenas de una garrapata que despierten una
respuesta inmune, que causa el deterioro de las garrapatas que se alimentan de estos

24

animales. Una de estas vacunas empleadas con gran xito es la protena Bm86 de
Rhipicephalus microplus (de la Fuente 2000).
Existe una evidente necesidad de contar con medidas de control ms fiable para T. equi
y B. caballi, especialmente para abordar la restriccin de la circulacin de caballos
seropositivos en los pases que prohben su importacin. Muchos trabajos estn
actualmente en curso para desarrollar vacunas eficaces contra varias especies de
Theileria y Babesia spp., explotando la interaccin husped-patgeno. Algunas
protenas de superficie, por ejemplo, estn siendo investigadas ampliamente para el
desarrollo de vacunas protectoras (Knowles 1992 y 1994, Hotzel 1997, Suarez 1998 y
2000, Ikadai 1999, Kumar 2002, Mosqueda 2002, Wilkowsky 2003). Sin embargo, en
nuestro pas es importante como primera medida contar con una herramienta de
diagnstico econmica y de fcil estandarizacin, con la que se puedan realizar unos
primeros estudios epidemiolgicos, como punto de partida para una campaa de
erradicacin de la enfermedad.

2.14. Equinos como reservorios de Babesia bovis y Babesia bigemina
La babesiosis bovina, tambin conocida como piroplasmosis, y/o fiebre de Texas, afecta
al ganado de vastas regiones tropicales y subtropicales del mundo, y posee diversos
agentes etiolgicos tales como Babesia bovis, B. bigemina, B. major, B. divergens, B.
jakimovi, B. ovata y B. occultans. Al igual que B. caballi, stos son parsitos
intraeritrocticos obligados, tambin llamados hemoparsitos, por albergarse en los
glbulos rojos, donde se reproducen asexualmente. La fase sexual de su ciclo de vida se
produce dentro de la garrapata transmisora de la enfermedad. En nuestro pas, esta
enfermedad es causada por B. bovis y B. bigemina, que son transmitidos por la garrapata
Rhipicephalus microplus . Las regiones afectadas incluyen el NOA y el NEA, teniendo
como lmite sur el paralelo 31 sur.
Se ha estimado que los problemas causados a la ganadera de nuestro pas por las
garrapatas de los bovinos y los patgenos que transmiten producen perdidas econmicas
del orden de los 100 millones de dlares al ao. Para un control eficiente de las
garrapatas as como de B. bovis y B. bigemina, es importante conocer otros posibles
reservorios de estos parsitos. Entre la poca informacin disponible, se ha reportado un
caso de babesiosis en ciervos de los pantanos en la provincia de Corrientes (Alcaraz

25

2004). Por otra parte, trabajos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que el
bfalo de agua (Bubalus bubalis) es positivo para B. bovis por nested PCR y por
cELISA (Dominguez 2004; Ferreri 2008); aunque no se ha demostrado que el parsito
pueda cumplir su ciclo de vida completo en bfalos como nico hospedador.
Estos resultados son consistentes con la observacin in vitro, que merozoitos de B. bovis
pueden invadir glbulos rojos humanos, ovinos, equinos, porcinos, caprinos (Gaffar
2003) y crvidos (Holman 1993). Con respecto a los equinos, se ha reportado en la
provincia espaola de Madrid el hallazgo de dos caballos positivos por PCR a B. bovis.
Siendo este el primer caso declarado de B. bovis en equinos (Criado-Fornelio 2006). Sin
embargo, no hay informacin que los equinos sean reservorios de estos parsitos en
nuestro pas.

2.15. Hiptesis de trabajo
1. Un test de ELISA indirecto para Theileria equi o para Babesia caballi puede
resultar una herramienta tan til como un ELISA competitivo para detectar
anticuerpos especficos contra estos parsitos.
2. Un test serolgico desarrollado en nuestro pas tiene un costo significativamente
menor que un test importado, lo cual lo hace adecuado para estudios
epidemiolgicos, a la vez de constituir un producto biotecnolgico de alto valor
agregado y potencial transferencia al sector privado.
3. Las provincias de Buenos Aires y Entre Ros son regiones libres de Theileria
equi y B. caballi.
4. Los caballos de Argentina podran estar infectados con piroplsmidos bovinos
transmitidos por garrapatas que parasitan tanto a bovinos como equinos.

2.16. Objetivos del trabajo
Objetivo general
El objetivo general de esta Tesis es desarrollar mtodos de diagnostico serolgico para
la piroplasmosis equina utilizando herramientas de ingeniera gentica. Asimismo, esta
Tesis se propone comparar los mtodos desarrollados con otros actualmente validados y

26

aceptados internacionalmente, y usarlos para una evaluacin preliminar de la situacin
epidemiolgica de la piroplasmosis equina en varias regiones de nuestro pas.
Finalmente, otro objetivo de la Tesis es investigar si los caballos de regiones endmicas
para garrapatas de Argentina son portadores de otros piroplsmidos, y en caso positivo,
analizar la interferencia que esto puede traer en las pruebas serolgicos para
piroplasmosis equina.
Objetivos particulares:
- Utilizar herramientas bioinformticas para analizar las secuencias de los
candidatos de diagnstico ya conocidos EMA-1 y EMA-2 de T. equi y RAP-1 de
B. caballi de manera de optimizar la produccin de formas recombinantes.
- Identificar nuevos posibles candidatos diagnsticos para T. equi por bsqueda
en su genoma de genes con similitud a otros descriptos para otras Theilerias
spp., y producir formas recombinantes de los antgenos seleccionados.
- Desarrollar un ELISA indirecto basado en uno de los antgenos de T. equi
estudiados, que haya mostrado mayor inmunogenicidad.
- Desarrollar un ELISA indirecto para B. caballi basado en una forma
recombinante de RAP-1.
- Comparar la sensibilidad, especificidad y eficiencia de los tests desarrollados
con ELISAs competitivos aprobados por la OIE.
- Evaluar la situacin epidemiolgica de la piroplasmosis equina para T. equi y B.
caballi en algunas regiones de nuestro pas utilizando estas nuevas
metodologas.
- Analizar la factibilidad de desarrollar un test dual para la piroplasmosis equina,
que detecte anticuerpos contra T. equi, contra B. caballi, o contra ambos, en un
mismo ensayo.
- Investigar la utilidad en estos desarrollos de un conjugado de fabricacin
nacional, producido en yema de huevo.
- Estudiar la presencia de ADN de B. bovis y/o B. bigemina en sangre de equinos
de una regin de Argentina endmica para garrapatas, por Real Time PCR y
RLB.

27

- Investigar mediante inmunoblots posibles interferencias que la presencia de
anticuerpos contra otros piroplsmidos podran traer en los tests para
piroplasmosis equina.

28

3. Materiales y mtodos

3.1. Anlisis bioinformtico
3.1.1. Seleccin in silico de regiones de los genes ema-1 y ema-2 de
Theileria equi y rap-1 de Babesia caballi para la produccin de pptidos
recombinantes
Se recolectaron todas las secuencias conocidas de aminocidos de ema-1 y ema-2 de T.
equi y rap-1 de B. caballi depositadas en el GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) hasta abril de 2004. Las secuencias fueron
comparadas para analizar el polimorfismo entre aislamientos. Para ello se realiz un
alineamiento con los programas ClustalW2 de acceso libre en el sitio del European
Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) y Boxshade 3.21 de
acceso libre en Embnet, Swiss Institute of Bioinformatics
(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html). Debido a que las regiones
hidrofbicas de las protenas son la principal causa de la formacin de cuerpos de
inclusin en bacterias transformadas y que estos cuerpos dificultan la purificacin de las
mismas (Villaverde 2003), se decidi buscar regiones en las secuencias aminoacdicas
que no incluyeran zonas hidrofbicas, para que al producir formas recombinantes,
aumentara la cantidad de protena en forma soluble. En primer trmino se analiz la
presencia de secuencias seal en cada una de las protenas por medio del programa
SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/), ya que la prediccin de esta regin permitira
descartar ese segmento de la protena a expresar. Este programa utiliza redes neuronales
para su ejecucin. La salida grfica de SignalP muestra tres curvas que representan los
distintos valores de C, S e Y para cada uno de los aminocidos de la secuencia. El valor
C indica la probabilidad que ocurra un corte en determinado aminocido. El valor S
indica la probabilidad de que un determinado aminocido se encuentre en el sitio que
ocupa. El valor Y es la combinacin de la derivada de la puntuacin S y el valor C.
Un valor extra que arroja el programa es el valor D, el cual es un promedio entre la
media de S y el mximo valor de Y. Este valor se utiliza como criterio de
discriminacin de protenas solubles de exportacin.
Para la prediccin de regiones hidrofbicas se utilizaron tres enfoques: uno de ellos fue
el del programa bioinformtico ProtScale de Hidrofobicidad, el cual se basa en los

29

ndices de hidrofobicidad de Kyle & Doolittle
(http://www.expasy.org/tools/protscale.html). Este ndice proporciona valores
numricos a cada aminocido en base a los niveles de solubilidad de cada uno en
diferentes solventes polares y no polares. Otro enfoque fue el del programa TMpred
(http://www.ch.embnet.org/pages/services.html) para la prediccin de regiones
transmembrana. Las regiones transmembrana son predominantemente hidrofbicas, ya
que de lo contrario no podran permanecer ancladas en la membrana citoplasmtica. Se
decidi utilizar este programa, porque si bien no deja de ser predictivo, tiene la ventaja
sobre los anteriores, de emplear una base de datos de secuencias ya conocidas y por
consiguiente tiene, en nuestro parecer un valor experimental en el resultado.

3.1.2. Bsqueda de genes de T. equi codificantes para posibles nuevos
antgenos de diagnstico
Para la bsqueda de nuevos candidatos de diagnstico para T. equi se realiz una
recopilacin bibliogrfica en la base de datos MEDLINE, perteneciente a la Biblioteca
Nacional de Medicina de Estados Unidos, a travs de PUBMED
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/). Se anotaron las secuencias de aminocidos de
aquellos antgenos de diagnstico de los que ya se dispusiera informacin experimental
de que fueran antignicos y que se encontraran en protozoos evolutivamente cercanos.
Estas secuencias fueron analizadas a travs del algoritmo tblasn (bsqueda en una base
de datos de nucletidos traducidos, a partir de la secuencia de aminocidos de los
antgenos) en el genoma de T. equi. Por no encontrarse an liberada la informacin del
genoma mencionado, este anlisis fue realizado por el Dr. Carlos Suarez, de la Unidad
de Investigaciones en Enfermedades Animales (USDA) en Pullman WA, USA.
Se identificaron de esta manera tres genes en el genoma de T. equi a los que se
denomin tesp, te2 y te8 por su similitud con los genes de Theileria annulata y T. parva
tasp (Theileria annulata surface protein,), tp2 y tp8 (Theileria parva 2 y 8),
respectivamente. Sus nmeros de acceso en el Gen Bank son: AJ345067 (lnea celular
TaA1272), XP765583 (cepa Muguga) y XP764709 (cepa Muguga), respectivamente.
Para la localizacin del gen dentro de las secuencias nucleotdicas remitidas a nuestro
laboratorio, primero se buscaron los seis marcos de lectura posibles en cada secuencia y
se los tradujo.

30

Con las secuencias de aminocidos obtenidas se hizo un estudio de ortologa, haciendo
un anlisis de la mejor secuencia reciproca con el programa BLAST (reciprocal best-hit
analyses) (Fuchsman 2006).
Luego se realiz un alineamiento con las secuencias ortlogas, utilizando ClustalW.
Posteriormente se utiliz Boxshade para pasar el resultado a un formato de texto ms
accesible. Para corroborar los lmites exactos de los genes en estas secuencias se utiliz
el programa FGENESH 2.6 (http://www.softberry.com/berry.phtml).
Solo en el caso del segmento que finalmente se expres de la protena TESP se examin
la presencia de exones con el programa FEX del sitio SoftBerry
(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fex&group=programs&subgroup=gfind)
En el caso de la protena TE8 y del segmento TESP, se analiz la presencia de epitopes
B putativos utilizando el programa Bepipred Linear Epitope Prediction
(http://tools.immuneepitope.org/main/jsp/menu.jsp) con el fin de justificar la
produccin de sus protenas recombinantes. Este programa se basa en el algoritmo de
Kolaskar y Tongaonkar. Es un mtodo semiemprico que hace uso de las propiedades
fisicoqumicas de los residuos de aminocidos y sus frecuencias en las secuencias de
epitopes experimentalmente conocidas. Este mtodo puede predecir determinantes
antignicos con un 75% de precisin.

3.1.3. Diseo de cebadores
Para el diseo de los cebadores se utiliz el programa PrimerQuest
(http://www.idtdna.com/SCITOOLS/Applications/PrimerQuest/Default.aspx ) usando
como parmetros de esta bsqueda la longitud y ubicacin del fragmento que se deseaba
amplificar en cada caso, as como una longitud aproximada de 25 nucletidos, una
concentracin de guanina + citosina del 50% y una temperatura mxima de
hibridizacin de 65 C. Los resultados emitidos por el programa se analizaron con el
programa OligoAnalyzer 3.0
(http://www.idtADN.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/), para la bsqueda de
auto- y hetero-dmeros que pudiesen formar los cebadores en cuestin. Tambin se
analiz la especificidad de cada uno, por medio de un anlisis BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) en el sitio http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Asimismo, se
comprob que los cebadores correspondieran a regiones conservadas entre
aislamientos, segn el anlisis descripto en el punto 3.1.1.

31

Las secuencias de los cebadores, as como la temperatura de hibridizacin (T.H.)
especfica para cada par de cebadores y la longitud del fragmento que amplifican est
descripto en la Tabla 3.1.
Gen Cebador Secuencia Tm
Temp. de
anillado
Long.
amplif.
ema-1
ema-1 F (5-GAGGAGGAGAAACCCAAGGC-3) 58 C
58 C 687 pb
ema-1 R (5-TACAACCTTGTAGTCAGCTGGG-3) 57 C
ema-2
ema-2 F (5-AAGGTTGTCTATACCGCCCA-3) 56 C
57 C 615 pb
ema-2 R (5-GGAGAATCCATCGTATTGGGTCTTG-3) 57 C
rap-1
rap-1 F (5-GTTTGCCACAACAGCCGTGTTTC-3) 59 C
61 C 1176 pb
rap-1 R (5- CTCGGCCCCCGTTGAC -3) 59 C
tesp
tesp F (5-CCGTGCATAAAAAATATGAGAGAGCAATTCC-3) 57 C
58 C 273 pb
tesp R (5-GTGACATTCCGTGTGTGCATATTCAATATC-3) 58 C
te2
te2 F (5-GCCTGCGATGGAAAATGTGG-3) 57 C
59 C 441 pb
te2 R (5-CTCGGGACCCTTTGGAGTCT-3) 59 C
te8
te8 F (5-GAAATTGAAGTGGTTAAGCATGATC -3) 54 C
54 C 1224 pb
te8 R (5-CATGGCAAACGAAGCTACG -3) 53 C


Los cebadores delanteros (Forward, F) fueron diseados de forma de mantener el marco
de lectura del gen de inters. Todos los cebadores reversos (R) fueron diseados de
forma de eliminar el codn de detencin (codn stop) del gen y mantener el marco de
lectura con los residuos de histidina del vector a utilizar para el clonado.
Todos los programas mencionados en esta seccin fueron utilizados con los parmetros
en que se encuentran determinados.

3.2. Obtencin de muestras
El ADN para la amplificacin de genes de Theileria equi se obtuvo gracias a la
colaboracin del Comando de Remonta y Veterinaria, perteneciente al Ejercito
Argentino, cuya dependencia se ubica en el barrio de Palermo en la Ciudad Autnoma
de Buenos Aires. Se extrajeron 10 ml de sangre en forma asptica de un equino de ese
organismo, que haba sido infectado experimentalmente con sangre de un animal
positivo para T. equi. Se utiliz citrato sdico como anticoagulante, en una relacin 1:9
Tabla 3.1.: Nombre y secuencia de los cebadores especficos para cada gen.

32

de citrato sdico 3,8 % : sangre. La sangre fue conservada a 4 C durante su traslado y
congelada luego a -20 C hasta su procesamiento.
Por otra parte, se obtuvieron 2 ml de sangre de un equino infectado con B. caballi
gracias a la contribucin de los Dres. Ignacio Echaide y Susana Torioni de la Estacin
Experimental del INTA de Rafaela, Santa Fe. La obtencin y preservacin de la muestra
se realiz de igual manera que la muestra de T. equi.
En ambos casos, la presencia de los piroplsmidos en la sangre de los equinos haba
sido detectada en su lugar de origen por observacin microscpica de frotis teidos con
colorante de Giemsa, pero se desconocen los datos de parasitemia o tiempo de
infeccin. La confirmacin de la identidad de los parsitos en las muestras citadas se
realiz posteriormente por secuenciacin de los fragmentos de ADN que se
amplificaron.
Las muestras de sangre utilizada para la obtencin de suero se recolectaron
aspticamente con tubos de vaco (Vacutainer, BD) de 10 ml con activador de la
coagulacin. Se conservaron a 4 C desde su recoleccin hasta su llegada a destino. En
el laboratorio se centrifugaron las muestras a 300 g y se transfiri el suero a un tubo tipo
Eppendorf. Luego se congel el material obtenido y se lo mantuvo a -20 C hasta su
procesamiento.
Las muestras de sangre entera que se utilizaron tanto en el ensayo de qPCR y RLB
(secciones 3.15.y 3.16.) provienen de equinos de la ciudad formosea de Misin San
Francisco de Laishi (ver mapa en seccin 3.10.). Fueron recolectadas aspticamente en
tubos de vaco (Vacutainer, BD) de 10 ml, conteniendo K
3
EDTA (1,5 mg/ml de sangre)
como anticoagulante. Estas muestras se conservaron a 4 C desde su recoleccin hasta
su destino. Luego fueron congeladas y mantenidas a -20 C hasta su procesamiento.
Se obtuvo un total de 654 sueros de equinos de Salta (n = 299), Formosa (n=129), Entre
Ros (n= 104) y Buenos Aires (n=122), ver regiones en seccin 3.10. Para estas
muestras, se extrajeron de 6 a 8 ml de sangre en tubos de vaco (Vacutainer, BD) de 10
ml, sin anticoagulantes. Las muestras fueron conservadas a 4 C hasta su procesamiento.
Para la separacin del suero, las muestras fueron centrifugadas 10 min a 1500 g y
conservadas a -20 C.
La extraccin de sangre en todos los casos fue realizada por puncin venosa en la vena
yugular externa del animal.

3.3 Extraccin de ADN

33

La extraccin de ADN a partir de las muestras de sangre entera que seran utilizadas
para la expresin de protenas, fue realizada de la siguiente manera:
Las muestras de sangre fueron descongeladas y alcuotas en 2 ml. Fueron centrifugadas
durante 10 min a 10.000 g a 4 C, y el pellet se resuspendi en 2 ml de buffer fosfato
salino PBS (137 mM NaCl / 1,5 mM H
2
KPO
4
/ 6,5 mM Na
2
HPO
4
/ 2,7 mM KCl, pH
7,4). Se repiti este procedimiento de centrifugacin y lavado con PBS varias veces,
hasta que el sobrenadante quedase transparente, libre de hemoglobina. El ltimo pellet
se resuspendi en 200 l de PBS. Luego se agreg dodecil sulfato de sodio (SDS) 1%
v/v y Proteinasa K 0,1 mg/ml, concentracin final (c.f.), y se incub a 65 C por 15 min,
y luego a 45 C durante 16 h. Se agreg NaCl 1M c.f., y 1 volumen de
fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1, v/v), se agit por inversin y luego se
centrifug a 10.000 g durante 10 min a 4 C para separar las fases, trasvasando la fase
superior acuosa a un nuevo tubo. Los pasos de agregado de fenol/cloroformo/ alcohol
isoamlico, agitacin y centrifugacin fueron repetidos 2 o 3 veces, hasta obtener la fase
acuosa totalmente limpia. Seguidamente, se agregaron 2 volmenes de etanol absoluto
enfriado a 4 C, y se dej a -20 C durante una hora, para luego centrifugar a 12.000 g
durante 20 min a 4 C. Se descart el sobrenadante, y el pellet conteniendo el ADN
precipitado se lav con etanol 70%, seguido de centrifugacin (12.000 g, 20 min, 4 C).
El pellet resultante se resuspendi en buffer Tris EDTA, TE (10 mM Tris HCl / 1 mM
EDTA, pH 8,0), y se conserv a -20 C. La concentracin de ADN se calcul por
lectura espectrofotomtrica a 260 nm, siendo la misma de 8 ng/l para la extraccin de
ADN de Theileria equi y de 3 ng/l para la extraccin de ADN de Babesia caballi.
El ADN utilizado para los ensayos de qPCR y RLB fue extrado con el kit QIAGEN
Flexi Gene (Manual disponible en
http://www1.qiagen.com/Products/GenomicDnaStabilizationPurification/FlexigeneDN
ASystem/FlexigeneDNAKit.aspx#Tabs=t2). Bsicamente consiste en una lisis de la
muestra, tratamiento con una proteasa y precipitacin del ADN con isopropanol. Si bien
el rendimiento de este mtodo de extraccin es inferior al obtenido con la extraccin
con fenol/cloroformo, es mucho ms rpido de realizar y por lo tanto ms til para el
procesamiento de gran cantidad de muestras.
Todas las extracciones fueron analizadas en una corrida electrofortica horizontal. Para
esto se sembraron 5 l de los productos de extraccin en un gel de agarosa al 0,8 % en

34

buffer TAE (40 mM Tris-acetato / 1 mM EDTA / cido actico glacial 0,001 % (v/v);
pH 8,5) conteniendo bromuro de etidio (0,5 g/ml). Luego de su separacin
electrofortica, los fragmentos de ADN fueron visualizados en un transiluminador UV y
se corrobor que el ADN genmico no hubiese sufrido degradacin.

3.4. Produccin y purificacin de formas recombinantes de antgenos
de diagnstico
3.4.1. Amplificacin de los genes de inters por PCR
A partir del ADN obtenido se amplificaron por PCR los marcos abiertos de lectura
(ORF) de los fragmentos correspondientes a los genes de T. equi: ema-1, ema-2 y de B.
caballi rap-1. As tambin a partir de la muestra de ADN de T. equi, se amplificaron las
secuencias tesp, te2 y te8 para explorar si correspondan a posibles candidatos de
diagnstico, como se describi en la seccin 3.1.2.
Se prepar la mezcla de reaccin de PCR conteniendo: 50 mM KCl / 20 mM Tris HCl
(pH 8,3) / 1,5 mM MgCl
2
/ 0,2 mM dNTPs / 0,5 M de cada cebador (ver Tabla 3.2.) /
0,2 ng/l de ADN templado / 2 U de Taq ADN polimerasa (Promega) y H
2
O milli Q
hasta llevar al volumen deseado.
El programa de PCR utilizado se describe en la Tabla 2.2. Las temperaturas de
hibridizacin (T.H.) dependieron en cada caso del par de cebadores usados, y fueron las
mostradas en la tabla 2.1.
Paso Tiempo [min] Temperatura [
o
C] Ciclos
Desnaturalizacin Inicial 5 95 1
Desnaturalizacin 0,75 95
35 Hibridizacin 0,75 T.H.
Extensin 1,25 72
Extensin final 10 72 1


Todas las amplificaciones fueron confirmadas en una corrida electrofortica horizontal,
en un gel de agarosa al 1% en buffer TAE. El tamao de los amplicones fue calculado
por comparacin con un marcador de tamao 1 kb (Promega), corrido paralelamente.

Tabla 3.2: Condiciones usadas para la PCR
(T.H.): temperatura de hibridizacin

35

3.4.2. Clonado en vector de expresin y transformacin de clulas
competentes
Los productos de amplificacin se clonaron para su expresin en el vector comercial
pBAD/ThioTOPO (Invitrogen).
El vector de expresin procaritico pBAD/ThioTOPO de 4454 pb permite la insercin
directa de los productos de amplificacin de PCR, sin necesidad de cortar con enzimas
de restriccin. Este plsmido se comercializa linealizado y posee en sus extremos 3 un
nucletido timidina sin aparear que permite la unin con las adenosinas 3 no apareadas
del producto de amplificacin de la PCR. Adems, el vector posee, unido al mismo
extremo, una Topoisomerasa I que permite ligar covalentemente el vector al extremo 5
del segmento de ADN de inters, como est ilustrado en la Figura 3.1. El vector
contiene el origen de replicacin ori pUC y un gen para resistencia a ampicilina. En el
sitio de insercin tiene un sitio de corte para una enteroquinasa, en el caso que se
necesite escindir la Tiorredoxina fusionada de la protena de inters. Posee tambin un
epitope V5 para el reconocimiento de un anticuerpo anti-V5.




Los niveles de expresin de la protena recombinante estn regulados por la
concentracin de L-arabinosa en el medio. En ausencia de arabinosa, el regulador
negativo transcripcional AraC (gen presente en el plsmido) forma un bucle (loop) en el
ADN que impide la unin de la ADN polimerasa al promotor araBAD (P
BAD
) del
Figura 3.1: Mapa del vector pBAD/ TOPO, describiendo
sus componentes ms importantes.

36

vector. En presencia de la misma, la arabinosa se une a la regin araC, liberando el
bucle y permitiendo la transcripcin.
Estos plsmidos tienen la ventaja adicional de agregar 6 residuos histidina en la regin
C-terminal de la protena expresada, permitiendo la purificacin de sta por medio de
una cromatografa de afinidad por quelantes metlicos, como lo son las resinas de
nquel-agarosa.
El vector pBAD/thioTOPO (4.454 pb) permite fusionar a la secuencia peptdica que
uno desea expresar, una porcin de la protena Thiorredoxina. Esto aumenta la
eficiencia de transcripcin y la solubilidad de la protena a la que va fusionada, en
especial si se trata de una protena de membrana con regiones hidrofbicas. A su vez la
Tiorredoxina posee dos de sus aminocidos cambiados por histidinas. Es decir que las
protenas recombinantes producidas en este sistema contienen 6 histidinas en su
extremo carboxilo terminal y dos histidinas en su extremo amino terminal. Esto
aumenta la afinidad de la protena por los quelantes metlicos, mejorando su
purificacin por cromatografa de afinidad en nquel-agarosa.
Los pasos seguidos para la ligacin de los fragmentos de ADN en el vector y la
transformacin de las clulas fueron los siguientes: se incubaron: 4 l de producto de
PCR (amplicones), 1 l de vector pBAD/thioTOPO, 1 l de solucin de sales (1,2 M
NaCl/ 0,06 M MgCl
2
, pH 8,0) por el lapso de 5 min a temperatura ambiente. Se
agregaron 2 l de esta ligacin a 50 l de clulas competentes de E. coli, y se dej 30
min en hielo. Por medio de un golpe (shock) trmico de 30 a 45 segundos en bao a
42C se logr la permeabilizacin de la membrana plasmtica. Se adicionaron 250 l de
medio LB (Luria Bertani) lquido (10 g/l triptona/ 5 g/l extracto de levadura/ 5 g/l NaCl)
y se agit durante 1 hora a 37C. Se fraccionaron dos alcuotas de 50 l y 200 l para
su sembrado en dos placas de LBA-agar (LB + 15 g/l agar y 100 g/ml de Ampicilina).
Por ltimo se dej toda la noche (ON) en estufa a 37C.

3.4.3. Preparacin de clulas competentes
La cepa de E. coli utilizada para transformar fue TOP 10 [F
-
mcrA A mrr hsdRMS-
mcrBC)u80lacZAM15 AlacX74 recA1 deoR araD139 A(ara-leu)7697 galU galK rpsL
(Str
R
) endA1 nupG ]. Se utilizaron clulas competentes preparadas en el laboratorio.

37

Para estas ltimas, se utiliz el siguiente protocolo bajo condiciones de esterilidad: se
sembr por extensin en placa con LB-agar una estra de bacterias TOP 10 y se las dej
creciendo toda la noche. Se pic una colonia e inocul en 5 ml de LB. Nuevamente se
dej crecer toda la noche a 37 C. Se realiz una dilucin 1:100 en 100 ml de medio LB,
y las bacterias se incubaron a 37 C con agitacin hasta alcanzar una A
600
= 0,5. Los
cultivos fueron enfriados durante 5 min en hielo, seguido de centrifugacin a 3.000 g
por 10 min a 4 C. Se resuspendi en 40 ml de Buffer TFB I (30 mM KC
2
H
3
O
2
/ 10 mM
KCl/ 10 mM CaCl
2
/ 50 mM MnCl
2
; pH 5,8; enfriado en hielo). Se centrifug la
suspensin nuevamente a 2.000 g por 10 min a 4C, y el precipitado fue resuspendido
en 40 ml de Buffer TFB II (10 mM MOPS/ 10 mM KCl/ 75 mM CaCl
2
/ 15 % v/v
glicerol estril; pH 6,5; enfriado en hielo). Luego de 5 min en hielo, las clulas se
alicuotaron en volmenes de 250 l que fueron guardados a -70C.
Se comprob la eficiencia de la competencia mezclando 1 l del plsmido pUC (0,1
ng/l) con 50 l de clulas competentes. Esta suspensin se sembr en placas de LBA-
agar slido que se cultivaron toda la noche a 37 C. Se contaron las colonias y el valor
ndice de transformacin de competencia se expres como el nmero de colonias
por masa de ADN (en g) utilizado. En nuestro caso se obtuvo un valor de 3,6 x 10
6

colonias por g de ADN. En general se calcula que un valor por encima de 10
5
es
aceptable para transformaciones en presencia de CaCl
2
usando plsmidos pequeos.

3.4.4 Seleccin de clones positivos
Una vez realizado el clonado en vector de expresin descripto en el punto 3.4., se
seleccionaron los clones recombinantes que contenan la secuencia de los genes de
inters en la direccin correcta (con su extremo 5 ubicado hacia el promotor araBAD).
Para ello, se efectu una reaccin de colonia-PCR, utilizando el cebador trasero pBAD-
R (5-GATTTAATCTGTATCAGG-3) y los cebadores delanteros de cada uno de los
genes en cuestin, como se describen en la Tabla 1. Como templado de la reaccin se
tom una punta de escarbadientes de una colonia de bacterias y se resuspendi en la
mezcla de reaccin de PCR. En todo lo dems, la mezcla de reaccin fue como se
describe en el punto 3.3. El programa utilizado fue el descripto en la Tabla 2, con una
temperatura de hibridacin de 55 C y la adicin de 5 min a 95C en el paso de
desnaturalizacin inicial para lisar las clulas e inactivar las nucleasas.

38

Nuevamente todos los productos de amplificacin fueron confirmados sembrando 5 l
en un gel de agarosa al 1 % en buffer TAE y teidos con bromuro de etidio. Como
control negativo de la PCR se us mezcla de reaccin sin picar bacterias del cultivo. Se
seleccionaron 1 a 4 clones positivos (con el inserto en orientacin correcta) en cada
caso.

3.4.5. Induccin de la expresin en los clones seleccionados
Para analizar el nivel de expresin de las protenas recombinantes en cada uno de los
clones seleccionados, se inocularon tubos conteniendo 1 ml de LBA con una punta de
escarbadientes de las colonias respectivas y se incubaron toda la noche a 37C con
agitacin. Al da siguiente, 100 l de estos cultivos se utilizaron para comenzar cultivos
frescos en 2 ml de LBA, los cuales fueron incubados por 2 h a 37C con agitacin;
tiempo en el que el cultivo alcanza una Abs
600
de 0,5. Luego se someti 1 ml del cultivo
a induccin con 0,2 % arabinosa (c.f.), mientras que el mililitro restante se utiliz como
control negativo. Los cultivos con y sin arabinosa fueron incubados a 37 C por 3 h con
agitacin.
Al cabo de las 3 h de incubacin, los cultivos de bacterias fueron centrifugados (1.000
g, 15 min, 37 C), y los precipitados fueron disueltos en buffer de carga (250 mM Tris-
HCl, pH 6,8/ 10% SDS/ 0,5 % azul de bromo fenol/ 50% glicerol/ 0,4% |-
mercaptoetanol). Las muestras fueron hervidas por 5 min, y sonicadas en hielo, con un
sonicador de punta de titanio (Branson Ultrasonic Corporation, modelo Sonifier 250)
con dos intervalos de 15 segundos en potencia 5; luego de lo cual fueron centrifugadas
(10.000 g, 4 C, 5 min). Los sobrenadantes fueron sembrados en minigeles de
poliacrilamida. La estructura de los geles consisti en 1 ml de gel concentrador de 5%
poliacrilamida sobre 5 ml de gel separador de 12% de poliacrilamida. La composicin
del gel concentrador fue: 1M Tris, pH 6,8/ 4,93 % de acrilamida/ 0,17 % N,N-metil
bisacrilamida/ 3,5 mM SDS 10 %/ 4,3 mM persulfato de amonio (APS)/ 1 l de
TEMED (N,N,N`N`-tetra-metiletilendiamina) en un volumen final de 1 ml. La
composicin de gel separador fue 1,5 M Tris, pH 8,8/ 11,6 % acrilamida/ 0,4 % N,N-
metil bisacrilamida/ 3,5 mM SDS/ 4,3 mM APS/ 2 l de TEMED en un volumen final
de 5 ml. Los geles fueron armados en el sistema MiniProtean 3 (Bio-Rad). Luego de la
polimerizacin, fueron sumergidos en una cuba de electroforesis con buffer de corrida

39

Laemmli (Tris-HCl 25 mM, pH 8,8/ glicina 250 mM/ SDS 0,1 %) y las protenas fueron
separadas por electroforesis vertical (120 V). En una calle de cada uno de los geles se
sembr un marcador de peso molecular (PageRuler Prestained Protein Ladder,
Fermentas). Al cabo de la corrida, los geles fueron teidos con Coomassie blue (0,25%
p/v Coomassie Brilliant Blue R-250/ 45% metanol/ 10% acido actico glacial) y
desteidos con solucin decolorante (40% metanol/ 10% cido actico glacial). De esta
manera se analiz si los cultivos de bacterias inducidos con arabinosa presentaban
bandas que no estuvieran presentes en los cultivos no inducidos, y si el tamao de las
bandas corresponda con el esperado. El peso molecular esperado para cada una de las
protenas producidas se calcul en el sitio
http://gchelpdesk.ualberta.ca/downloads/prot_mw.html. Las protenas recombinantes
obtenidas, estn fusionadas a una porcin de la protena Tiorredoxina en el extremo N-
terminal, y a un grupo de 6 histidinas en el extremo C-terminal. De esta manera, las
protenas resultantes tienen aumentado su peso molecular en 16 kDa. Los pesos
moleculares esperados para las distintas protenas fueron los que se muestran en la
Tabla 3.3.
Gen
Peso molecular de
la protena*
Peso con la
fusin**
EMA-1 26 kDa 39 kDa
EMA2tr1 13 kDa 26 kDa
RAP-1 53 kDa 66 kDa
TESP 10 kDa 23 kDa
TP2 19 kDa 32 kDa
TP8 46 kDa 59 kDa



En todos los casos, para confirmar que la banda observada correspondiera a la protena
recombinante fusionada a la secuencia de 6 histidinas, se realiz un Western blot con un
anticuerpo anti-histidina (Amersham). Para esto se separaron nuevamente las protenas
en una corrida electrofortica en iguales condiciones a las descriptas previamente.
Luego se realiz una transferencia de las mismas a una membrana de nitrocelulosa
Protran (Schleicher y Schuell) en buffer de transferencia (48 mM Tris base pH 8,3/ 39
mM glicina/ 1,28 mM SDS/ metanol 20 %). La transferencia se realiz en un equipo
Tabla 3.3: Peso molecular de las protenas producidas.
* peso molecular calculado en: http://gchelpdesk.ualberta.ca/downloads/prot_mw.html
** fusin al segmento de Tiorredoxina y las 6 histidinas

40

MiniProtean 3 (Bio-Rad) aplicando un amperaje constante de 160 mA por 1,25 h. Se
constat que la transferencia hubiera sido satisfactoria observando que las bandas
correspondientes al marcador de peso molecular fueran ntidas. Dado que el marcador
de peso molecular utilizado es coloreado, no es necesario teir la membrana para esta
verificacin. Luego se bloque la membrana con buffer PBS/ Tween 20 0,1 %/ leche
descremada 3% (PBST-leche), durante una noche a 4 C. Se procedi a la incubacin
con el anticuerpo anti-histidina (Amersham) en una dilucin 1/2.000 en PBST-leche por
1h. Se realizaron dos lavados de 10 min y se incub por 1 h con el anticuerpo
secundario anti-IgG anti-ratn conjugado a fosfatasa alcalina diluido 1/2.000 en PBST-
leche. Luego de dos lavados finales de 10 min, se incub en buffer III - NBT - BCIP
(100 mM Tris-HCl, pH 9,5/ 100 mM NaCl/ 5 mM MgCl
2
/ 0,4 mM nitro blue
tetrazolium (NBT)/ 0,38 mM 5-bromo-4-cloro-3 indolil fosfato (BCIP)). Todas las
incubaciones fueron realizadas a 37 C y con agitacin. En las reacciones positivas, se
observ una banda de color negro del tamao esperado.

3.4.6. Purificacin de plsmidos
Una vez identificados los clones positivos para la expresin de las protenas de inters,
se llev a cabo una amplificacin y purificacin de plsmidos para su posterior
secuenciacin. Los cultivos de bacterias transformadas crecidos toda la noche, que se
mencionaron en el punto anterior, se guardaron a 20
o
C en presencia de 30% glicerol
para su crioproteccin. A partir de estos, se realizaron nuevos cultivos ON en 3 ml de
LBA para la purificacin de plsmidos. Se utiliz un kit comercial de extraccin de
plsmidos Wizard Plus SV (Promega). El mtodo utilizado consisti bsicamente en
los siguientes pasos: se centrifug el cultivo a 1.000 g por 10 min para obtener un
precipitado de bacterias, se resuspendi en un buffer de lisis, mezclando por inversin.
Se agreg una solucin con proteasa alcalina durante 5 min a temperatura ambiente y se
detuvo su actividad con una solucin neutralizante, mezclando por inversin. Se
centrifug a 10.000 g por 10 min y el sobrenadante se transfiri a una resina de
purificacin centrifugando la columna dentro de un tubo de 1,5 ml a 10.000 g durante 1
min. La columna fue lavada por centrifugacin con 2 ml de solucin de lavado y
finalmente se efectu la elucin del plsmido con 100 l de agua libre de nucleasas y se
conserv a 20 C.

41

Se comprob la eficiencia de la purificacin por electroforesis horizontal en gel de 1 %
agarosa, como se describi en el punto 3.3., observndose bandas mayores a 4 kb y
menores a 6,5 kb dependiendo del largo del inserto. Las preparaciones fueron
cuantificadas por lecturas de Abs
260/280
(absorbancia a 260 nm, 280 nm y su relacin)
en un espectrofotmetro Thermo Scientific NanoDrop
TM
1.000, para controlar que la
concentracin de ADN fuese igual o mayor a la requerida para la secuenciacin (100
ng/l) y que la relacin ADN/protenas superase el valor de 1,5.
Para la secuenciacin (Sanger, 1977) automtica de los productos de amplificacin por
PCR clonados en el vector de expresin, se enviaron 10 l de la solucin con el
plsmido a la Unidad de Genmica del Instituto de Biotecnologa, CNIA, INTA. Esta
Unidad dispone de un secuenciador automtico de capilares modelo ABI3130XL
(Applied Biosystems) para la secuenciacin de ADN. Para la reaccin de secuenciacin
se utilizaron cebadores delantero y trasero correspondientes a secuencias del plsmido
utilizado: Trx-F (5-TTCCTCGACGCTAACCTG-3) y pBAD-R (5-
GATTTAATCTGTATCAGG-3) para el vector pBAD/ThioTOPO. Las secuencias
fueron recibidas por correo electrnico en formato .ab1 y .phd y analizadas utilizando el
programa BioEdit. Luego de eliminar las regiones correspondientes al vector, las
secuencias obtenidas fueron comparadas con secuencias conocidas, depositadas en el
GenBank, utilizando los programas descriptos en la seccin 3.1.1.

3.4.7. Purificacin de protenas recombinantes
Una vez comprobada la identidad de los clones recombinantes obtenidos y demostrada
su eficiencia de expresin, se efectuaron cultivos de mayor volumen para proceder a la
purificacin de las protenas de inters.
Los protocolos de purificacin que se utilizaron en este trabajo fueron tres: (i) en
condiciones nativas, (ii) en condiciones desnaturalizantes y (iii) por electroelucin.
Cada uno de estos mtodos tiene alguna ventaja que lo diferencia de los otros. (i) La
purificacin en condiciones nativas posee la ventaja de que la protena mantiene en
cierto grado su estructura nativa, lo que permite que algunos epitopes conformacionales
sean conservados, dndole a la protena purificada ms oportunidades para que
anticuerpos especficos de la protena nativa la reconozcan. (ii) El segundo mtodo fue
utilizado en los casos en que la protena recombinante se concentra mayoritariamente en

42

cuerpos de inclusin insolubles de la bacteria. Este mtodo utiliza agentes caotrpicos
que desnaturalizan a las protenas y las hacen soluble. (iii) La electroelucin permite la
obtencin de una mayor cantidad de protena purificada y por otra parte, permite la
purificacin de protenas insolubles en buffer de lisis nativo (ver seccin 3.9.1.), siendo
ms sencillo que el mtodo (ii), ya que no utiliza agentes caotrpicos.
La obtencin del extracto de bacterias fue comn a todos los mtodos y se describe a
continuacin: se crecieron ON 100 l de bacterias recombinantes en 2 ml de LBA a
partir de estabilatos guardados a -20
o
C. Con este cultivo, se inocularon 100 ml de LBA
en un Erlenmeyer de 500 ml, agitando a 37 C durante 2 a 3 h. Se ley peridicamente
la Abs
600
hasta llegar a un valor de 0,5. Se separ una alcuota de 1 ml, que se dej
creciendo como control negativo de induccin, y al resto del cultivo se agreg el
inductor arabinosa, en concentracin final de 0,2 % a partir de una solucin stock estril
al 20% en H
2
0 destilada. Luego de 3 h en agitacin a 37 C se separ 1 ml de cultivo
para analizar por electroforesis junto con el control negativo de induccin. Ambas
muestras fueron centrifugadas a 3.000 g durante 1 min. Se descart el sobrenadante y se
resuspendi en 100 l de buffer de muestra. El resto del cultivo se centrfugo a 3.000 g
durante 15 min.

3.4.7.1. Cromatografa de afinidad, buffer nativo
El precipitado fue resuspendido por agitacin en vrtex en 5 ml de buffer de lisis nativo
ProBond (PNLB, formulado de la siguiente forma: 50 mM de K
2
HPO
4
/ 400 mM NaCl/
100 mM KCl/ 10% glicerol/ 0,5% tritn X-100/ 10 mM imidazol, pH 7,8). Se adicion
PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) 1 mM y lisozima 1 mg/ml. Se sonicaron las
muestras en hielo, con un sonicador Branson 250 (VWR Scientific) por 3 perodos de
30 s, en potencia 5. Luego las muestras fueron centrifugadas a 10.000 g durante 20 min.
El sobrenadante se verti en una columna de afinidad previamente equilibrada con
PNLB, se mezcl la resina con la muestra y se incub por 1 hora a 4 C con agitacin.
Al cabo de este perodo se recogi el percolado (wash-out), y se lav la columna con 5
ml de PNLB. Se prepararon distintas concentraciones de imidazol (50, 100, 200, 400, y
1000 mM) en volmenes de 3 ml en el mismo buffer que se utilizaron para la elucin de
las protenas. Se sacaron alcuotas del percolado y cada uno de los eluatos y se
analizaron, junto con los controles positivo y negativo de induccin, por SDS-PAGE en

43

geles de 10% acrilamida, seguido de tincin con Coomassie blue, como se describi en
3.4.5.
Asimismo, se verific la identidad de la protena purificada por Western blot utilizando
anticuerpo anti-histidina, como se describi en el punto 3.7.

3.4.7.2. Cromatografa de afinidad, buffer desnaturalizante
El pellet de clulas se resuspendi en 8 ml de buffer de lisis guanidina (6 M clorhidrato
de guanidina/ 20 mM fosfato de sodio; pH 7,8/ 500 mM NaCl) calentado previamente a
37 C. Se sonic el lisado de clulas en hielo con tres pulsos de 30 segundos con alta
intensidad, intercalando enfriamientos de 10 segundos en hielo. Se centrifug el lisado a
3.000 g durante 15 min para precipitar los desechos celulares. Se transfiri el
sobrenadante a un nuevo tubo con la resina previamente equilibrada con buffer de lisis.
Se incub durante 15 a 30 min a temperatura ambiente con agitacin suave para permitir
la unin de la protena a la resina. Se precipito la resina con una centrifugacin de 100 g
y se descart el sobrenadante. Luego se resuspendi la resina sucesivamente en 4 ml de
buffers de lavado con pH decreciente, para permitir la elucin de la protena. Los
buffers utilizados fueron: (i) 8 M Urea/ 20 mM de fosfato de sodio pH 7,8/ 500 mM
NaCl), (ii) 8 M Urea/ 20 mM fosfato de sodio, pH 6,0 /500 mM NaCl); (iii) 8 M Urea/
20 mM fosfato de sodio, pH 5,3 /500 mM NaCl) y (iv) 8 M Urea/ 20 mM fosfato de
sodio, pH 4,0/ 500 mM NaCl. En todos los casos, despus de resuspender la resina en
cada buffer, esta fue agitada durante 1 min, y precipitada con 100 g, seguido de
aspiracin del sobrenadante. Para eliminar la urea, la elucin utilizada en la placa de
ELISA fue dializada contra Tris 10 mM, pH 8,0/ 0,1% Tritn X-100 ON a 4 C en una
membrana de dilisis de celulosa con tamao de poro de 12 kDa.

3.4.7.3. Electroelucin
El mtodo de purificacin por electroelucin consiste en separar la protena en un gel de
poliacrilamida mediante una corrida electrofortica, cortar la banda correspondiente a la
misma y someter a esa porcin de gel, colocada dentro de una bolsa de dilisis, a un
campo elctrico, para que la protena pueda separarse de la acrilamida y quede en
solucin. Para esto, el pellet del punto 3.4.7 se resuspendi en buffer de carga, se hirvi

44

y sonic con 3 pulsos de 30 seg cada uno con potencia 5. Asimismo, se sembr en un
gel de acrilamida como tambin se describe en 3.4.7, con la salvedad que el peine
utilizado para el armado del gel fue uno de tipo preparativo. Tambin se corri el
marcador de peso molecular PageRuler Prestained. Una vez corrida la muestra se
incub el gel en una solucin de 500 mM KCl a 4 C para la precipitacin de las
protenas, que permite su observacin. La banda correspondiente a la protena de inters
se la reconoci por comparacin con el marcador preteido. La tira de gel conteniendo
esta banda fue cortada con un bistur y colocada dentro de una membrana de dilisis de
celulosa con tamao de poro de 12 kDa. Esta membrana se expuso a una corriente de 20
mA, en una cuba electrofortica conteniendo buffer de carga, por 2 h. Posteriormente se
dializ la membrana en Tris 10 mM, pH 8,0/ 0,1% Tritn X-100 ON a 4 C. Por ltimo
se abri la membrana y se recolect el buffer conteniendo la protena purificada.
En todos los casos, las protenas purificadas fueron conservadas a -80 C hasta su uso.
La cuantificacin de la mayora de las protenas se realiz mediante el kit colorimtrico
Micro BCA Protein Assay Reagent (Pierce). Sin embargo, dado que en la purificacin
de las protenas de inters existen contaminantes bacterianos, nos pareci ms correcto
que las protenas fueron cuantificadas corriendo en un SDS-PAGE una alcuota de
volumen conocido y comparando por medio del programa Image Quant TL 7.0 GE
Mdulo 1D el tamao de banda obtenido con el de las diluciones seriadas (entre 1 mg y
0,5 g finales) de un estndar proteico de albmina bovina (BSA). Este ltimo mtodo
solo fue utilizado para la cuantificacin de las protenas EMA-1 y RAP-1 que se
utilizaron en los ELISAs indirectos finales. Tambin se utiliz para la cuantificacin de
los anticuerpos anti-equino conjugados a peroxidasa.

3.5. Anlisis de antigenicidad
Se produjeron formas recombinantes en E. coli para los nuevos candidatos de
diagnstico seleccionados (TESP, TE2 y TE8), de igual manera que se hizo para EMA-
1, EMA-2 y RAP-1. Para determinar si estos antgenos podran servir para el desarrollo
de tests de diagnstico, se analiz su expresin y antigenicidad a travs de un Western
blot en el que se corri paralelamente como control positivo la protena EMA-1, cuya
antigenicidad ya es conocida. Como suero control negativo se utiliz un suero de
referencia obtenido del Centro de Referencia National Veterinary Services Laboratories

45

(NVSL) USDA, APHIS, VS. Como controles positivos se usaron 4 sueros con
diagnstico positivo por cELISA.

3.6. Muestreo de animales de campo
El tamao muestral es la cantidad de datos que se debe tomar de una poblacin de forma
aleatoria, para que los datos obtenidos sean representativos de esa poblacin. El tamao
muestral para la obtencin de la prevalencia de una enfermedad, se determina a travs
de la ecuacin matemtica 3.1 (Pita Fernndez S. 1996):

( )
( ) ( ) p p Z N d
p p Z N
n
+

=
1 1
1
2 2
2



donde:
N = total de la poblacin
Z
2
= nivel de confianza
p = porcentaje esperado (obtenido de estudios preliminares o anteriores)
q = 1 p
d = precisin o error
Es decir que para el clculo del tamao muestral de una determinada regin deben
conocerse el nmero total de animales en esa regin y tener una estimacin del nmero
de muestras positivas totales que se deberan obtener.
A modo de ejemplo, usando la provincia de Misiones, una de las que posee menor
cantidad de equinos entre las provincias argentinas (n=345.648), se necesitaran estudiar
816 animales. Los valores se obtienen usando los siguientes parmetros:
N = 345.648 (INDEC, Censo Nacional Agropecuario 2002)
Z
2
= 1,96 (nivel de confianza de 95%)
p = 0,258 (25,8%, Brihuega et al., 1993)
q = 1 p (en este caso 1- 0,258 = 0,742)
d = 0,03 (3%)
se necesitaran
Ecuacin 3.1: tamao muestral de una poblacin.

46

21 , 815
742 , 0 258 , 0 96 , 1 647 . 345 03 , 0
742 , 0 258 , 0 96 , 1 648 . 345
2 2
2
=
+

= n animales
Debido al elevado costo de un relevamiento de esta magnitud, en todas las provincias
estudiadas, se realiz un muestreo de conveniencia, es decir un muestreo en el que los
animales son seleccionados de acuerdo a la buena predisposicin de los dueos de los
establecimientos para prestar sus caballos. Por lo tanto es un muestreo exploratorio y no
probabilstico.
Se realizaron 4 muestreos en cuatro provincias distintas de Argentina: Salta, Formosa.
Entre Ros y Buenos Aires. Las razones estratgicas de esta seleccin se debieron a dos
motivos: i) como se mencion en la introduccin la distribucin del vector de la
piroplasmosis equina es gradual de norte a sur del pas, por tal razn un muestreo de
distintos puntos en ese sentido, nos podra dar mayor informacin del alcance
geogrfico de T. equi y B. caballi, ii) la necesidad de tener una cantidad de muestras
positivas y negativas apropiada para una futura validacin de los ensayos de ELISA,
presuponiendo que las provincias de Entre Ros y Buenos Aires son libres de garrapatas
y por consiguientes de los parsitos.
Salta se localiza en una regin con diferencias muy marcadas en el clima. La
orientacin de sus cordones montaosos influye en la distribucin de las
precipitaciones. En la regin este, llanura Chaquea, predomina el clima semirido con
estacin seca, con un promedio anual de lluvias del orden de los 500 mm y temperaturas
medias del orden de los 20 C, habindose registrado temperaturas hasta de 47 C en
verano y de -5 C en invierno, es decir presenta una marcada amplitud trmica. Hacia el
oeste, el altiplano o Puna, se caracteriza por bruscas oscilaciones trmicas y escasas
precipitaciones, que mayormente no superan los 200 mm anuales, y temperaturas
medias anuales del orden de los 10 C, que corresponden al clima rido andino. En
contraste con las anteriores zonas, los valles, las quebradas y las sierras cuentan con un
clima ms benigno. Es el caso del valle de Lerma en donde se encuentra inmersa la
ciudad de Salta Capital, aqu los promedios anuales de precipitaciones alcanzan los
1.000 mm. Debido a esta marcada heterogeneidad, un muestreo en esta regin brindara
mucha informacin valiosa para conocer mejor cuales son las caractersticas climticas
que favorecen el ciclo normal de T. equi y B. caballi. El muestreo de esta provincia fue
cedido gentilmente por la Licenciada Irene lvarez. Se tom muestras de 299 caballos,
distribuidos en 10 localidades: Anta (n= 6), Cerrillos (n= 20), Chicoana (n=25), General

47

Gemes (n=4), General Jos de San Martin (n=42), La Caldera (n=6), La via (n=10),
Rosario de La frontera (n=32), Rosario de Lerma (n=21), Salta capital (n=133).



No se disponen datos sobre sexo, edad, raza y estado de salud de estos animales.
El muestreo en Formosa se realiz nicamente en la localidad de Misin San Francisco
de Laish. La ciudad se encuentra ubicada 2658' latitud sur. Es una regin subtropical,
con una temperatura media de 26,5 C, alcanzando en ocasiones durante el da los 40
C. La humedad relativa media es de 70 % y la precipitacin mensual media es de 136,2
mm. Por la temperatura media anual y la humedad relativa alta, esta regin es
sumamente propicia para el crecimiento de garrapatas, y en consecuencia es esperable
que la prevalencia de piroplasmosis equina en esta regin sea alta. El muestreo alcanz
los 130 animales, repartidos en 10 establecimientos. Los animales fueron en su mayora
caballos mestizos adultos de monta. El muestreo fue realizado en el mes de diciembre
de 2006.
Mapa 3.1: Localidades muestreadas
en la provincia de Salta.

48




En la provincia de Entre Ros, se realiz un muestreo en las ciudades de Chajar
(3046'), Federacin (3100'), Concordia (31 24'), Concepcin del Uruguay (3228') y
Gualeguaych (3301'). Por su situacin geogrfica, en Entre Ros la temperatura
disminuye de norte a sur. Dado esto, podemos encontrar dos regiones climticas: una
subtropical sin estacin seca y otra templada hmeda. La primera afecta a las ciudades
de Chajar y Federacin. Los inviernos son suaves y los veranos con temperaturas
promedio superiores a los 26 C. La temperatura media anual es de 20 C . Las
precipitaciones superan los 1.000 mm. anuales y predominan los vientos norte, este y
noreste. La segunda regin climtica, que corresponde al resto de las ciudades
muestreadas, presenta inviernos cuya temperatura media oscila entre los 7 C y 10 C, y
en verano, entre los 19 C y 23 C. La amplitud media vara entre los 10 C y 16 C. Las
precipitaciones, en promedio, son inferiores a los 1.000 mm anuales. El resultado de
este muestreo podra ser til para constatar la ausencia del vector en esta provincia y por
lo tanto la eficacia de los programas de control.
El muestreo se realiz sobre 104 equinos, repartidos de la siguiente manera: Chajar
(n=27, 1 establecimiento), Federacin (n=4, 1 establecimiento), Concordia (n=47, 2
establecimiento), Concepcin del Uruguay (n=5, 1 establecimiento) y Gualeguaych
(n=21, 3 establecimientos).
Mapa 3.2: Ubicacin de la localidad de Misin Laishi
en Formosa.

49




La provincia de Buenos Aires, al igual que la regin sur de Entre Ros pertenece a un
clima templado hmedo. La temperatura media es de 17,6 C y la precipitacin anual es
de 1147 mm. Los veranos son clidos, con un promedio de 24,5 C. La humedad
relativa media es de 65 %. Los inviernos son suaves, con una temperatura promedio de
11 C. Raramente se alcanzan temperaturas inferiores a 0 C. Sin embargo, a pesar ser
un clima propicio para el crecimiento de Rhipicephalus microplus, los programas de
lucha han sido efectivos, considerndose a la provincia libre de garrapatas.
En la provincia de Buenos Aires, se usaron 103 muestras cedidas gentilmente por la
Md. Vet. Mara Barrandeguy del Laboratorio de Virus Equinos del Centro de
Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronmicas del INTA de Castelar.
Pertenecen a animales criados en haras, y que son exportados para competiciones
ecuestres. Las muestras fueron tomadas en distintas pocas del ao y se desconoce su
procedencia exacta.
Debido a la nula existencia de equinos con diagnsticos positivos a Babesia caballi en
el muestreo de Formosa, fue necesario contar con 33 sueros positivos por cELISA,
provenientes de regiones endmicas de Brasil, gracias a la colaboracin del Md. Vet.
Mapa 3.3: Localidades muestreadas en la
provincia de Entre Ros.

50

Marcos Suarez, del SENASA de la localidad de Martnez en Buenos Aires. Se
desconoce las regiones especficas de procedencia de estas muestras.

3.7. cELISA para el diagnstico de Theileria equi y Babesia caballi
Para conocer el estado serolgico de las muestras que se utilizaran para la puesta a
punto de los ELISAs para T. equi y B. caballi, se analizaron con dos kits comerciales de
cELISA (VMRD, recomendados por la OIE) 91 muestras pertenecientes al muestreo
de Formosa y 91 sueros de la provincia de Buenos Aires.
Un ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) es un ensayo cuya finalidad es la
de conocer la presencia y/o concentracin de un analito (mayoritariamente antgenos o
anticuerpos). Un ELISA competitivo (cELISA), esquematizado en la figura 2.1, se basa
en el uso de un anticuerpo monoclonal (mAB) que se une especficamente a un epitope
B del antgeno que se encuentra pegado a la placa de ELISA. En el kit de cELISA de
VMRD para T. equi el antgeno es EMA-1 y en el de B. caballi, el antgeno es RAP-1.
Previo a la puesta del mAb en el pocillo de la placa, se coloca el suero que uno desea
analizar. Si este suero posee anticuerpos especficos por el mismo epitope al cual se une
el mAb, se impedir entonces que el mAb quede pegado a la placa. Posteriormente se
mide la presencia o ausencia del mAb agregando un anticuerpo conjugado a una
enzima, que es especfico para el mAb. Si durante el revelado no se observa reaccin,
esto significar que el suero analizado posee anticuerpos especficos por el antgeno y
en consecuencia el animal es considerado positivo a piroplasmosis.


Figura 3.2: Esquema de un ELISA competitivo

51

3.8. Criterios para la puesta a punto de los ELISAs
Un ELISA indirecto (ELISAi), mtodo puesto a punto en este trabajo, consiste
bsicamente en los siguientes pasos: (i) pegado del antgeno (Ag) a una fase slida; (ii)
bloqueo de los espacios libres que dej el antgeno en la placa para prevenir la unin
inespecfica de anticuerpos, (iii) unin o no del primer anticuerpo (Ab) especfico para
el antgeno si es que estuviera presente en el suero que se quiere analizar, (iv) unin de
un segundo anticuerpo dirigido contra las inmunoglobulinas de la especie que se quiere
analizar, el cual est conjugado a una enzima, (v) revelado de la reaccin enzimtica por
medio de algn sustrato colorimtrico especfico para la enzima. Ver esquema en la
Figura 3.3.


Muchos son los parmetros que se pueden variar para establecer las condiciones
ptimas para llevar a cabo este tipo de ensayo. Entre ellos, los que consideramos de
mayor importancia, fueron: (i) determinacin de la concentracin ptima de los
antgenos, (ii) necesidad o no de neutralizacin de los sueros con un extracto de E. coli
para disminuir las reacciones inespecficas, (iii) temperatura de sensibilizacin de las
placas, (iv) tipos y concentraciones de bloqueantes y (v) tiempos de bloqueo.
Se utilizaron grupos controles de sueros positivos y negativos a T. equi y B. caballi para
realizar estas pruebas. Los controles utilizados tanto para T. equi como B. caballi fueron
7 (siete) sueros analizados por el cELISA descriptos en la seccin 3.7. Para cada
parsito se eligieron 4 positivos y 3 negativos. Para T. equi se eligieron Adems, para
ambos parsitos se utiliz un suero negativo certificado por el Centro de Referencia
National Veterinary Services Laboratories (NVSL) USDA, APHIS, VS.
Figura 3.3: Esquema de un ELISA indirecto

52

Se fijaron condiciones preliminares para un ELISA indirecto, (placa: IMMULON 2HB;
bloqueante: OVA (albmina de huevo de pollo) 1%; sustrato: OPD (o-fenilenediamina);
tiempo de incubacin del suero: 1 h, 37 C). A partir de estos parmetros se fueron
cambiando cada uno de ellos por vez, de manera de encontrar las condiciones ptimas.
Como primera medida se realiz la titulacin del antgeno, es decir la bsqueda de la
concentracin ptima de antgeno para la prueba. Para esto, se emple una tcnica
descripta en el libro ELISA Teora y Prctica (Crowther, J.R., 1995). Simplemente
consiste una dilucin seriada del antgeno de izquierda a derecha de la placa y en forma
perpendicular una dilucin seriada del anticuerpo, como se esquematiza en la Fig. 3.4.



Una curva tpica de titulacin de antgeno se muestra en la Fig. 3.5:

Figura 3.4: Forma en que se realizaron las diluciones para
la titulacin de antgeno y suero.
Figura 3.5: Curvas caractersticas en el grfico de la
titulacin de antgeno y suero.

53

En este grfico se observa la Abs obtenida en funcin de la dilucin del antgeno. Las
distintas curvas representan distintas diluciones del anticuerpo. En las lneas A y B se
observa que al aumentar la concentracin de protena del pocillo 2 al 1, no hay
variaciones en los valores de Abs. Esto es un plateau y significa que la placa ya est
saturada con la protena y no puede pegar ms cantidad de la misma. Si se agregara una
concentracin mayor de Ag no se vera variacin en la Abs y se estara desperdiciando
protena. Por eso, para el ejemplo de la figura 3.5, la dilucin ptima de Ag debera ser
la que corresponde al valor 2 de la escala.
Cuando se observan las diluciones de anticuerpo A y B, se puede observar que a medida
que aumenta la dilucin de antgeno, va disminuyendo la Abs, pero nunca alcanza la
Abs de la lnea H que corresponde a una dilucin sin anticuerpo. Esto significa que las
diluciones A y B tienen ruido, producto del pegado inespecfico de anticuerpos a la
placa. La dilucin ptima de anticuerpo ser entonces la primera dilucin que no
presente este tipo de seal espuria. En nuestro caso, esta sera la dilucin
correspondiente a la lnea C.
El criterio para la seleccin de los distintos parmetros que se us para la puesta a punto
de los ELISAs fue una tasa de discriminacin. Esta consisti simplemente en la
divisin del promedio de las absorbancias de los controles positivos sobre los
promedios de los negativos. Para cada parmetro que se modific, se compararon las
tasas de discriminacin, a mayor valor obtenido, mayor poder resolutivo del ELISA.
Como se describi anteriormente, los antgenos recombinantes utilizados fueron
producidos en cultivos de E. coli. Si bien se obtuvo un alto grado de pureza utilizando
cromatografa de afinidad, las preparaciones finales presentaban contaminacin con
antgenos bacterianos. Esto puede dar falsos positivos en los tests de ELISA, ya que los
sueros equinos normalmente contienen anticuerpos contra antgenos de E. coli. Por esta
razn, se llev a cabo un experimento para establecer si era necesario preincubar los
sueros equinos con un extracto bacteriano para neutralizar los anticuerpos contra estos
antgenos inespecficos y en caso positivo, establecer la cantidad de antgeno de E. coli
necesaria. La neutralizacin consisti en la incubacin de un suero con las protenas
solubles de un extracto crudo de un cultivo de E. coli TOP 10 transformado con el
plsmido pBAD/ThioTOPO circularizado sin inserto, es decir que expresa nicamente
el fragmento de la protena Tiorredoxina que se fusion a las protenas utilizadas en este
trabajo. Este extracto se obtuvo a partir de un cultivo de estas bacterias inducido con

54

arabinosa durante 3 h. Luego, el cultivo se centrfugo a 1.000 g durante 15 min y el
precipitado fue resuspendido por agitacin en vrtex en buffer de lisis nativo ProBond
(ver seccin 3.4.7.1). Se adicion PMSF 1 mM y lisozima 1 mg/ml. Se sonicaron las
muestras en hielo, con un sonicador Branson por dos perodos de 30 s, en potencia 5.
Luego las muestras fueron centrifugadas a 10.000 g durante 20 min. El sobrenadante de
este cultivo es el extracto con el que se preadsorbieron los sueros.
La cantidad necesaria de extracto bacteriano para adsorber los sueros se determin de
manera experimental, observando en un ELISA indirecto las diferencias de
absorbancias entre un suero control positivo y otro control negativo (ver tasa de
discriminacin en esta seccin).
El anlisis de las distintas variables en la puesta a punto de los ELISAs se describir en
detalle en la seccin Resultados.

3.9. Determinacin del punto de corte
El punto de corte de los ELISAs fue calculado por comparacin en un anlisis de curva
ROC (Receiver Operating Characteristic). Este anlisis consiste bsicamente en calcular
los valores de sensibilidad y especificidad de la tcnica que se evala, iterando cada uno
de los puntos de corte posibles en la variable de cuantificacin. Para esto, es necesario
conocer previamente la variable de clasificacin, es decir el real diagnstico de cada
animal. Para esto se analizaron las muestras con el test cELISA para T. equi y B. caballi
(VMRD), ver seccin 3.7. La variable de cuantificacin utilizada fue el valor de
absorbancia de cada suero obtenido con los ELISAi desarrollados en esta Tesis,
normalizado con un control interno de placa (CIP). La normalizacin se realiz con el
objetivo de poder usar los valores de varias placas en el mismo anlisis. El anlisis ROC
se realiz con el programa MedCalc Versin 8.1.0.0.

3.10. Anlisis de concordancia
Ms tarde, los datos de ambos ensayos fueron comparados usando una prueba de
concordancia. La misma es un test estadstico que nos indica en cuanto se parecen dos
mtodos de diagnstico que miden el mismo analito. Consiste en comparar los

55

resultados provenientes de dos mtodos de diagnstico. Primero debe llenarse un cuadro
de doble entrada como el siguiente:

ELISAi
+ -
cELISA
+ a b
- c d


Luego, se utilizan estos datos con las siguientes frmulas:





El valor de k indica el nivel de concordancia entre los dos mtodos de acuerdo a la
siguiente tabla:
Valores de k Significancia
1 perfecta concordancia
0,8 a <1 muy buena
0,6 a 0,8 buena
0,5 a 0,6 aceptable
0,4 a 0,5 moderada
>0 a 0,4 mala
0 no hay concordancia



3.11. Ensayo de PCR en tiempo real
Para determinar la presencia de los piroplsmidos Babesia bovis y B. bigemina en
equinos, se realiz un ensayo de PCR en tiempo real usando una doble sonda Taqman,
es decir realizando la PCR con dos pares de cebadores y dos sondas, siendo cada uno de
( ) ( )
n
c a b a
a
+ - +
= E
( ) ( )
n
d b d c
d
+ - +
= E
( )
|
.
|

\
| E + E

|
.
|

\
| E + E

+
=
n
d a
n
d a
n
d a
1
k
Tabla 3.4: Cuadro de doble entrada para el anlisis de
concordancia.
Ecuaciones 3.2: Estadstico para el anlisis de
concordancia entre dos mtodos de diagnstico.
Tabla 3.5: Significado de los valores k obtenidos en el
anlisis de concordancia.

56

estos oligonucletidos, especficos para cada uno de los parsitos. El fragmento que se
utiliz para la amplificacin pertenece al gen citocromo b, debido a que posee un mayor
nmero de copias que los genes ribosomales (alrededor de 100:1, Buling 2007), por lo
cual este ensayo es altamente sensible.
Para la mezcla de reaccin se utiliz el kit Quantitect Multiplex (Qiagen). La reaccin
optimizada en un volumen final de 20 l, consisti en 10 l de mezcla Quantitect
Mltiplex/ 250 nM de cada sonda/ 0,5 mM de cada cebador/ 5-10 ng de ADN/ 3-8 l de
agua destilada estril. Los volmenes de ADN y agua se ajustaron de forma que cada
reaccin tuviera un mnimo de 5 ng de ADN. Los ensayos se realizaron en un
termociclador ABI 7500 (Applied Biosystems) siguiendo instrucciones de los
fabricantes. Las condiciones utilizadas fueron: 15 min de desnaturalizacin a 95 C,
seguido de 40 ciclos de 95 C por 15 s, y 60 C por 1 min
Los cebadores utilizados se detallan en la Tabla 3.6. La sonda BIP posee una molcula
FAM (carboxifluoresceina) y la sonda BOP una molcula VIC en sus extremos 5 como
fluorsforo diferenciales. Ambas tienen una molcula TAMRA como quencher y una
molcula MGB para mejorar su unin a la secuencia blanco, en su extremo 3.

Gen
amplificado
Cebador Secuencia Tm
Temp. de
hibridacin
cytochrome b
(B. bovis)
BIT-F 5'-ttatgttccaggagatgttga-3' 51,1
o
C
54
o
C BIT-R 5'-cccaacccatattaacctcagt-3' 54,3
o
C
Sonda BIP 5'-FAM-cgaatgtgttatcagagtat-TAMRA-MGB3' -
cytochrome b
(B. bigemina)
BOT-F 5'-tgttcctggaagcgttgattc-3' 47,6
o
C
54
o
C BOT-R 5'-ccaacccatattgacttcagc-3' 53,7
o
C
Sonda BOP 5'-VIC-tgaatgtgtaattagagtgc-TAMRA-MGB3' -


3.12. Reverse Line Blot, RLB
El Reverse Line Blot (RLB) descripto por Gubbels (Gubbes et al., 1999) es capaz de
detectar conjuntamente distintas especies de Theileria y Babesia . El ensayo utiliza una
membrana de nylon a la que se adhieren en distintas lneas paralelas sondas de ADN
especficas para cada una de las especies de parsitos a detectar. La sonda hibridiza en
una region que es variable entre las distintas especies que se quieren analizar. El diseo
de las sondas se hace de tal manera que slo se va a unir a cada sonda el ADN
Tabla 3.6: Nombre y secuencia de los cebadores
especficos para cada especie.

57

perteneciente a una determinada especie de parsito. La regin que se utiliza para este
ensayo es una zona hipervariable del gen ribosomal 18S, la cual se amplifica por PCR,
usando un par de cebadores que hibridizan con regiones flanqueantes, conservadas entre
todos los piroplsmidos. Estos cebadores se encuentran biotinilados, lo que permite la
posterior unin de estreptoavidina unida a peroxidasa, para su revelado por
quimioluminiscencia. Ver figura 3.6.




Debido a la baja parasitemia de B. bovis y B. bigemina encontrada normalmente en
animales de campo, se puso a punto una PCR semi-anidada para la amplificacin de los
fragmentos que hibridizan con las sondas pegadas a la membrana de nylon (Petrigh
2008) . La secuencia de los cebadores se describe en la Tabla 3.7.

Primer Secuencia Tm (C) Bibliografa
RLB-F 5-GAGGTAGTGACAAGAAATAACAATA-3 50.7 Gubbels MJ, et al. 1999
RLB-Fint * Biotina-5-GACAAGAAATAACAATACRGGGC-3 53.1 Schnittger L, et al. 2004
RLB-R2 * Biotina-5-CTAAGAATTTCACCTCTGACAGT-3 52.2 Georges K, et al. 2001

Figura 3.6: Esquematizacin de la tcnica RLB.
Tabla 3.7: Nombre y secuencia de los cebadores para la
PCR semi-anidada.

58


En la primer reaccin se usaron los cebadores RLB-F y RLB-R2 en un volumen de 20
l, usando las concentraciones anteriormente empleadas para la amplificacin de ema-1:
50 mM KCl / 20 mM Tris HCl (pH 8,3) / 1,5 mM MgCl2 / 0,2 mM dNTPs / 0,5 M de
cada cebador / 4 ng de ADN templado / 2 U de Taq ADN polimerasa (Promega) y H
2
O
milli Q hasta llevar al volumen deseado. Las condiciones de ciclado utilizadas fueron:
desnaturalizacin de 3 min a 94 C; 10 ciclos de: 30 seg. a 94 C / 45 seg. a 50 C / 1
min a 72 C; extensin final de 10 min a 72 C. La segunda reaccin de PCR se realiz
en un volumen de 100 l por reaccin y usando los cebadores RLB-Fint y RLB-R2. Las
condiciones de ciclado fueron: desnaturalizacin de 3 min a 94 C; 35 ciclos de: 30 seg.
a 94 C / 45 seg. a 55 C / 1 min a 72 C; extensin final de 10 min a 72 C.
Se utiliz una membrana confeccionada por la Dra. Paula Ruybal (Instituto de
Biotecnologa, CICVyA, INTA-Castelar), a la que se unieron las siguientes sondas de
inters: Babesia bigemina 5-CGTTTTTTCCCTTTTGTTGG-3 (Gubbels MJ, et al.
1999, Tm = 53,2 C), Babesia bovis 5-CAGGTTTCGCCTGTATAATTGAG-3
(Gubbels MJ, et al. 1999, Tm = 58,9 C) y Theileria/Babesia catch-all: 5-
TAATGGTTAATAGGA(AG)C(AG)GTT-3 (Gubbels MJ, et al. 1999, Tm = 52 C).
Esta ltima hibridiza con una regin del fragmento hipervariable del 18S que est
conservada en todas las especies de Theileria y Babesia.
Los 100 l de cada producto de PCR se llevaron a un volumen final de 150 l y una c.f.
de 36 mM NaCl/ 0,2 mM EDTA/SDS 0,1%/ 2 mM NaH
2
PO
4
, pH 7,4. Luego se
desnaturaliz el ADN por calentamiento a 100 C durante 10 min y se coloc el tubo
inmediatamente en hielo. Se lav la membrana a temperatura ambiente durante 5 min en
250 ml SSPE (36 mM NaCl/ 0,2 mM EDTA/ 2 mM NaH
2
PO
4
, pH 7,4)/SDS 0,1% con
agitacin, teniendo la precaucin de manipular la membrana con pinzas en todo
momento. Se ubic la membrana en el miniblotter sobre una almohadilla sinttica, con
las lneas donde se pegaron las sondas en sentido perpendicular a los surcos en los que
se sembrara el producto amplificado. Se cerr el miniblotter y se quit por aspiracin el
buffer residual contenido en el mismo. Se llenaron los surcos con los productos de PCR
diludos, evitando la formacin de burbujas. Se coloc el miniblotter a 42 C en horno
durante 1 hora sin agitacin, para la hibridacin del producto de PCR con las sondas
pegadas a la membrana. Se aspiraron las muestras y se quit la membrana del
miniblotter. Se lav la membrana dos veces con agitacin, en 250 ml de SSPE/ SDS

59

0,5% durante 10 min, una vez a 52 C y la segunda a 42 C. Se coloc la membrana en
una botella de hibridizacin, y se incub con estreptavidina peroxidasa (1:4.000) en
SSPE/ SDS 0,5% durante 1 h a 42 C con rotacin constante en horno de hibridizacin.
Se retir la membrana de la botella de hibridizacin, y se realizaron dos lavados con 250
ml SSPE / SDS 0,5% de 10 min cada uno a 42 C con agitacin. Nuevamente se
realizaron dos lavados con 250 ml SSPE, pero con incubaciones de 5 min cada uno y a
temperatura ambiente con agitacin. Por ltimo, para el revelado se incub la membrana
durante 1 min con 10 ml del reactivo de quimioluminiscencia ECL (Amersham
Biosciences). Se cubri la membrana con un nylon transparente y se expuso la misma a
un film sensible (Hyperfilm- ECL, Amersham) en cuarto oscuro durante 5 a 20 min. El
film fue revelado por exposicin (1 min) a solucin reveladora (Kodak), seguido de
lavado con agua destilada, y exposicin a solucin fijadora (Kodak), y secado al aire.


60

4. Resultados

4.1. Seleccin y produccin de inmungenos
A continuacin se describir la seleccin de polipptidos adecuados de T. equi y B.
caballi para la produccin de formas recombinantes en bacterias, y su utilizacin para el
desarrollo de tests de ELISA indirectos. En el caso de T. equi, se analizaron dos genes
previamente caracterizados por varios autores ema-1 (Knowles 1991, 1992, Xuan 2001,
Cunha 2002) y ema-2 (Ueti 2003, Kumar 2004); as como genes previamente no
estudiados, que fueron identificados en su genoma durante esta Tesis. En el caso de B.
caballi, se utiliz nicamente el gen rap-1, previamente identificado y caracterizado
(Kappmeyer 1999, Ikadai 2002).
Se describir en primer lugar la seleccin de regiones de los genes previamente
estudiados y luego, la identificacin de nuevos genes para T. equi.

4.1.1. Seleccin in silico de regiones en los genes ema-1 y ema-2 de
Theleria equi y rap-1 de Babesia caballi para la produccin de pptidos
recombinantes
Para la expresin de las protenas recombinantes EMA-1 y EMA-2 de T. equi y RAP-1
de B. caballi, se realiz un estudio bioinformtico para la seleccin de las secuencias
ms apropiadas de estos genes para clonar y expresar en bacterias.
A continuacin se mostrar a modo de ejemplo como se realiz el anlisis
bioinformtico de ema-1 de manera de obtener una secuencia polipeptdica ptima que
no dificultase su purificacin, y como se utilizaron estos resultados para el diseo de los
cebadores. Se hizo un estudio similar para ema-2 y rap-1. En primer lugar, se predijeron
el pptido seal y las regiones hidrofbicas de ema-1, para su eliminacin de la
secuencia a amplificar, siempre que esto no significara una disminucin significativa de
regiones predictivamente antignicas.
Se utiliz para este anlisis la secuencia de ema-1 que corresponde a la cepa Brasil
(nmero de acceso: U97167). La razn de esta eleccin es la ubicacin geogrfica en la
que fue obtenida la cepa de la que se extrajo la secuencia, ya que es la ubicacin ms
prxima a la regiones muestreadas en esta Tesis.

61

El marco abierto de lectura de este gen tiene 272 aminocidos. Del anlisis de su
secuencia con el programa SignalP 3.0 se obtuvieron las curvas que se muestran en la
Figura 4.1.







En la figura se observan dos curvas y un diagrama de barras que representan los
distintos valores (scores) que recibe cada aminocido de la protena EMA-1, de acuerdo
a su probabilidad de integrar la secuencia del pptido seal. El alto valor de S para los
primeros 20 aminocidos y el pico observado en el cido glutmico en la posicin 21,
indican que EMA-1 poseera secuencia seal para la exportacin de la protena y que el
punto de corte de este pptido se encontrara entre los aminocidos 20 y 21.
En la Figura 4.2. se observan las predicciones de hidrofobicidad para EMA-1, de
acuerdo al programa ProtScale. Esta protena poseera 4 picos con ndices superiores a
2, los mismos fueron pintados de color azul en la Figura 4.2. El primero de ellos,
ubicado en la regin amino-terminal coincide con la regin predicha para el pptido
seal. Los restantes picos se encuentran en los aminocidos 100, 190, y en la regin
carboxi-terminal.

Figura 4.1: Anlisis predictivo del pptido seal en la
protena EMA-1, utilizando el programa SignalP 3.0.

62





En la prediccin de regin transmembrana que se muestran en las Figuras 4.3, puede
observarse que posee dos regiones transmembrana pintadas en verde, coincidentes con
los picos de hidrofobicidad en las regiones amino- y carboxi- terminal. Se observan
tambin dos picos en los aminocidos 100 y 190, que concuerdan con los picos de
hidrofobicidad, pero no dejan de ser negativos, por lo que no pueden ser considerados
como regiones transmembrana.





Figura 4.3: Nombre y secuencia de los cebadores
especficos para cada gen.
Figura 4.2: Nombre y secuencia de los cebadores
especficos para cada gen.

63

Como consecuencia de este anlisis, se decidi ubicar el cebador delantero, ro abajo de
la regin amino-terminal y el cebador trasero, ro arriba de la regin carboxi-terminal.
De esta manera se estara evitando la expresin de regiones transmembrana hidrofbicas
en la protena recombinante, que podran aumentar la probabilidad de que se formen
cuerpos de inclusin.
Debido a que el gen ema-1 tiene depositadas en el GenBank 19 distintas secuencias
provenientes de distintas cepas y clones de T. equi, se alinearon las mismas para la
bsqueda de polimorfismos y en el caso que lo hubiera, se seleccion la regin ms
conservada para el diseo de los cebadores. Los nmeros de acceso de las secuencias
de ema-1 depositadas en el GenBank son los siguientes: AB043618, DQ250541,
AY058899, AF261824, AF255730, U97168, U97167, AB015235, AB015220,
AB015219, AB015218, AB015217, AB015216, AB015215, AB015214, AB015213,
AB015212, AB015211 y AB015210. Del alineamiento de todas las secuencias
nucleotdicas se encontr una identidad que vari del 99,6% al 91,2%, con un promedio
del 95%, con respecto a la cepa de USDA.
En la Figura 4.4 se grafica la ubicacin final de los cebadores en la secuencia peptdica
y se resumen los datos de los grficos anteriores, de la misma manera en que se
mostrarn los datos para el resto de las protenas.






La protena EMA-2, de 274 aminocidos, al ser parloga de EMA-1 (Ueti, 2003),
obtuvo valores predictivos semejantes para los anlisis de pptido seal, regin
transmembrana y regin hidrofbica, cuando se analiz la secuencia correspondiente a
la cepa USDA (nmero de acceso AB013725). Hay una ligera diferencia en la primera
Figura 4.4: Esquematizacin de la ubicacin de los
cebadores y de la regiones estudiadas en la secuencia
peptdica de EMA-1.

64

regin hidrofbica amino-terminal, que posee una extensin mayor a la de EMA-1. Por
este motivo se decidi desplazar el cebador delantero ro abajo de esta secuencia. Esto
se observa en la Figura 4.5. Se hicieron comparaciones de secuencias en un
alineamiento entre las cepas USDA y FLORIDA. La identidad entre ambas cepas fue de
95,1 %, habiendo nicamente una diferencia de un solo nucletido en la regin donde se
disearon los dos cebadores.






En el caso de RAP-1 de B. caballi, se analiz la secuencia de la cepa X6 de 1467 nt
(nmero de acceso: AF092736). Del anlisis hecho con su secuencia de aminocidos se
obtuvieron los valores predictivos mostrados en la Figura 4.6. A pesar de la longitud de
la protena solo se encontraron predictivamente dos regiones de transmembrana y solo
dos regiones hidrofbicas. Este resultado facilit mucho la seleccin de los cebadores,
solo teniendo que adelantar el cebador delantero ro abajo del pptido seal.



Figura 4.5: Esquematizacin de la ubicacin de los
cebadores y de la regiones estudiadas en la secuencia
peptdica de EMA-2.
Figura 4.6: Esquematizacin de la ubicacin de los
cebadores y de la regiones estudiadas en la secuencia
peptdica de RAP-1.

65

4.1.2. Bsqueda de genes de T. equi codificantes para posibles nuevos
antigenos de diagnstico
Se realiz una bsqueda bibliogrfica para seleccionar una serie de genes de Theileria
parva y T. annulata codificantes para posibles candidatos de diagnstico (Tabla 4.1)


Nombre de la protena Organismo
N de acceso en
el GenBank
Ref.
P23 23-kDa Piroplasm Membrane Protein
Theileria parva

TP02_0551

Sporozoite Surface Molecule Protein TP02_0174

32 kDa Surface Antigen TP01_1056

AMA-1, Apical Membrane Antigen TP01_0650

P150, Microsphere Antigen TP01_0650

PCNA, Proliferating Cell Nuclear Antigen TP03_0861

RBP, Reticulocyte Binding Protein TP03_0445

TP1, Protena Hipottica XP_762973

TP2, Protena Hipottica XP_765583

TP8, Cysteine Proteinase XP_764709

Sporozoite Surface Antigen Theileria
annulata
AAA30134

TASP, Theileria Annulata Surface Protein CAC87574





Las secuencias de aminocidos de estas protenas fueron analizadas por tBLASTn en el
genoma de Theileria equi, cepa USDA. Las que obtuvieron mayor Score (Bits) fueron:
TP2, TP8 y TASP con valores de 95,9, 441 y 87,8 respectivamente. Estas secuencias
fueron nombradas TE2, TE8 y TESP, correspondientemente.
A partir de las secuencias nucleotdicas identificadas en el genoma de T. equi, se busc
el ORF correspondiente a cada gen. Para esto se tradujeron los seis marcos de lectura
posibles de cada secuencia y se los aline con el gen correspondiente de T. parva o T.
annulata, y se eligi el marco de lectura con mejor alineamiento. Para TE2 y TE8 se
encontraron las secuencias correspondientes con facilidad, ya que no poseen intrones
(Graham., 2006).
En la Figura 4.7 se muestra el alineamiento de las secuencias predichas de aminocidos
de TE2 y TP2, ambas de 167 aminocidos. Se encontr una similitud de 17 % y una
Tabla 4.1: Informacin de las secuencias analizadas
por tBLASTn en el genoma de Theileria equi.

66

identidad de 11 %. Asimismo, por BLAST reciproco se comprob que TE2 y TP2 son
ortlogas.

TE2 1 MVSSITALTSLISFIAATMVACDGKCGEGDLKTLGMVKVDGDEAQLKALFKTTAIMSHVG
TP2 1 MKLAARLISLYFIIYILHSPVLGGNCSHEELKKLGMLEGDGFDRDALFKSSHGMGKVGKR

TE2 61 QHFGKKAGDQSVDLYSKYLGQLLGQFGVQGVDAGCVSCFAESVKCSVKNCKVACMNDSCA
TP2 61 YGLKTTPKVDKVLADLETLFGKHGLGGISKDCLKCFAQSLVCVLMKCRGACLKGPCTDDC

TE2 121 AGCVKCFEKNCKPALSDCVGGVDLDTHCRDKTNFKKFKLSQTPKGPE
TP2 121 QNCFDRNCKSALLECIGKTSIPNPCKWKEDYLKYKFPETDEDESTKK





De igual manera se obtuvo el alineamiento para la protena predicha TE8 con la protena
TP8, que se muestra en la figura 4.8.a y 4.8.b. La similitud encontrada fue del 60 % y la
identidad del 48 %. Por BLAST reciproco se comprob que estas protenas tambin son
ortlogas.


TP8 1 MLGNHVMGSNSPHIKILSSVTFLHIAKMEEVENVKVDALERVDTESVLNYDTVLEKKPLR
TE8 1 ---------------------------MEEIEVVKHDPVERTDTEATLCDDIKIQKNARR


TP8 61 SSVASFFKRYSAVLVILTAVLLFTFTFAAIALSSGRSAIRKNRELLSVEFEKLQFDNFVT
TE8 34 ATILAFCKRYSALIIASVSSVLFIITFVAIALSSGSATITKNKAILVEAFKNIPFVNHVT


TP8 121 IKGEREEDFPKMVAEVLYKVAVEFDPKEEALIYVQFNDFNKQHDKKHNNYRHKKTSYTNF
TE8 94 IEGCEEEDYPLLIAEVMHYTAIQFDADEEAATYVEFNSFNEKYNKKHTSWKHKKQCFINF


TP8 181 RNNLNDINEHNAKPNLSYTKNMNHFGDISSKDFMKRYTKKVLLNLPKDHVS-TYNNNRPM
TE8 154 RGNVSSINEHNAREDKTFTKEMNHMGDLSAKEFLDRYTKKVEIQFPEVPANHAWNNVRPM


TP8 240 SVDLRSHGVLTPVKCQEENELSWPYSVVAVAESFVKKTSQKTVSLSEKQLVDCVTDKKS-
TE8 214 ALDLRKRDFMTPVKDQGEFGCSWAYSATAIAESYHKYNRNIDISLSEKQLIDGVKESGST


TP8 299 -ANNPFLGYKYLKDLGLFESELVDKSTTKCPALEGERFKVPSYSYSYEPDLVALLLNAGP
TE8 274 PVNNPFLGYKYIKDLGLVESSTYETDVEITDAP---RYTIGSYSYTFNPDLVSLLFNSGP





Figura 4.7: Alineamiento entre las protenas predichas
TE2 y TP2 de T. equi. y T. parva respectivamente
Figura 4.8.a: Alineamiento entre las protenas TE8 y
TP8 de T. equi. y T. parva respestivamente

67



TP8 358 LTVPVAVSEDWQFYADGTLDVCGAELNHFLTLVGVSFDEKGNHWILKNSFGEGWGNKGYL
TE8 331 LTIAVSVSEDWQFYKSGTINKCGAELNHFVTLVGVGFDRESNYWIIKNSFGAEWGDDGYI


TP8 418 LLTRNSKEYKDDCGLTSFAVYAV
TE8 391 KLLRGNPEEADDCGVASFAMYSV







TP8 tiene 440 aminocidos, mientras que TE8 tiene 413, con una secuencia de 27
aminocidos faltante, ya que no posee el mismo codn de iniciacin que TP8.
El anlisis de la secuencia identificada en el genoma de T. equi que mostr similitud
con TASP fue un poco ms complejo, debido a que esta protena posee dos pequeos
intrones en su secuencia (Schnittger 2002). Para determinar la secuencia correcta del
exn en la secuencia analizada en el genoma de T. equi, se utiliz el programa FEX del
sitio SoftBerry. El ORF completo de TASP tiene 315 aminocidos y el ORF
identificado en T. equi que tiene homologa con esa secuencia 119. Cuando se realiza el
alineamiento de estas secuencias, solo se encuentra similitud en el tercer exn de la
protena, correspondiente a la regin carboxi terminal. No se encontr similitud en el
resto de la secuencia correspondiente al primer y segundo exon de TASP en ninguna
regin de la secuencia de aminocidos. La similitud encontrada entre la secuencia
aminoacdica del tercer exn y la regin equivalente de TASP fue del 57 % y la
identidad del 38 %. Al tercer exn de T. equi se lo denomin TESP. El alineamiento
entre TESP y la regin correspondiente de TASP se muestra en la Fig. 4.9.


TESP 1 PCIKNMREQFRNRMLKKYVGGPFVSHLLLFMIALFTYILDFMIMLIIMGFNVGVFISITA
TASP 1 PCLKAYREVLRAKAIRSFIFDCFLTHLFLFLIAFCAYALDFLLMLVVMTFNVGVFFAVIT

TESP 61 GYAAGYVLSS---PTICKHNMLQSDIEYAHTECH
TASP 61 GYTVGYLVSSLAYSTLRSHPARSSSFSRINEDCC




Figura 4.9: Alineamiento de TESP de T. equi con una regin de
TASP de T. parva
Figura 4.8.b: Alineamiento entre las protenas TE8 y
TP8 de T. equi. y T. parva respestivamente

68

Cuando se hizo BLAST con TESP en el genoma de T. annulata se encontr que era
ortloga de TASP y que adems tiene un alto grado de similitud con una familia de
protenas transportadoras de cobre llamadas protenas Ctr (Puig 2002).
Cuando se hizo un anlisis de TESP en busca de regiones antignicas con el programa
Bepipred Linear Epitope Prediction se encontr un alto valor de antigenicidad a lo largo
de casi toda la secuencia (Figura 4.10).





En base a este anlisis de antigenicidad, se decidi incluir a este pptido dentro de las
secuencias a expresar en la bsqueda de antgenos de T. equi.
De igual manera que se hizo con las protenas EMA-1, EMA-2 y RAP-1 se busc
dentro de las secuencias de TE2, TE8 y TESP, las regiones ms convenientes para
expresar en bacterias.
La figura 4.11 muestra que la protena TE2 tendra en su regin amino-terminal una
secuencia predictiva de pptido seal, coincidentemente positiva para una regin
hidrofbica y de transmembrana. Se observan tambin tres regiones hidrofbicas
adicionales. Debido a que la tercera regin hidrofbica posee una longitud importante
(50 amino cidos), se decidi disear los cebadores de manera de solo excluir la primer
regin hidrofbica.

Figura 4.10: Antigenicidad predicha por el programa
Bepipred Linear Epitope Predictio para el exn TESP

69





El anlisis predictivo de la protena TE8 se muestra en la Figura 4.12. No se observ
presencia de pptido seal. En el anlisis de regin transmembrana, se predijo una
secuencia de este tipo entre los aminocido 30 y 60. Tambin se encontraron pequeos
fragmentos de regiones hidrofbicas distribuidos a lo largo de la secuencia. Se pens en
un primer momento disear un cebador ro abajo de la regin de transmembrana para
excluirlo de la amplificacin por PCR, pero luego de un anlisis de antigenicidad
(Figura 4.13) se encontr que esa supuesta regin de transmembrana se corresponda
con la regin ms antignica de la secuencia, por lo que se decidi incluirla en la
secuencia a amplificar.





Figura 4.11: Esquematizacin de la ubicacin de los
cebadores y de la regiones estudiadas en la secuencia
peptdica de TE2.
Figura 4.12: Esquematizacin de la ubicacin de los
cebadores y de la regiones estudiadas en la secuencia
peptdica de TE8.

70






Por ltimo el resultado de los anlisis de prediccin para regin hidrofbica y de regin
transmembrana para el exn TESP se muestra en la Figura 4.14. Tambin se incluye el
dominio correspondiente a la familia de protenas Ctr. Igual que en el caso de TE8 se
encontr que este pptido posea un valor antignico alto (Figura 4.15), por lo que
tambin se incluyo entre las protenas a expresar. Para el diseo de los cebadores, no se
tuvieron en cuenta estos anlisis debido al tamao tan pequeo del fragmento, de
manera que se amplific el exn entero.







Figura 4.13: Antigenicidad predicha por el programa
Bepipred Linear Epitope Predictio para TE8.
Figura 4.14: Esquematizacin de la ubicacin de los cebadores
y de la regiones estudiadas en la secuencia peptdica de TESP.

71








4.1.3. Produccin de formas recombinantes de los antgenos
seleccionados
En esta seccin se describir la produccin de formas recombinantes de las protenas
EMA-1, EMA-2, TE2, TE8 y TESP de T. equi. y la seleccin de uno de ellos para su
purificacin. Paralelamente se describir la forma en que se produjo y purific RAP-1
de B. caballi.

4.1.3.1. Amplificacin por PCR de los genes de inters
Como se explic en la seccin 3.2, se parti tanto para los genes de T. equi como el de
B. caballi de ADN extrado de animales experimentalmente infectados con estos
parsitos. Con el ADN de T. equi, se amplificaron por PCR fragmentos
correspondientes a los genes ema-1, ema-2, te2, te8 y tesp siguiendo el protocolo
descripto en la seccin 3.4.1. Estos fragmentos corresponden a las regiones descriptas
en la seccin 4.1.1. Los productos de amplificacin fueron corridos en un gel de
electroforesis 0,8 % de agarosa. En la Figura 4.16 pueden observarse los productos de
amplificacin pertenecientes a los genes ema-1 y ema-2 con un tamao de 687 y 615 pb
respectivamente.
Figura 4.15: Antigenicidad predicha por el programa
Bepipred Linear Epitope Predictio para TESP.

72

750 pb
1 kb
500 pb
250 pb
Controles
negativos




La amplificacin de los fragmentos pertenecientes a los genes te2 y te8 se pueden
apreciar en la Figura 4.17. Las bandas de estos dos genes tienen un tamao de 441 y
1224 pb respectivamente. El marcador de tamao molecular no fue el mismo que se
utiliz para el resto de los geles, en esta oportunidad se utiliz el marcador 1kb de
Invitrogen.
Controles
negativos
1224 pb
440 pb




El fragmento perteneciente a la amplificacin de tesp se observa en la Figura 4.18. El
tamao de la banda es de 273 pb.
Figura 4.16: Gel de agarosa al 0,8% con los productos de
amplificaciones ema-1 y ema-2. MTM: marcador de tamao de ADN
Figura 4.17: Gel de agarosa al 0,8% con los productos de
amplificaciones te2 y te8. MTM: marcador de tamao de ADN

73


750 pb
1 kb
500 pb
250 pb
1,5 kb
2 kb




A partir de ADN de B. caballi, se amplific por PCR el gen rap-1 de 1387 pb. En la
Figura 4.19 se puede apreciar una calle con el producto de amplificacin del tamao
esperado.



Figura 4.19.: Gel de agarosa al 0,8% con los productos de
amplificacin de rap-1 MTM: marcador de tamao de ADN
Figura 4.18: Gel de agarosa al 0,8% con el producto de amplificacin de
tesp. MTM: marcador de tamao de ADN

74


4.1.3.2. Clonado y seleccin de clones recombinantes
Estos productos de amplificacin fueron insertados en el vector de expresin procariota
pBAD/thio-TOPO (Invitrogen). Por shock trmico se transformaron clulas
competentes Top 10 y se rastrillaron en una placa de LB agar durante 24 horas. Por
medio de una colonia-PCR se seleccionaron las colonias que posean la correcta
direccin del inserto. En las Figuras 4.20 a 4.25 se muestran geles de agarosa al 0,8 %
con los productos de amplificacin de las colonias-PCR de las transformaciones con los
genes ema-1, ema-2, te2, te8, tesp y rap-1. En todos ellos se indican con flechas los
productos de amplificacin de las colonias positivas. La ltima calle de cada gel
corresponde al control negativo de la PCR.









Figura 4.20.: Gel de agarosa al 0,8% con una colony PCR para
ema-1. Las flechas indican dos colonias positivas
Figura 4.21.: Gel de agarosa al 0,8% con una colony PCR para
ema-2. La flecha indica una colonia positiva.

75
























Figura 4.25.: Gel de agarosa al 0,8% con una colony PCR para rap-1.
Las flechas indican cuatro colonias positivas.
Figura 4.22.: Gel de agarosa al 0,8% con una colony PCR para te2.
Las flechas indican dos colonias positivas.
Figura 4.23.: Gel de agarosa al 0,8% con una colony PCR para te8.
Las flechas indican dos colonias positivas.
Figura 4.24.: Gel de agarosa al 0,8% con una colony PCR para tesp.
La flecha indica una colonia positiva.

76


4.1.3.3. Induccin de la expresin de las protenas recombinantes
Las colonias positivas obtenidas en el paso anterior fueron crecidas e inducida la
expresin de las protenas recombinantes con arabinosa. Se analizaron los patrones de
bandas de lisados bacterianos por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia
de SDS (SDS-PAGE), teidos con Coomassie blue. De esta manera se seleccionaron los
clones que expresaban las protenas. En la Figura 4.26 se muestra una colonia positiva,
que expresa la protena EMA-1.





Se observ una banda mayoritaria de un peso aproximado de 48 kDa de acuerdo a la
comparacin con el marcador de peso molecular. A pesar que este peso es ligeramente
mayor que el esperado (39 kDa), se comprob que la banda corresponda a la protena
recombinante expresada, dado que se obtuvo reaccin con una banda del mismo tamao
cuando se hizo un Western blot con anticuerpo anti-histidina conjugado a peroxidasa,
que reconoce las histidinas agregadas en el extremo carboxi-terminal de las protenas
producidas en el sistema utilizado (Fig. 4.27). Claramente puede observarse una muy
buena expresin de la protena EMA-1.
Figura 4.26.: Gel de poliacrilamida al 12% con el extracto inducido y no inducido
de una colonia que expresa la protena EMA-1. La flecha seala la banda
correspondiente a la protena. MPM: marcador de peso molecular

77

70 kDa
40 kDa
35 kDa
55 kDa
M
P
M
S
i
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
C
o
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
70 kDa
40 kDa
35 kDa
55 kDa
M
P
M
S
i
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
C
o
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a




En la Figura 4.28 se muestra una colonia que expresa la protena EMA-2.






Como en el caso de EMA-1, se observa una abundante produccin de EMA-2.
En las Figuras 4.29 a 4.31 se observa la expresin de las protenas recombinantes TE2,
TE8 y TESP, respectivamente.



Figura 4.28.: Gel de acrilamida al 12% con el extracto inducido y no
inducido de un clon recombinante para EMA-2. La flecha indica la banda
correspondiente a la protena.
Figura 4.27.: Western blot con el extracto inducido y no inducido de un
clon recombinante para EMA-1, marcado con un anticuerpo anti-histidina.
La flecha indica la banda correspondiente a la protena.

78

40 kDa
35 kDa
55 kDa
M
P
M
25 kDa
15 kDa
- + -
1 2
+
40 kDa
35 kDa
55 kDa
M
P
M
25 kDa
15 kDa
- + -
1 2
+




70 kDa
55 kDa
M
P
M
S
i
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
C
o
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
100 kDa
35 kDa
70 kDa
55 kDa
100 kDa
35 kDa
M
P
M
S
i
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
C
o
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
70 kDa
55 kDa
M
P
M
S
i
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
C
o
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
100 kDa
35 kDa
70 kDa
55 kDa
M
P
M
S
i
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
C
o
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
100 kDa
35 kDa
70 kDa
55 kDa
100 kDa
35 kDa
M
P
M
S
i
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
C
o
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
70 kDa
55 kDa
100 kDa
35 kDa
M
P
M
S
i
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
C
o
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a




40 kDa
25 kDa
35 kDa
M
P
M
S
i
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
C
o
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
15 kDa
55 kDa
70 kDa
40 kDa
25 kDa
35 kDa
M
P
M
S
i
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
C
o
n

A
r
a
b
i
n
o
s
a
15 kDa
55 kDa
70 kDa



Figura 4.29.: Gel de acrilamida al 12% con el extracto inducido y no
inducido de dos clones recombinantes para TE2. La flecha indica la banda
correspondiente a la protena.
Figura 4.30.: Gel de acrilamida al 12% con el extracto inducido y no
inducido de un clon recombinante para TE8. Las flechas indican la banda
correspondiente a la protena.
Figura 4.31.: Gel de acrilamida al 12% con el extracto inducido y no
inducido de un clon recombinante para TESP. La flecha indica la banda
correspondiente a la protena.

79

En el caso de la protena RAP-1, la expresin no fue lo suficientemente alta como en los
casos anteriores. Sin embargo, se observ un patrn de banda diferente en el extracto
del cultivo inducido de la colonia nmero 3 (recuadro rojo en Figura 4.32).




Se analiz esta ltima colonia por medio de un Western blot usando un anticuerpo anti-
histidina. En la Figura 4.33 se muestra el reconocimiento por este anticuerpo de una
banda del tamao esperado para esta protena.






Figura 4.32.: a. Gel de poliacrilamida al 12% con el
extracto inducido y no inducido de tres colonias
transformadas con el gen RAP-1.
Figura 4.33: Western blot con anticuerpo anti-histidina para
bacterias inducidas y no inducidas del clon 3 de la figura anterior. La
flecha indica la banda correspondiente a la protena.

80

4.1.3.4. Anlisis de las secuencias obtenidas
Con las colonias de bacterias que fueron positivas a las inducciones, se inici un cultivo
de 2 ml ON para la purificacin de los plsmidos y su posterior envo para su
secuenciacin. De esta manera se confirm que los insertos correspondieran a las
secuencias deseadas y que se encontraran en marco de lectura con el vector.
Por medio del programa ClustalW1.8, se realiz un alineamiento mltiple de las
secuencias aminoacdicas obtenidas, con secuencias ya publicadas en el GenBank.
Para diferenciar a nuestra secuencia del resto le pusimos de nombre cepa Argentina. Se
muestra en las Figuras 4.34.a y 4.34.b el alineamiento del gen ema-1 cepa Argentina,
con 22 secuencias conocidas hasta la actualidad.


Argentina 1 --------------------EEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
Brasil 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
Brasil 2 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESINHITIDKQSE-EHVVYTAHEGFAVEKVKEGDSVIKTFDLKEHTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
USDA 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESINHITIDKQSE-EHVVYTAHEGFAVEKVKEGDSVIKTFDLKEHTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
Florida 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
Florida-JRA 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESINHITIDKQSE-EHVVYTAHEGFAVEKVKEGDSVIKTFDLKEHTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
Jaboticabal 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESINHITIDKQSE-EHVVYTAHEGFAVEKVKEGDSVIKTFDLKEHTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
Morocco 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
Russia 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
E12 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
E15 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESINHITIDKQSE-EHVVYTAHEGFAVEKVKEGDSVIKTFDLKEHTPKAVVRHIKDNKPYVVIA
D-31 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEEPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
D-16 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLDSIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIRTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
D-8 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
VRY-5 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
VRY-2 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
VRY-4 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDRQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
CA 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
LR 1 MISKSFAFVFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHVTIDKQSE-EHIVYTAHEGYAVEKVKEGDSVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
212 1 MISKSFAFIFASIAISSILAEEEKPKAAGAVVDFQLESIDHITIDKQSE-EHIVYTAQEGFAIEKVKDGASVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
Q-1 1 MISKSFAFIFASIAISSILAEEEKPKASGAVVDFQLESIDHITIDKQSE-EHVVYTAHEGFAVEKVKEGDSVIKTFDLKEHTPKTVVRHIKDNKPYVVIA
Q-6 1 MISKSFAFIFASIAISSILAEEEKPKVAGAVVDFQLESIDHVTIDKQSDGSHIVYTAHEGFAIEKIKDGESVIKIFDLKENTPKTVVRHIKDSKPYVVIA
H-25 1 MISKSFAFIFASIAISSILAEEEKPKAAGAVVDFQLESIDHITIDKQSD-EHIVYTAQEGFAIEKVKDGASVIKTFDLKEQTPKTVVRHIKDNKPCVVIA


Argentina 80 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSGDNKVA
Brasil 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSGDNKVA
Brasil 2 100 VESALHLVLHKDGDKWVELDVADFYQEVLFKGFESISVDLAAEISDKFTETTFGSGKKHIFKAPGKRVLKVVDGKNELIDGENEVVLDLELFVSGDKKVA
USDA 100 VESALHLVLHKDGDKWVELDVADFYQEVLFKGFESISVDLAAEISDKFTETTFGSGKKHIFKAPGKRVLKVVDGKNELIDGENEVVLDLELFVSGDKKVA
Florida 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSSDNKVA
Florida-JRA 100 VESALHLVLHKDGDKWVELDVADFYQEVLFKGFESISVDLAAEISDKFTETTFGSGKKHIFKAPGKRVLKVVDGKNELIDGENEVVLDLELFVSGDKKVA
Jaboticabal 100 VESALHLVLHKDGDKWVELDVADFYQEVLFKGFESISVDLAAEISDKFTETTFGSGKKHIFKAPGKRVLKVVDGKNELIDGENEVVLDLELFVSGDKKVA
Morocco 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSGDNKVA
Russia 100 VESALHLVLKKDGDKWVELDVADFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSGDKKVA
E12 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSGDNKVA
E15 100 VESALHLVLHKDGDKWVELDVADFYQEVLFKGFESISVDLAAEISDKFTETTFGSGKKHIFKAPGKRVLKVVDGKNELIDGENEVVLDLELFVSGDKKVA
D-31 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSGDNKVA
D-16 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSGDSKVA
D-8 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGETELIDGDNEVVLDLELFVSGDNKVA
VRY-5 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSGDNKVA
VRY-2 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAASDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSSDNKVA
VRY-4 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSGDNKVA
CA 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSSDNKVA
LR 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEVAEFYQEVLFKGFEAVSVDLAAAVSDKFTETTFGSGKKHTFKAPGKRVLKVVDGKTELIDGDNEVVLDLELFVSGDNKVA
212 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEAAEFYETVLFKGFESISVDLAAEVSDKFAETAFGTGKKHTFKAPGKRVLKIVDGKEELINGENEVVLDLELFISGDKKVA
Q-1 100 VESALHLVLKKDGDKWVELDVADFYQEVLFKGFESISVDLAAEISDKFTETTFGSGKKHIFKAPGKRVLKVVDGKNELIDGDNEVVLDLELFVSGDKKVA
Q-6 101 VESALHLVLHKDGDKWVELGVADFYETILFKGFEAIRCRLAAEISDKFTESAFGSGKKHTFKAPNKRVSKVLDDKKELVDGDKEVILDLEIFVSGDKKIA
H-25 100 VESALHLVLKKDGDKWVELEPAEFYETVLFKGFESISVDLAAEVSDKFAETAFGTGKKHTFKAPGKRVLKIVDGKEELINGENEVVLDLELFISGDKKVA















Figura 4.34.a: Alineamiento con el programa ClustalW1.8 de las secuencias de
aminocidos de ema-1 de Argentina con secuencias obtenidas del GenBank

81





Argentina 180 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVV-----------------------
Brasil 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
Brasil 2 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKVWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
USDA 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKVWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
Florida 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGALLAVAAIAFSTLFY
Florida-JRA 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKVWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
Jaboticabal 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKVWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
Morocco 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
Russia 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGALLAVAAIAFSTLFY
E12 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
E15 200 GVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKVWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
D-31 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVRDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
D-16 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
D-8 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
VRY-5 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGALLAVAAIAFSTLFY
VRY-2 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
VRY-4 200 RIVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGALLAVAAIAFSTLFY
CA 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
LR 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKAWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
212 200 RLVYLYKGDGRIKEIFFQLVEKAWKRVEVKEAAETLHGINNSFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
Q-1 200 RVVYLYKGDGRIKEIFLKLVEKVWKRVEVKDAAETLHGINSTFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
Q-6 201 RVVYLYKGDSRIKEIFFKLVDKAWKRVEVKDAAETLHSINSTFPSDYKTVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY
H-25 200 RLVYLYKGDGRIKEIFFQLVEKVWKRVEVKEAAETLHGINNSFPADYKVVYDGFSVYGAFLAVAAIAFSTLFY



A continuacin se muestra una tabla donde se informa la similitud y la identidad de
cada una de las secuencias, con respecto a la cepa Argentina (Tabla 4.2).
cepa/aislamiento similitud identidad cepa/aislamiento similitud identidad
Brasil 100,0 100,0 D-16 99,6 98,7
Morocco 100,0 100,0 VRY-2 99,1 99,1
E12 100,0 100,0 Q-1 96,9 93,9
VRY-5 100,0 100,0 Brasil-2 96,1 92,6
LR 100,0 100,0 USDA 96,1 92,6
VRY-4 100,0 99,1 Florida-JRA 96,1 92,6
Florida 99,6 99,6 Jaboticabal 96,1 92,6
D-8 99,6 99,6 E15 95,2 91,7
CA 99,6 99,6 212 93,0 87,8
D-31 99,6 99,1 H-25 92,1 86,5
Russia 99,6 98,7 Q-6 89,1 81,2





A partir del anlisis del alineamiento de todas las secuencias, se pudo observar que la
cepa Argentina mostr un 100% de identidad con las cepas Brasil, Morocco, E12,
VRY-5 y LR. En promedio tiene una identidad de 95,7 % y una similitud del 97,6 %
con todas las secuencia. Este dato sera un aporte ms a la confirmacin de que la
secuencia de EMA-1 est conservada entre cepas (Cunha 2002). En la Figura 4.35 se
muestra el alineamiento entre la secuencia de aminocidos de la cepa Argentina de
Figura 4.34.b: Alineamiento con el programa ClustalW1.8 de las secuencias de
aminocidos de ema-1 de Argentina con secuencias obtenidas del GenBank
Tabla 4.2.: Datos de similitud e identidad entre las secuencias de aminocidos
conocidas de EMA-1 y la secuencia correspondiente a la cepa Argentina.

82

EMA-2, con las correspondientes a las cepas USDA y Florida.


Arg 1 ---------------------------------------------------KVVYTAHSG
USDA 1 MLSKSFAGVFALAYLAVSGIFADEAPKVSGAVVTLGATTIDHVTVDDTTAGKVVYTAHSG
Florida 1 MLSKSFAGVFTLAYLAVSGIFADEAPKVSGAVVTLGATTLDHITVDDTTAGKVVYTAHSG


Arg 10 FAVEKVVDGDKVVKAFDLKVHAPRSVTTHLKEGKLYLTVCVVPALHLAFKKDGDAWVEMP
USDA 61 FAVEKVVDGDKVVKAFDLKVDAPRSVTTHLKEGKLYLTVCVVPALHLAFKKDGDAWVEMP
Florida 61 YAVEKVVDGDKVVKAFDLKVDAPRSVTTHLKEDKHYLTVCVVPALHLAFKKEGDAWVEMP


Arg 70 LADLYEQVLFKGREEVVGDLDKHEDSALFGSEAFGSGKKHTFTATNKKISKVAFGDHVLV
USDA 121 LADLYEQVLFKGREEVVGDLDKHEDSALFGSEAFGSGKKHTFTATNKKISKVAFGDHVLV
Florida 121 LADLYEQVLFKGREEVVGDLDKHEDTALFGSEAFGSGKKHTFTATGKKISKVTFGDHVLV


Arg 130 DGGYEVFLGLTVYAHGDKKVATVWYLYKPDARIKEIFFEKAGDAWVRVDVTAAAKILNGM
USDA 181 DGGYEVFLGLTVYAHGDKKVATVWYLYKPDARIKEIFFEKAGDAWVRVDVTAAAKILNGM
Florida 181 DGSYEVFLGLTVYAHGDKKVATVWYLYKPDARIKEVFFEKAGDSWVRVDVTAAAKILNGI


Arg 190 NSSFSADYKTQYDGFS------------------
USDA 241 NSSFSADYKTQYDGFSVYGVFSAVAVVFAVALFY
Florida 241 NPSFSADYKTQYDGFSVYGVFSAVAVVFAVALFY








En la Tabla 4.3 se informa los valores de similitud e identidad obtenidos para EMA-2.



cepa similitud identidad
USDA 99,5 99,5
Florida 96,6 94,1



En las Figura 4.36.a y 4.36.b se observa el alineamiento de la secuencia de aminocidos
del fragmento clonado a partir de la cepa argentina y la secuencia encontrada en el
genoma.

TE2Argent 1 --------------------ACDGKCGEGDLKTLGMVKVDGDEAQLKALFQTTAIMSHVG
TE2Genoma 1 MVSSITALTSLISFIAATMVACDGKCGEGDLKTLGMVKVDGDEAQLKALFKTTAIMSHVG






Figura 4.35: Alineamiento con el programa ClustalW1.8 de la secuencia clonada
de ema-2 y las secuencias obtenidas del Gen Bank de la cepa USDA y Florida.
Tabla 4.3: Datos de similitud e identidad entre las secuencias de
aminocidos de las cepas USDA y Florida de EMA-2 y la secuencia
correspondiente a la cepa Argentina.
Figura 4.36.a: Alineamiento con el programa ClustalW1.8 de la secuencia clonada
de TE2 y la secuencia perteneciente al genoma de T. equi.

83



TE2Argent 41 QHFGKKAGDQSVDLYSKYLGQLLGQFGVQGVDAGCVSCFAESVKCSVKNCKAACMNDSCA
TE2Genoma 61 QHFGKKAGDQSVDLYSKYLGQLLGQFGVQGVDAGCVSCFAESVKCSVKNCKVACMNDSCA



TE2Argent 101 AGCVKCFEKNCKPALSDCVGGVDLDTHCRDKTNFKKFKLSQTPKGPE----------
TE2Genoma 121 AGCVKCFEKNCKPALSDCVGGVDLDTHCRDKTNFKKFKLSQTPKGPE----------







Como puede observarse la secuencia argentina est muy conservada cuando se la
compara con la secuencia del genoma, solo present dos mutaciones en los 146
aminocidos secuenciados. La similitud obtenida entre ambas secuencias fue de 99,3 %
y una identidad de 98,6 %
En las Figura 4.37 se muestra el alineamiento de la secuencia de aminocidos de la
protena TE8. En la misma se puede observar una similitud e identidad del 100 %.

Argentina 1 -----------------------------EIEVVKHDPVERTDTEATLCDDIKIQKNARRATILAFCKRYSALIIASVSS
TE8Genoma 1 ---------------------------MEEIEVVKHDPVERTDTEATLCDDIKIQKNARRATILAFCKRYSALIIASVSS


Argentina 52 VLFIITFVAIALSSGSATITKNKAILVEAFKNIPFVNHVTIEGCEEEDYPLLIAEVMHYTAIQFDADEEAATYVEFNSFN
TE8Genoma 54 VLFIITFVAIALSSGSATITKNKAILVEAFKNIPFVNHVTIEGCEEEDYPLLIAEVMHYTAIQFDADEEAATYVEFNSFN


Argentina 132 EKYNKKHTSWKHKKQCFINFRGNVSSINEHNAREDKTFTKEMNHMGDLSAKEFLDRYTKKVEIQFPEVPANHAWNNVRPM
TE8Genoma 134 EKYNKKHTSWKHKKQCFINFRGNVSSINEHNAREDKTFTKEMNHMGDLSAKEFLDRYTKKVEIQFPEVPANHAWNNVRPM


Argentina 212 ALDLRKRDFMTPVKDQGEFGCSWAYSATAIAESYHKYNRNIDISLSEKQLIDGVKESGSTPVNNPFLGYKYIKDLGLVES
TE8Genoma 214 ALDLRKRDFMTPVKDQGEFGCSWAYSATAIAESYHKYNRNIDISLSEKQLIDGVKESGSTPVNNPFLGYKYIKDLGLVES


Argentina 292 STYETDVEITDAPRYTIGSYSYTFNPDLVSLLFNSGPLTIAVSVSEDWQFYKSGTINKCGAELNHFVTLVGVGFDRESNY
TE8Genoma 294 STYETDVEITDAPRYTIGSYSYTFNPDLVSLLFNSGPLTIAVSVSEDWQFYKSGTINKCGAELNHFVTLVGVGFDRESNY


Argentina 372 WIIKNSFGAEWGDDGYIKLLRGNPEEADDCGVASFAM---
TE8Genoma 374 WIIKNSFGAEWGDDGYIKLLRGNPEEADDCGVASFAMYSV






En la Figura 4.38 se aprecia el alineamiento de la secuencia TESP con la regin
ortloga de TASP. Tambin se encontr que la similitud e identidad entre ambas
secuencia es del 100 %.



Figura 4.37: Alineamiento con el programa ClustalW1.8 de la secuencia clonada
de TE8 y la secuencia perteneciente al genoma de T. equi.
Figura 4.36.b: Alineamiento con el programa ClustalW1.8 de la secuencia clonada
de TE2 y la secuencia perteneciente al genoma de T. equi.

84


Argentina 1 PCIKNMREQFRNRMLKKYVGGPFVSHLLLFMIALFTYILDFMIMLIIMGFNVGVFISITAGY
TESPgenoma 1 PCIKNMREQFRNRMLKKYVGGPFVSHLLLFMIALFTYILDFMIMLIIMGFNVGVFISITAGY


Argentina 63 AAGYVLSSPTICKHNMLQSDIEYAHTECH
TESPgenoma 63 AAGYVLSSPTICKHNMLQSDIEYAHTECH








Por ltimo se muestra en la Figura 4.39 el alineamiento de la secuencia de RAP-1 del
aislamiento de B. caballi de Argentina con las correspondientes secuencias de las cepas
USDA-Z6 y Puerto Rico. En la Tabla 4.4 se muestran los valores de similitud e
identidad. No se tuvieron en cuenta para este alineamiento las secuencias encontradas
en el GenBank denominadas USDA-48kDa, USDA-Bcab60, y USDA-X5 porque son
porciones de la secuencia USDA-Z6.


Argentina 1 ---------------------VCHNSRVSIMAPSDSVGDVTKTLLAASESVDSAANASIINRDMSAYLSAVSDNFAERIC
USDA-Z6 1 MRCSASSLFGALLLVARGALAVCHNSRVSIMAPSDSVGDVTKTLLAASESVDSAANAYMINSDMSDYLSAVSDNFAERIC
PuertoRico 1 MRCSASSLFGALLLVARGALAVRHNSRVSIMAPSDSVGDVTKTLLAASESVDSAANAYMINSDMSDYLSAVSDNFAERIC


Argentina 60 SQVPKGSNCSASVSAYMSRCAKQDCLTLQSLKYPLEAKYQPLTLPDPYQLEAAFILFKESDANPANSTEKRFWMRFRRGK
USDA-Z6 81 SQVPKGSNCSASVSAYMSRCAKQDCLTLQSLKYPLEAKYQPLTLPDPYQLEAAFILFKESDANPANSTEKRFWMRFRRGK
PuertoRico 81 SQVPKGSNCSASVSAYMSRCAKQDCLTLQSLKYPLEAKYQPLTLPDPYQLEAAFILFKESGANPANSAEKRFWMRFKRGK


Argentina 140 NHSYFHDLVFNLLEKNVTRDADATDIENFASRYLYMATLYYKTYTNVDEFGASFFNKLSFTTGLFGWGIKRALKQIIRSN
USDA-Z6 161 NHSYFHDLVFNLLEKNVTRDADATDIENFASRYLYMATLYYKTYTNVDEFGASFFNKLSFTTGLFGWGIKRALKQIIRSN
PuertoRico 161 NHSYFHDFVFNLLEKNVTRDAYATDIENFASKYLYMTTVYYKTYTNVDGFGASFFDKLSFTTGLFGWGIRRALKQIIRSN


Argentina 220 LPLDIGTEHSVSRLQHITGSYKDYMDTQIPALPKFAKRFSLMVVQRLLATVAGYVDTPWYKKWYMKLENFMVNRVFIPTK
USDA-Z6 241 LPLDIGTEHSVSRLQHITSSYKDYMDTQIPALPKFAKRFSLMVVQRLLATVAGYVDTPWYKKWYMKLKNFMVNRVFIPTK
PuertoRico 241 LPLDIGTEHSVSRLQHITSSYKDYMATQIPALPKFAKRFSRMVVRRLLATVAGYVDAPWYKKWYMKLKNFMVNRVFLPTK


Argentina 300 KFFNKEIREPSKALKEKVSTDTKDLFENKIRQGTVDFINNEIRDPSKALIRKVSTGAEDLFENKIGQGTVDFINNEIRDP
USDA-Z6 321 KFFNKEIREPSKALKEKVSTDTKDLFENKIGQGTVDFFNKEIRDPSKALKEKVSNDAKDLFENKIGQGTVDFINNEIRDP
PuertoRico 321 NFFNNKVAKPLRKHRKGNVSDSGESEEISAVGESL---------------------------------------------


Argentina 380 SKALIRKVSTGAE-------------------------------------------------------------------
USDA-Z6 401 SKALIRKVSTGAEDLFENKIGQGTVDFINNEIRDPGKALIRKVYTEADDLFENKIGQGTVDFINKEIRDPSKALIRKVST
PuertoRico --------------------------------------------------------------------------------


Argentina --------
USDA-Z6 481 EADNLLEK
PuertoRico --------















Figura 4.39: Alineamiento con el programa ClustalW1.8 de la secuencia clonada
de rap-1 y las secuencias obtenidas del Gen Bank para la cepa USDA-Z6 y la
cepa Puerto Rico.
Figura 4.38: Alineamiento con el programa ClustalW1.8 de la secuencia clonada
de TESP y las secuencias obtenidas del Gen Bank de la cepa USDA y Florida.

85

cepa similitud identidad
USDA-Z6 95,2 91,9
Puerto Rico 89,0 84,8



4.1.3.5 Antigenicidad de las protenas producidas
Para confirmar que las formas recombinantes producidas por nuestro sistema de
expresin fueran reconocidas por anticuerpos especficos contra T. equi, se realizaron
Western blots con cada una de las protenas expresadas y sueros positivos para este
parsito analizados previamente por cELISA (Figuras 4.40 y 4.42 a 4.46). En todos los
casos se utiliz un suero negativo para controlar la especificidad del antgeno por el
suero positivo. El revelado se hizo con el sustrato DAB para peroxidasa.

a) EMA-1 de T. equi
En primer lugar, se hizo un ensayo para comprobar la antigenicidad de la forma
recombinante de EMA-1 producida en este trabajo. En el Western que se muestra en la
Figura 4.40 se muestra un cultivo inducido y sin inducir, para confirmar que el suero
positivo estuviera reconociendo la protena recombinante y no otra protena de E. coli.
En este ensayo se us solo un suero positivo y un suero negativo.

Suero positivo
48 kDa
+ -
Suero negativo
+ -
EMA-1 EMA-1


Figura 4.40: Western blot con sueros equinos infectado y sin infectar con T.
equi, para confirmar de la antigenicidad de EMA-1.
Tabla 4.4: Datos de similitud e identidad entre las secuencias de
aminocidos de las cepas USDA-Z6 y Puerto Rico de RAP-1 y la
secuencia correspondiente a la cepa Argentina.

86


Puede observarse que el suero positivo reconoci una banda especfica del cultivo
inducido (+, valo negro) no presente en el cultivo no inducido (-). El peso estimado de
esta banda, por comparacin con el marcador de peso molecular, fue de 48 kDa,
coincidiendo con el peso obtenido para la protena recombinante.
Tambin puede observarse que adems de esta banda, se observan otras que
corresponden a protenas de la bacteria y a las cuales se unieron anticuerpos tanto de los
sueros positivos como negativos indicando que posiblemente en algn momento el
sistema inmune del animal estuvo en contacto con E. coli. Entre estas, se observa una
banda de reaccin tenue a la altura de EMA-1 en el caso del suero negativo, que podra
corresponder a anticuerpos contra tiorredoxina, la cual est fusionada a las protenas
recombinantes que se generan en el sistema procaritico pBAD/thioTOPO utilizado.
Para corrobar esta suposicin, se analiz por Western blot el patrn de bandas de
reconocimiento hacia extractos de E. coli que expresaban EMA-1 utilizando un suero
positivo y uno negativo, los cuales fueron neutralizados con distinas concentraciones de
otro extracto de E. coli que expresaba nicamente tiorredoxina (Figura 4.41).

s/p 10% 25% 50%
Suero Positivo
Suero Negativo
o-his
s/p 10% 25% 50%
Suero Positivo
Suero Negativo
o-his



Figura 4.41: Western blot donde se muestra que la neutralizacin
de los sueros permite disminuir el ruido en la reaccin de un suero
positivo por la protena EMA-1



87


Se observa que para concentraciones crecientes de extracto de E. coli expresando
tiorredoxina, nicamente se mantiene el reconocimiento de una banda del peso esperado
por el suero positivo, en tanto que a partir de 25 % de extracto, esa banda desaparece en
las tiras incubadas con suero negativo, as como tambin desaparecen otras bandas
inespecficas. En todos los casos el reconocimiento del antgeno recombinante por
anticuerpos anti-histidina no fue afectado, lo cual indica que la presencia de extracto de
E. coli en la reaccin no inhibe de alguna manera los reconocimientos antgeno-
anticuerpo especficos.

b) EMA-2 de T. equi
Se realiz un Western blot corriendo cultivos de E. coli expresando EMA-1 y EMA-2
para comparar la antigenicidad entre ambas (Fig.4.42). Se utilizaron cuatro sueros
positivos y uno negativo, neutralizados con 25% de extracto de E. coli expresando
tiorredoxina.
o-HIS control - suero 5 suero 71 suero 72 Suero 112
sueros positivos
o-HIS control - suero 5 suero 71 suero 72 Suero 112
sueros positivos



Se observ que los cuatro sueros positivos reconocieron a EMA-1, mientras que solo
tres reconocieron a EMA-2. Adems, la intensidad de bandas observadas en el caso de
los sueros 71 y 72 fue claramente mayor para EMA-1 que para EMA-2, a pesar que la
cantidad de protena presente en la membrana fue mayor para EMA-2 que para EMA-1
como se desprende de la intensidad de banda generada por el reconocimiento del
anticuerpo anti-histidina.
Figura 4.42: Western blot con varios sueros positivos, para
analizar al antigenicidad de las protena EMA-1 y EMA-2



88

Estos experimentos muestran que EMA-2 es reconocida por al menos 3 de los sueros
positivos para T. equi, pero su antigenicidad pareciera ser menor que la de EMA-1.
c) TE2, TE8 y TESP de T. equi
Se llevaron a cabo pruebas de antigenicidad similares a la realizada con EMA-2 con
cultivos de E. coli expresando TE2, TE8 y TESP. Como control positivo se corri un
cultivo expresando EMA-1. Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 4.43, ,
4.44, y 4.45.

sueros positivos
o-HIS control - suero 5 suero 71 suero 72 Suero 112
sueros positivos
o-HIS control - suero 5 suero 71 suero 72 Suero 112 o-HIS control - suero 5 suero 71 suero 72 Suero 112 o-HIS control - suero 5 suero 71 suero 72 Suero 112




o-HIS control - suero 5 suero 71 suero 72 Suero 112
sueros positivos
o-HIS control - suero 5 suero 71 suero 72 Suero 112 o-HIS control - suero 5 suero 71 suero 72 Suero 112
sueros positivos



Figura 4.43: Western blot con varios sueros positivos, para
analizar al antigenicidad de TE2


Figura 4.44: Western blot con varios sueros positivos, para
analizar al antigenicidad de TE8



89

o-HIS control - suero 5 suero 71 suero 72 Suero 112
sueros positivos
o-HIS control - suero 5 suero 71 suero 72 Suero 112
sueros positivos



En los tres casos se observ el reconocimiento de las protenas por anticuerpos anti-
histidina, mostrando que en todos los casos hubo una cantidad por lo menos semejante a
la de EMA-1. En todos los casos la protena EMA-1 fue reconocida por los sueros
positivos analizados. Sin embargo, ninguno de estos sueros reconoci a TE2, TE8 o
TESP. Estos resultados indican que estas protenas no son lo suficientemente
antignicas en infecciones por T. equi, como para generar una respuesta humoral
semejante a la despertada por EMA-1 y que por lo tanto pueda ser til en el desarrollo
de una ELISA indirecto.

d) RAP-1 de B. caballi
De igual manera se realiz un Western blot con un cultivo inducido y sin inducir de E.
coli expresando RAP-1. Se utiliz adems un suero positivo y uno negativo para
Babesia caballi (Figura 4.46).



Figura 4.46: Western blot con suero equino infectado y sin infectar con B.
caballi, para confirmar de la antigenicidad de RAP-1.
Figura 4.45: Western blot con varios sueros positivos, para
analizar al antigenicidad de TESP



90

Puede observarse que el suero positivo reconoci una banda del peso esperado para
RAP-1 en un cultivo de E. coli inducido (+) no presente en el cultivo no inducido (-), lo
cual indica que esta protena servira para diferenciar sueros positivos para B. caballi de
los negativos, tal como se esperaba.
Como conclusin de los experimentos de antigenicidad, se seleccion EMA-1 para
continuar con los pasos de purificacin necesarios para desarrollar un ELISA para T.
equi. Sin embargo, se continu tambin con los pasos de purificacin para EMA-2, de
manera de tener un antgeno alternativo en caso que alguno de estos pasos no fuera
satisfactorio para EMA-1. En el caso de B. caballi, se continu con la purificacin de la
protena RAP-1 y el desarrollo de un ELISA basado en ella.

4.1.3.6. Purificacin de las protenas recombinantes
Previo a la purificacin de las protenas se realiz una nueva induccin para determinar
si luego de la lisis y centrifugacin de las bacterias, las protenas quedaban en fase
soluble o no soluble. En el caso de EMA-1 y EMA-2 se observ que mayoritariamente
quedaban en la fase soluble. En el caso de RAP-1 la cantidad de protena soluble y no
soluble se reparta de forma similar (resultados no mostrados). Por este motivo, a la
protena RAP-1 se la purific por dos mtodos: uno con buffer nativo y otro con buffer
desnaturalizante.
La purificacin de la protena EMA-1 se realiz por cromatografa de afinidad a Ni-
agarosa. Se muestra en la Figura 4.47 la purificacin de EMA-1, con concentraciones
crecientes de imidazol (50, 100, 200, 400 y 1.000 mM) para la elucin de la columna:



Figura 4.47: Gel de poliacrilamida 12% teido con Coomasie.
Eluciones de la purificacin de EMA-1 por cromatografa de afinidad

91

En todas las eluciones realizadas se observ una banda en el peso correspondiente a
EMA-1. La calle correspondiente a la elucin con 200 mM de imidazol fue la que se
eligi para continuar con la puesta a punto del ELISA, por mostrar mayor concentracin
de protena.
Usando el mismo tipo de cromatografa utilizada con EMA-1, se purific la protena
EMA-2. Como se observa en la Figura 4.48 la mayor concentracin de la protena
EMA-2 se obtuvo en la elucin con 1M de imidazol (ovalo rojo). Puede apreciarse que
la cantidad de la protena obtenida fue mucho menor que la conseguida con EMA-1. Por
esta razn se decidi no utilizar EMA-2 para la elaboracin del ELISA para T. equi.
P
e
l
l
e
t
P
e
r
c
o
l
a
d
o
M
P
M
5
0

m
M
2
0
0

m
M
4
0
0

m
M
1
0
0

m
M
1

M
36 kDa
P
e
l
l
e
t
P
e
r
c
o
l
a
d
o
M
P
M
5
0

m
M
2
0
0

m
M
4
0
0

m
M
1
0
0

m
M
1

M
36 kDa




A pesar de la buena purificacin conseguida con la protena EMA-1, se puede observar
en el gel de la Figura 4.47 que incluso en la elucin con 200 mM de imidazol, se
observan otras protenas de E. coli copurificando con la protena de inters. Dado que
estas protenas son reconocidas por sueros de equinos negativos a T. equi, como se
mostr en la Figura 4.40, se llev a cabo un mtodo de electroelucin como forma
alternativa de purificacin. Este se basa en la separacin electrofortica de las protenas
de un cultivo inducido y la elucin de la protena de inters del gel de poliacrilamida
luego de la escisin de la porcin de gel que la contiene. Los resultados obtenidos con
esta metodologa se muestran en la Figura 4.49.
Figura 4.48: Gel de poliacrilamida 12% teido con
Coomasie. Eluciones de la purificacin de EMA-2.

92




Se puede observar que con esta metodologa se obtiene una banda nica, la cual se
confirm que corresponda a la protena recombinante producida dado que fue
reconocida por anticuerpos anti-histidina (Fig. 4.49b).
En el caso de RAP-1, como se mencion anteriormente, fue purificada por
cromatografa de afinidad en Ni-agarosa utilizando dos condiciones diferentes:
desnaturalizantes (presencia de los agentes caotrpicos guanidina y urea) y no
desnaturalizantes, como se describe en la seccin 3.4.7.2. Las eluciones de la
purificacin utilizando el primer mtodo se muestra en la Figura 4.50



Figura 4.49: Electroelucin de EMA-1. a. Gel de poliacrilamida 12%
teido con Coomasie. b. Western blot para confirmar que la banda
electroeluda corresponda a EMA-1
Figura 4.50: Eluciones de la purificacin de RAP-1 en condiciones
desnaturalizantes. a. Gel de poliacrilamida 12% teido con Coomasie. b.
Western blot para confirmar la banda eluda corresponda a RAP-1

93

La fraccin percolado contiene las protenas no unidas a la columna, mientras que las
fracciones correspondientes a los buffer de lavados con pH decrecientes (7; 6; 5,3 y 4)
contienen las protenas que se pegan con cierta afinidad y que eluyen frente a cambios
de pH. Ninguna de las bandas que se observan en el gel teido con Coomassie
corresponde con el peso esperado para RAP-1 (66 kDa). Sin embargo, pudo observarse
una banda ntida cuando se hizo un Western blot con anticuerpo anti-histidina, en la
fraccin buffer de lavado pH 7. Si bien se pudo purificar la protena RAP-1 de forma
satisfactoria, se realiz un nuevo ensayo para evaluar la purificacin en condiciones no
desnaturalizantes. La Figura 4.51.a muestra un gel teido con nitrato de plata en el cual
se analizan las fracciones eludas con concentraciones crecientes de imidazol. Puede
observarse que RAP-1 eluye en 400 mM y 1 M de este reactivo. La identidad de la
banda obtenida con 1 M de imidazol fue confirmada en un Western blot utilizando
anticuerpo anti-histidina (Fig. 4.51.b).

66 kDa
P
e
r
c
o
l
a
d
o
M
P
M
5
0

m
M
2
0
0

m
M
4
0
0

m
M
1
0
0

m
M
1

M
R
A
P
-
1

M
P
M
a. b.
66 kDa
P
e
r
c
o
l
a
d
o
M
P
M
5
0

m
M
2
0
0

m
M
4
0
0

m
M
1
0
0

m
M
1

M
R
A
P
-
1

M
P
M
a. b.
66 kDa
P
e
r
c
o
l
a
d
o
M
P
M
5
0

m
M
2
0
0

m
M
4
0
0

m
M
1
0
0

m
M
1

M
R
A
P
-
1

M
P
M
a. b.







4.2. ELISA indirecto (ELISAi) para T. equi.
4.2.1. Puesta a punto del ELISAi
Para esta puesta a punto se utilizaron cuatro sueros positivos y cuatro sueros negativos,
diagnosticados como tales por cELISA. Se fijaron condiciones preliminares para un
ELISA indirecto: sensibilizacin de una placa IMMULON 2HB en buffer de pegada
ON a 4C, bloqueo de la placa con OVA (ovoalbmina) 1% en PBS Tween 0,1 %, 1 h a
Figura 4.50: Eluciones de la purificacin de RAP-1 en condiciones
desnaturalizantes. a. Gel de poliacrilamida 12% teido con Coomasie. b.
Western blot para confirmar la banda eluda corresponda a RAP-1

94

37C; anticuerpo conjugado a peroxidasa en dilucin de uso 1/2.000 en PBST
(previamente titulado), 1 h a 37 C y por ltimo revelado con ABTS y determinacin de
la absorbancia a 405 nm. A partir de estos parmetros se realizaron ensayos en los que
se fue variando cada uno de ellos por vez, de manera de encontrar las condiciones
ptimas de uso.
Como antgenos se utilizaron las purificaciones de la protena EMA-1 realizadas por
cromatografia de afinidad y electroelucin mostradas en el captulo anterior.

4.2.1.1 Titulacin de antgeno y suero
Como primera medida se realiz la titulacin del antgeno purificado por cromatografa
de afinidad y de un suero equino positivo para T. equi. Como puede verse en la Figura
4.51 se midieron las absorbancias obtenidas con este ELISA al usar distintas diluciones
de un suero positivo, para distintas diluciones de antgeno, usando la metodologa
explicada en la seccin 3.8.

0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
1,800
a
b
s
dilucion antigeno
EMA-1 por cromatografia afinidad
1/25.
1/50.
1/100.
1/200.
1/400.
1/800.
1/1600.



Puede observarse que en la dilucin 1/1280 del antgeno, se alcanza el plateau de las
curvas de antgeno, es decir la mayor dilucin en la que se obtiene una buena
absorbancia para el suero analizado. Se observa tambin que para diluciones del
antgeno menores a 1/80, la absorbancia comienza a disminuir.
Como se explic en la seccin 3.8, la dilucin de suero que debera ser utilizada, es
aquella que menor ruido tenga en la dilucin sin antgeno, En nuestro caso sera la
Figura 4.51: Titulacin del antgeno EMA-1 purificado por
cromatografa de afinidad y de un suero equino positivo.

95

dilucin 1/800. Al ver que a esta dilucin le corresponda una Abs demasiado baja se
prefiri usar la relacin entre la Abs de cada suero en la dilucin 1/1280 y su
correspondiente Abs en la dilucin sin antgeno. De estas relaciones se eligi la que
tuviera el valor ms alto, es decir la dilucin 1/100 del suero. Por consiguiente esas
fueron las diluciones empleadas en el resto de los ensayos (1/1280 del antgeno y 1/100
del suero). En el caso del antgeno, la dilucin utilizada corresponde a 50 ng de EMA-1
purificada por pocillo.
De igual manera que en el caso anterior, se realiz la titulacin del antgeno purificado
por electroelucin junto al mismo suero positivo utilizado en la titulacin anterior. En la
figura 4.52 se observan los resultados obtenidos. En este caso la dilucin ptima del
antgeno fue de 1/5, correspondiente a una concentracin de 3 g de protena por
pocillo. La dilucin de suero ptima fue la misma que se obtuvo con la protena
purificada por cromatografa de afinidad (1/100).

0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
1,800
A
b
s
dilucion antgeno
EMA-1 por electroelucin
1/25.
1/50.
1/100.
1/200.
1/400.
1/800.
1/1600.



Dado que la cantidad de protena ptima fue considerablemente mayor en el caso de la
electroelucin, se descart esta preparacin en el posterior desarrollo del ELISA y se
trabaj solamente con la protena purificada por cromatografa de afinidad.
Para la eleccin de las condiciones y variables del ELISAi que optimizaran la
discriminacin entre sueros control positivos y negativos, se utiliz una tasa de
discriminacin tasa Abs+/Abs-, que consisti en el cociente entre el promedio de las
absorbancias obtenidas con 4 sueros positivos y 4 sueros negativos.
Figura 4.52: Titulacin del antgeno EMA-1
electroeluido y de un suero equino positivo.

96

Se analizaron diferentes condiciones y variables para perfeccionar este ELISAi: tipo y
concentracin de bloqueantes (BSA, OVA y gelatina), concentracin de detergente
(Tween 20), temperaturas de incubacin, y neutralizacin de los sueros.

4.2.1.2 Tipos y concentracin de bloqueantes
El bloqueo de las placas tiene como finalidad evitar la absorcin no especfica del
anticuerpo a testear y del conjugado enzimtico a los espacios del pocillo en los que no
se peg el antgeno. En este trabajo se analiz la efectividad de tres agentes
bloqueantes: albmina bovina, albmina de huevo y gelatina de cerdo, en tres
concentraciones distintas de uso diluidos en PBS-Tween 0,1 % (Figura 4.53).

0
0,5
1
1,5
2
2,5
0,50% 1% 2%
Abs+/Abs-
Concentraciones
Tipos de bloqueantes
BSA
OVA
Gelatina



Del anlisis del grfico de barras puede observarse que las diferencias entre las distintas
concentraciones de bloqueantes no fueron significativas. Sin embargo, se eligi el
bloqueante BSA en la concentracin 0,5 % ya que mostr el mayor valor de
discriminacin.
4.2.1.3. Concentracin de detergente
Para mejorar la especificidad de unin entre anticuerpo y antgeno, se probaron tres
concentraciones distintas del detergente Tween 20: 0,01; 0,05 y 0,1 %.
Figura 4.53: Tipos y concentraciones de bloqueante para la puesta a
punto del ELISAi para T. equi.

97

Se observa en la Figura 4.54 que al disminuir la concentracin de Tween 20 utilizada en
los ensayos anteriores, no se logr mejorar la tasa de discriminacin, por lo que se
continu utilizando la concentracin de 0,1 %.

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0,01% 0,05% 0,10%
Abs+/Abs-
Concentracin
Concentracin de Tween 20



4.2.1.4 Temperatura de sensibilizacin
Se estudiaron dos temperaturas para las incubaciones de la placa de ELISA, una a 25C
y la otra a 37C (Figura 4.55)

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
25 C 37 C
Abs+/Abs-
Temperaturas
Temperatura de incubacin



Figura 4.55: Temperatura en las que se realizaron las
incubaciones de las placas de ELISA.
Figura 4.54: Distintas concentraciones de detergente Tween 20 para la
puesta a punto del ELISAi para T. equi.

98

No se observaron diferencias notorias entre las dos temperaturas de incubacin. Sin
embargo por la leve diferencia se continu trabajando con incubacin de las placas a 37
C.

4.2.1.4. Neutralizacin de los sueros
Como se hizo mencin en la seccin 4.1.3.5, los sueros equinos reaccionan contra
antgenos de E. coli presentes en la preparacin de la protena purificada, por esta razn
se decidi agregar un paso de neutralizacin de los sueros. Para esto se agreg extracto
de E. coli transformadas para expresar tiorredoxina, en la placa de ELISA durante la
incubacin con los sueros, permitiendo que los anticuerpos que pudiesen reaccionar con
los antgenos de E. coli pegados a la placa de ELISA fueran neutralizados y de esta
manera no produjeran ruido en la absorbancia durante el revelado de la placa.
En la Figura 4.56 se observa el efecto en la tasa de discriminacin del agregado de un
extracto de E. coli, en concentracin final en el suero de 10 y 20% (lo cual equivale a
una concentracin de protena bacteriana adicional de 18,5 y 37 mg/ml respectivamente,
en la alcuota de suero). Puede observarse que la concentracin de 20% increment la
tasa de discriminacin de forma notoria, permitiendo que la diferencia entre el promedio
de las absorbancias positivas fuera el doble que el promedio de las absorbancias
negativas.

0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
s/pread. 10% 20%
Abs+/Abs-
% preadsorcin
Preadsorcin de los sueros


Figura 4.56: Neutralizacin de los sueros con
concentraciones crecientes de extracto crudo de E. coli.

99



Con este valor de discriminacin consideramos que el ELISA haba sido puesto a punto
y decidimos evaluarlo con un mayor nmero de muestras y comparar su resultado con el
cELISA validado.
Por consiguiente, las condiciones finales que dieron mxima diferencias entre sueros
positivos y negativos y que se utiliz en el resto de los experimentos fueron las
siguientes:
- Sensibilizacin de una placa Immulon 2HB con 50 ng de la protena EMA-1
purificada por cromatografa de afinidad diluda en buffer de pegada, ON a 4 C.
- Bloqueo de la placa con 0,5 % de BSA en PBST (0,1% de Tween-20 en PBS), a
37
o
C, con agitacin. .
- Incubacin de los sueros en una dilucin 1:100 en PBST / 0,5 % BSA,
conteniendo 20% (v/v) de un extracto crudo de E. coli expresando tiorredoxina,
incubado a 37C por 1 h.
- Incubacin con el anticuerpo anti-IgG equina, conjugado a peroxidasa (1:2.000)
diluido en PBST / 0,5 % BSA.
- Revelado con el sustrato colorimtrico ABTS, detencin de la reaccin a los 15
minutos con SDS 10 % y medicin de la absorbancia a 405 nm.
- Entre cada una de las incubaciones se realizaron tres lavados con PBST (0,1 %
Tween 20).

4.2.2. Determinacin del punto de corte
Para calcular el punto de corte para este ELISAi se realiz un anlisis de Curva ROC,
utilizando como prueba de oro el resultado del cELISA para T. equi (VMRD). Si bien el
uso de cELISA como prueba de oro puede ser discutible, debido a que no es un ensayo
confirmatorio de la presencia del parsito en el animal, por una cuestin de factibilidad
del ensayo se decidi utilizarlo, por ser considerado por la OIE el mejor ensayo con el
que se cuenta en la actualidad.

100

Se analizaron con ambos ELISAs un total de 180 muestras sricas, pertenecientes en su
mayora al muestreo llevado a cabo en la ciudad formosea de Misin Laishi (n = 118);
as como tambin muestras recibidas de la provincia de Buenos Aires y del Uruguay (n
= 39 y 23, respectivamente). El punto de corte fue calculado por comparacin en un
anlisis de curva ROC. La variable de cuantificacin utilizada para la elaboracin de
este test fue el valor de absorbancia de cada suero obtenido con nuestro ELISAi,
normalizado con un control interno de placa (CIP) para la comparacin de los resultados
entre placas. La variable de clasificacin fue el resultado obtenido (positivo negativo)
con el kit cELISA. El anlisis ROC se realiz con el programa MedCalc versin 8.1.0.0.
En la Figura 4.578 se observa el resultado obtenido de este anlisis. La Curva ROC
representa los valores de sensibilidad y especificidad obtenidos cuando el programa
supone como punto de corte cada una de las absorbancias obtenidas. El programa
analiza todos los datos y elige como punto de corte aquel que pondere el mayor valor de
sensibilidad y especificidad. Un valor cercano a la unidad del rea debajo de la Curva
ROC, significa que el ensayo tiene una alta sensibilidad y especificidad. En nuestro caso
el valor obtenido para el rea bajo la curva ROC fue de 0,963; con un desvo estndar de
0,013.









Otra forma de analizar este resultado es por medio de un diagrama de puntos que se
observa en la Figura 4.58.
Figura 4.57: Anlisis de curva ROC para la eleccin
del punto de corte del ELISA para T. equi.

101




En este grfico puede observarse el punto de corte elegido por el programa,
representado por la lnea con valor 1. Esto significa que el suero que fue utilizado para
normalizar las placas, coincidi con el punto de corte del ELISAi. Los puntos del lado
izquierdo del grfico representan los sueros negativos por el cELISA y los del lado
derecho, los positivos. Si consideramos al cELISA como prueba de oro podramos decir
que los sueros negativos por encima del punto de corte son falsos positivos y los sueros
positivos por debajo del punto de corte son falsos negativos.
Como resultado de este anlisis, se obtuvo como valor de corte para este ELISAi, la
absorbancia obtenida por el suero control interno de placa. Con este dato se di por
concluida la puesta a punto del ELISAi para el diagnstico de T. equi.
Si bien el resultado de la curva ROC es un valor a tener en cuenta, nos pareci ms
apropiado desde el punto de vista estadstico el empleo de un test de concordancia para
evaluar la similitud diagnstica entre el cELISA y el ELISAi.

4.2.3. Anlisis de concordancia
Con los resultados obtenidos en el paso anterior, ms los resultados de un muestreo
hecho con posterioridad en Entre Ros se llen el cuadro de doble entrada que se
muestra en la Tabla 4.1.


Figura 4.58: Diagrama de puntos para la eleccin
del punto de corte del ELISA para T. equi.

102


Elisa indirecto
+ -
cElisa
+ 126 15 141
- 9 134 143
135 149 284


Con estos datos se realiz el estadstico descripto en la seccin 3.6. El valor obtenido
fue de 0,83 (significacin: muy buena). Este resultado nos indica que los resultados
diagnsticos obtenidos con nuestro ELISAi son altamente comparables con los
resultados obtenidos con el cELISA.
La sensibilidad y especificidad relativas fueron de 93,3 y 89,9 % respectivamente.
En forma alternativa, se eligieron 8 de las 28 muestras discordantes, para ser analizadas
por el Centro de Referencia "National Veterinary Services Laboratories, USDA,
APHIS, VS". Como resultado, cuatro de los diagnsticos coincidieron con el
diagnstico de nuestros ELISAi y cuatro con los del cELISA.

4.2.4. Diagnstico de Theileriosis equina en caballos de Buenos Aires, Entre Ros,
Formosa y Salta
Debido a la escasa informacin de prevalencia encontrada en la bibliografa se decidi
realizar sondeos exploratorios, con el fin de recabar informacin necesaria para el
clculo del n muestreal en futuros estudios epidemiolgicos. Nos pareci informativo
realizar un muestreo en tres puntos del pas, que estuviesen distribuidos de Norte a Sur,
ya que ese es el gradiente en el que se cree varia la prevalencia del parsito.
En la tabla 4.2 se resumen los datos obtenidos en los campos de la ciudad formosea de
Misin Laishi:







Tabla 4.1: Cuadro comparativos con los
valores obtenidos para cada uno de los ELISAs

103

campo caballos (n) casos % de positivos
1 9 7 77,78
2 10 8 80
3 11 9 81,82
4 10 10 100
5 10 9 90
6 15 13 86,67
7 17 17 100
8 24 24 100
9 10 6 60
10 14 13 92,86
Total 130 116 89,23


El promedio de sueros positivos obtenidos para un total de muestras analizadas de 130,
fue de 89,23%. No se observaron diferencias en el porcentaje de positividad entre
animales machos y hembras.
En Entre Ros se obtuvo un porcentaje de positividad del 17,31% para un total de 104
muestras. En la tabla 4.3 se observan los valores obtenidos en cada una de las ciudades.

Ciudad latitud sur equinos (n) raza* casos % de positivos
Chajar 30 46 27 12/15 5 18,52
Federacin 31 00 4 4/0 2 50
Concordia 31 24 47 45/2 10 21,28
Concep, del Uruguay 32 28 5 0/5 0 0
Gualeguaych 33 01 21 0/21 1 4,76
Total 104 61/43 18 17,3
*pura sangre de carrera / criollo cruza


Del anlisis de estos resultados, se encontr que 15 de los 18 animales positivos, fueron
animales pura sangre de carrera. Uno de ellos fue un potro menor de un ao. Como en el
caso de los animales de Formosa, no se encontraron diferencias en el porcentaje de
animales positivos hembras y machos.
En la Tabla 4.4 se pueden observar los resultados obtenidos en la provincia de Salta.

Tabla 4.2: Resultados obtenidos con el ELISAi en
los campos de Misin Laishi.
Tabla 4.3: Resultados obtenidos con el ELISAi en la ciudades de Entre Ros.

104

Departamentos
Muestras
analizadas
Animales
positivos
Porcentaje
Anta 6 1 16,67
Cerrillos 20 2 10
Chicoana 25 6 24
General Guemes 4 0 0
General Jos de San Martin 42 22 52,38
La Caldera 6 3 50
La via 10 2 20
Rosario de La frontera 32 4 12,5
Rosario de Lerma 21 5 23,81
Salta capital 133 39 29,32
Total general 299 84 28,09


En las muestras uruguayas (n= 23) se encontraron 10 seropositivas, que representan al
43,48% de los animales muestreados.
En las muestras de Buenos Aires se diagnosticaron 3 animales positivos para un total de
103 equinos estudiados (1,9%).

4.3. ELISA indirecto para B. caballi
4.3.1. Puesta punto del ELISAi
Para la puesta a punto del ELISA indirecto, se procedi en primer lugar a la titulacin
del antgeno RAP-1 y de un suero positivo equino para B. caballi, de modo similar a lo
realizado con EMA-1. Se usaron para este test las mismas condiciones obtenidas para la
puesta a punto del ELISAi para T. equi. A diferencia de la titulacin realizada para
EMA-1, se agreg adems a la placa una dilucin de 1/10 de un suero negativo para
poder calcular la tasa de discriminacin en este mismo ensayo. El resultado de este
ensayo, utilizando RAP-1 recombinante purificada por cromatografa de afinidad,
utilizando condiciones no desnaturalizantes, se observa en el Figura 4.59. Se grafic
tambin la dilucin 1/10 del suero negativo (C-).

0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1/5. 1/10. 1/20. 1/40. 1/80. -
Abs
Dil. suero
Titulacin RAP-1 (B. no desnaturalizante)
1/10.
1/30.
1/90.
1/270
C-

Figura 4.59: Titulacin del antgeno RAP-1 y de un suero equino positivo.
Tabla 4.4: Resultados obtenidos con el ELISAi en la provincia de Salta.

105

Las diluciones ptimas resultantes para suero y antgeno fueron de 1/10 y 1/20
respectivamente. La cantidad de protena recombinante necesaria para sensibilizar la
placa consisti en 1 g por pocillo. Analizando la tasa de discriminacin obtenida para
este punto, se obtiene un valor de 7. Es decir, un poder de discriminacin 3 veces mayor
que el obtenido para el ELISAi de T. equi.
De igual manera se realiz la titulacin para la protena RAP-1 purificada con buffer
desnaturalizante. Los valores obtenidos se muestran en la Figura 4.60
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1/5. 1/10. 1/20. 1/40. 1/80. -
Abs
Dil. suero
Titulacin RAP-1 (B. desnaturalizante)
1/10.
1/30.
1/90.
1/270
C-


En el grfico se observa que para una dilucin del antgeno de 1/5, no se alcanza el
plateau de la curva. Esto representa una cantidad de protena mayor a 5 g por pocillo.
Por esta razn se decidi usar la protena RAP-1 purificada en condiciones no
desnaturalizantes, ya que necesita de menor cantidad de protena para lograr una buena
seal en la placa.
Todas las muestras recolectadas en Formosa y parte de las recolectadas en Buenos Aires
fueron analizadas utilizando un cELISA comercial para el diagnstico de B. caballi, de
manera de contar con sueros positivos y negativos a este parsito, necesarios para la
puesta a punto del ELISAi correspondiente. Debido a que el resultado obtenido de este
anlisis fue negativo en prcticamente la totalidad de los sueros (slo un animal fue
positivo entre las 180 analizadas), fue necesaria la obtencin de las mismas de otras
regiones endmicas. Un total de 41 sueros provenientes de Brasil fueron conseguidas
por medio de la colaboracin del Md. Vet. Marcos Suarez. Sin embargo, a causa de la
escases del volumen de cada uno de los sueros y en vista del buen resultado obtenido
con la titulacin de RAP-1 purificada en buffer no desnaturalizante (Figura 4.59)
consideramos que los parmetros utilizados eran lo suficientemente buenos como para
continuar con la determinacin del punto de corte del ELISAi para B. caballi.
Figura 4.60: Titulacin del antgeno RAP-1 y de un suero equino positivo.

106

4.3.2. Determinacin del punto de corte
Para la determinacin del punto de corte se analizaron un total de 180 muestras,
correspondientes a 129 sueros del muestreo en Formosa, 10 de Buenos Aires y 41
sueros de Brasil. Solo 33 de este ltimo grupo fueron positivas por cELISA. Con estos
datos ms los valores de absorbancia obtenidos por ELISAi, se realiz un anlisis de
Curva ROC, de igual manera que se realiz en el caso del ELISAi para T. equi.
En la Figura 4.61 se observa el resultado obtenido con este anlisis.




El valor obtenido para el rea bajo la curva ROC fue de 0,893; con un desvo estndar
de 0,038. El valor obtenido para el punto de corte fue de 3,5. Este valor corresponde al
41 % del control positivo de placa. De manera que este fue el punto de corte utilizado en
los sucesivos ensayos con este ELISAi.

4.3.3. Anlisis de concordancia
Para determinar la correspondencia entre este ELISAi y el cELISA se realiz un anlisis
de concordancia con los datos analizados en la seccin anterior. En la tabla 4.4 se
muestra la comparacin de los resultados para cada uno de los ensayos.



Figura 4.61: Anlisis de curva ROC para el ELISAi para B. caballi.

107


iELISA
+ -
cElisa
+ 26 7 33
- 8 139 147
34 146 180


De las 180 muestras analizadas, 15 muestras presentaron discordancia entre los
resultados del iELISA y el cELISA. El valor obtenido para el estadstico fue de 0,72
(significancia: buena). A pesar de tener una tasa de discriminacin mayor que el ELISAi
para T. equi, este ELISAi no obtuvo tan buen valor de . Esto se debi a que la tasa de
discriminacin fue calculada con una sola muestra. Cuando se vuelve a calcular esta
tasa con los datos obtenidos del anlisis de estas 180 muestras, se obtiene un valor de
3,7; un valor todava mayor que el obtenido con el ELISAi para T. equi. Es decir que si
bien los promedios de absorbancia obtenidos para los sueros positivos y negativos se
encuentran ms alejados el uno del otro, la dispersin de estos datos es mayor que en el
caso del ELISAi para T. equi.
La sensibilidad relativa de este ELISA fue de 76,47 % y la especificidad relativa de 95,2
%.

4.3.4. Diagnstico de babesiosis equina en caballos de Buenos Aires, Entre Ros y
Formosa
Adems de las muestras analizadas en Formosa, se complet el anlisis de los sueros
pertenecientes al muestreo realizado en Entre Ros y se estudiaron tambin las muestras
de la provincia de Buenos Aires. Se encontraron 6 animales positivos en la provincia de
Formosa, 4 de los cuales tambin lo fueron para T. equi, evidenciando una coinfeccin
por ambos parsitos. Adems se encontr positiva una muestra de la provincia de
Buenos Aires. Esta muestra fue confirmada posteriormente por cELISA, y result
coincidentemente positiva para T. equi.

4.4. Uso de un nuevo anticuerpo anti-equino conjugado a peroxidasa.
Tabla 4.4: Cuadro comparativos con los valores
obtenidos para cada uno de los ELISAs

108

Como parte de un nuevo emprendimiento realizado en el Instituto de Virologa del
INTA de Castelar, se colabor en el desarrollo de un anticuerpo anti-IgG equina
conjugado a peroxidasa para su implementacin en los diferentes ELISAs que se
desarrollan en nuestra Institucin. Este anticuerpo es una IgY, producida en gallina y
purificada a partir de yema de huevo (Chacana 2004). El estudio consisti en la
titulacin del anticuerpo y su comparacin con el conjugado comercial utilizado por los
iELISAs de T. equi y B. caballi. Para esto se realiz la titulacin del anticuerpo
conjugado en una placa de ELISA sensibilizada con EMA-1 y luego utilizando los
parmetros puestos a punto para el iELISA de T. equi. Se us un suero positivo y un
suero negativo en la dilucin de uso 1/100. En la Figura 4.63 se muestran en barras
color verde, las tasas Abs+/Abs- de las distintas diluciones del anticuerpo conjugado y
en barra color celeste la tasa correspondiente a la dilucin de uso del conjugado
comercial. Se observa que para una dilucin de 1/200 del conjugado hecho en huevo se
obtiene una mayor tasa de discriminacin que la utilizada por el conjugado comercial.

0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
A
b
s
+
/

A
b
s
-
Relacion OD suero+ / OD suero-
Conj. Inta - Conj. comercial



La dilucin 1/200 corresponde a una concentracin de 7,5 mg/ml, mientras que la
dilucin 1/2.000 del conjugado comercial corresponde a una concentracin de 1,17
mg/ml.

4.5. Determinacin de co-infeccin de caballos con otros piroplsmidos.
Figura 4.63: Titulacin del conjugado anti-equino producido en huevo

109

Para determinar si los equinos en zonas endmicas de nuestro pas son portadores de
Babesia bovis y Babesia bigemina se decidi realizar dos estudios por separado,
basados ambos en la amplificacin del ADN por Reaccin en Cadena de la Polimerasa
(PCR): PCR cuantitativa doble Taqman (Real Time PCR) y Reverse Line Blot
Hybridization (RLB). El primero de ellos amplifica una regin del gen citocromo b, ya
que este gen se encuentra en una relacin 100 veces mayor que el gen ribosomal 18S
(Buling 2007). La segunda tcnica amplifica una regin del gen 18S, y dado que las
parasitemias en animales de campo (enfermos crnicos en su mayora) suelen ser bajas,
se utiliz una PCR semi-anidada para su deteccin. En ambos casos se analizaron
muestras de sangre entera de caballos provenientes de la ciudad formosea de Misin
Laishi, a las que se les extrajo el ADN por medio del kit QIAGEN Flexi Gene, como se
explic en la seccin 3.2.


4.5.1 Real Time PCR
Se analizaron 47 muestras por qPCR Taqman, de la forma en que se describi en la
seccin 3.3. En la Figura 4.64 se observa el resultado de este ensayo. El grfico
representa el nmero de ciclos en que cada una de las muestras super el punto de corte.
Los crculos verdes representa la fluorescencia para la sonda correspondiente a B. bovis,
los cuadrados rojos representa la fluorescencia para la sonda para B. bigemina.

n muestra
n

d
e

c
i
c
l
o





Figura 4.64: qPCR Taqman doble para B. bovis y B.
bigemina en muestras de equinos

110


Sorprendentemente se encontr que el 74,46 % de las muestras analizadas fueron
positivas para B. bovis. Adems 3 de los animales fueron tambin positivos para B.
bigemina. Para confirmar la presencia de B. bovis y B. bigemina en los equinos
positivos, se amplificaron las secuencias pertenecientes a los genes ribosomal 18S y
citocromo b, para su clonacin y su posterior secuenciacin. Como resultado, estas
secuencias tuvieron un 100 % de identidad con las secuencias ribosomal 18S (n de
acceso DQ785313) y citocromo b (n de acceso DQ785308) pertenecientes a B. bovis y
un 100 % de identidad con las secuencias ribosomal 18S (n de acceso DQ785311) y
citocromo b (n de acceso DQ785312) pertenecientes a B. bigemina. Tambin se
amplific la secuencia del gen 18S perteneciente a T. equi que fue anotada en el Gen
Bank con nmero de acceso FJ426368. Estas secuencia tiene una identidad del 99 %
con la secuencia AY150062 correspondiente al aislamiento Spain-1.
De esta manera se confirm que B. bovis y B. bigemina pueden infectar a los equinos
de Argentina, por lo cual estos animales podran actuar como reservorio de la babesiosis
bovina. Para B. bovis, exista un informe previo del hallazgo de un equino infectado con
este parsito en Espaa (Criado-Fornelio 2006). Para B. bigemina, por otra parte, este es
el primer estudio que muestra que este parsito puede infectar tambin caballos.



4.5.2 Reverse Line Blot Hybridization
En forma alternativa se realiz un RLB para confirmar la presencia de B. bovis y B.
bigemina en casi todas las muestras analizadas por qPCR. La tcnica utilizada se
describe en la seccin 3.12. Los resultados del revelado de la membrana resultante por
quimioluminiscencia se muestran en la Fig. 4.65.

Catch all
B. bovis
B. bigemina
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41



Figura 4.65: RLB para B. bovis y B. bigemina en muestras de equinos

111

Se puede observar el patrn de puntos correspondiente al anlisis de 41 muestras. En la
lnea Catch-all se observa un control especfico para el gnero Babesia spp y Theileria
spp. Todas las muestras dieron positivo a esta reaccin, indicando la infeccin de algn
parsito perteneciente a estos gneros. El 82,9 % de las muestras resultaron positivas a
B. bovis y solo una muestras arroj un resultado favorable a B. bigemina. Cuando se
comparan los resultados de qPCR con los de RLB se obtiene un 68 % de coincidencia
en los resultados para B. bovis, mientras que no se obtuvo ninguna coincidencia en el
diagnstico de B. bigemina.
Se observ que 3 animales positivos por qPCR y RLB para B. bovis, no fueron positivos
ni para T. equi y B. caballi diagnosticados por cELISA y ELISAi.

4.5.3 Anlisis de posibles reacciones serolgicas cruzadas
Los resultados mostrados en la seccin anterior llevaron a la suposicin que los equinos
positivos para B. bovis y B. bigemina podran generar una respuesta humoral contra
estos parsitos que diera reaccin cruzada con los antgenos EMA-1 o RAP-1 usados en
el diagnstico de T. equi y B. caballi, dando lugar a la aparicin de falsos positivos en el
diagnstico de estos dos ltimos parsitos.
Para analizar esto se realiz un Western blot donde se analiz la reaccin de sueros de
bovinos infectados experimentalmente con B. bovis y B. bigemina contra EMA-1 y
RAP-1 recombinantes. En la Figura 4.66 se muestra el resultado de este ensayo.

+ - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -
1 2 3 4 1 2 3 4
B. bovis B. bigemina
1 2 3 4 1 2 3 4
B. bovis B. bigemina
b. a.




Figura 4.66: W. blot para probar la presencia de reaccin cruzada de
sueros bovinos positivos a B. bovis y B. bigemina con las protenas
EMA-1 de T. equi (a) y RAP-1 de B. caballi (b)

112

En la Figura 4.66.a se muestra un Western blot con la corrida de un cultivo de E. coli
expresando la protena EMA-1, expuesta a 4 sueros bovinos en el da 21 posterior a una
infeccin experimental con B. bovis (+) y como control negativo los sueros de estos
mismos animales en el da 0 (-). De igual manera se muestran 8 sueros correspondientes
a infecciones experimentales con B. bigemina. En la figura 4.67.b se observa el mismo
experimento pero corriendo un cultivo expresando la protena RAP-1 de B. caballi.
Todos los sueros se neutralizaron con 20 % de un extracto de E. coli expresando
tiorredoxina.
En la Figura 4.66.a se observa que el animal 1 infectado con B. bovis reacciona con la
protena EMA-1, pero tambin se observa esta reaccin en el da 0, por lo que se asumi
que esta reaccin fue inespecfica. El resto de los animales no mostraron reaccin
alguna con la protena.
En la Figura 4.67.b se observa que los animales 3 y 4 infectados con B. bovis reaccionan
con la protena RAP-1, pero lo hacen en el da 0 tambin. Todos los animales infectados
con B. bigemina reconocieron a la protena RAP-1 de B. caballi, pero lo hicieron antes
y despus de la infeccin, por lo que se descart que la reaccin se debiera a una
reaccin cruzada de sueros especficos por B. bigemina hacia la protena RAP-1 de B.
caballi.
Estos resultados permiten descartar que equinos infectados con B. bovis o B. bigemina
puedan ser diagnosticados positivos para T. equi o B. caballi de forma inespecfica,
dando lugar a falsos positivos cuando se los diagnostica con los ELISAs indirecto y
competitivos utilizados en este trabajo.


113

5. Conclusin y discusin:
Esta Tesis se ha centrado en el desarrollo de mtodos de diagnstico para una patologa
de los equinos conocida como piroplasmosis equina, la cual es causada por los
protozoarios Apicomplexa Theileria equi y Babesia caballi. Estos pertenecen al grupo
de los piroplsmidos, junto con los dems miembros de los gneros Theileria y Babesia
y son transmitidos por varias garrapatas.
Con la excepcin de unos pocos pases que se consideran esencialmente libres de esta
enfermedad (Estados Unidos de Amrica, Canad, Inglaterra, Irlanda, Japn y Australia),
y que contienen alrededor del 10% de la poblacin mundial de caballos, la piroplasmosis
equina se distribuye en vastas regiones tropicales y subtropicales del mundo (Donnellan
2003). Nuestro pas, que tiene una poblacin de caballos de 1.300.000, se considera
dentro de la zona endmica, junto con los dems pases de Amrica del Sur. Si bien son
raros los casos clnicos de piroplasmosis equina, y los efectos que produce en su
manifestacin aguda no ponen en peligro severo a la salud de los caballos afectados, estas
infecciones tienen serios efectos econmicos en exportacin de animales para deportes.
Argentina es un importante exportador de caballos pura sangre y alcanzando valores de
U$S 15.000.000 anuales. Las consecuencias de la piroplasmosis equina en esta actividad
son importantes, ya que los equinos deben exhibir un certificado de que estn libres de
piroplasmosis. En caso de deteccin positiva, deben permanecer en cuarentena durante su
tratamiento, con los problemas que esto acarrea tanto en los gastos como en las demoras
consiguientes. A pesar de los daos provocados por la piroplasmosis equina en una
actividad altamente redituable en la economa de nuestro pas, prcticamente no existen
datos sobre las regiones afectadas, la prevalencia en esas regiones, cuales son las
garrapatas que la transmiten en nuestro pas y hasta que punto la infeccin iatrognica
cumple un papel relevante en su transmisin. Cuatro de los vectores que se han descripto
para T. equi y B. caballi existen en nuestro pas: Dermacentor nitens, Ammblyoma
cajennense, Rhipicephalus microplus y R. sanguineus. Mientras que la distribucin de
los tres primeros se restringe a zonas tropicales y subtropicales, R. sanguineus, la
garrapata de los caninos, puede existir en una gran variedad de regiones geogrficas,
incluyendo la Patagonia. Un mayor conocimiento sobre esta enfermedad y sus vectores
podra permitir aumentar las medidas de control para combatirla.

114

De acuerdo a la Organizacin Mundial de Sanidad Animal (OIE), los mtodos de
diagnstico que certifican el status sanitario de un equino de exportacin son la
inmunofluorescencia, la fijacin de complemento y el ELISA competitivo. Sin embargo,
ninguno de estos tres mtodos es ideal para planear un estudio epidemiolgico de
piroplasmosis equina en nuestro pas u otros pases de Amrica latina. La
inmunofluorescencia y la fijacin de complemento requieren disponer de equinos
infectados con T. equi o B. caballi para provisin de sangre con la cual preparar los
antgenos. Esto dificulta grandemente la utilizacin de estos mtodos adems de implicar
variabilidad entre los lotes de antgeno utilizados. Los ELISAs competitivos disponibles
para T. equi y B. caballi consisten en kits comerciales producidos en los Estados Unidos
de Amrica. Su alto costo reduce la posibilidad de usarlos en estudios epidemiolgicos.
Por estos motivos, esta Tesis se enfoc en la produccin de tests de ELISA indirecto que
pudieran servir para futuros anlisis de prevalencia de la piroplasmosis equina en distintas
regiones de nuestro pas, y potencialmente en otros pases de Latinoamrica, como
alternativa a los tres tipos de tests disponibles en la actualidad.
En primer lugar, se seleccion un antgeno adecuado para el desarrollo de estos tests. En
el caso de T. equi, se consideraron dos antgenos previamente descriptos, EMA-1 y EMA-
2, y se seleccionaron otros tres posibles ortlogos a TASP, TP2 y TP8.
EMA-1 es una protena de superficie que se encuentra anclada a la membrana
plasmtica por un puente glicosilfosfatidilinositol (GPI). No es sorprendente que sea
antignica en infecciones con T. equi, dado que las protenas ancladas por puentes GPI
son siempre altamente antignicas en los parsitos apicomplexos. EMA-1 fue
previamente propuesta por otros autores como candidata para el desarrollo de mtodos
de diagnstico (Knowles 1992, Xuan 2001, Shkap1998) y es el antgeno en el que se
basa el test de ELISA competitivo comercial.
Asimismo, se explor el uso la protena EMA-2, la cual es similar a EMA-1 (65 %
similitud, 52 % de identidad) y tambin est anclada a la membrana celular por un
puente GPI. EMA-2 fue objeto de varios estudios de otros autores para evaluar su
potencial como antgeno de diagnstico (Huang 2003, Knowles 1997). En este estudio
se comprob que EMA-2 es reconocida por sueros equinos infectados por T. equi,
aunque el reconocimiento hacia EMA-1 fue siempre ms eficiente. Por otra parte, se
pudieron obtener cantidades significativamente mayores de preparaciones purificadas de

115

EMA-1 que de EMA-2. Por estos motivos, se descart a EMA-2 como antgeno para el
desarrollo de este test de ELISAi.
Por otra parte, se evaluaron tres posibles nuevas protenas de T. equi como potenciales
candidatos para un test diagnstico: TE2, TE8 y TESP. Los genes codificantes para
estas protenas fueron identificados por comparacin de bsquedas de genes presentes
en el genoma de T. equi que mostraran un nivel significativo de similitud con otros ya
identificados en otras dos Theileria sp., T. parva y T. annulata que hubieran sido
descriptos como antgenos. Dado que el genoma de T. equi est siendo secuenciado por
la Washington State University (WSU), Pullman WA, USA y no se encuentra an
pblicamente disponible, esta bsqueda fue posible gracias a la cooperacin de un
investigador de esa universidad, pero no pudo ser tan extensa como se hubiera deseado.
Por ejemplo, cuando el genoma de T. equi se encuentre disponible pblicamente, ser
posible aplicarle algoritmos de prediccin para identificar todos los genes codificantes
para protenas ancladas por GPI, como se llev a cabo en un estudio reciente para P.
falciparum (Gaffar 2004). Un estudio de este tipo se llev a cabo para Babesia bovis en
el laboratorio donde se desarroll esta Tesis, identificndose de esta manera trece
protenas ancladas por GPI (Rodrguez et al 2009, manuscrito en preparacin).
Las protenas TE2 y TE8 identificadas en esta Tesis son similares a las proteinas TP2 y
TP8 de T. parva. Se desconoce la funcin de la protena TP2, esta posee ortologa con
un precursor de la protena de superficie D (nmero de acceso: CAI73971, 58,4 % de
identidad) de T. annulata. En cuanto a TP8, se especula que tiene funcin cisteina
proteinasa, por su homologia a la superfamilia de peptidasas C1. Posee ortologa con
una putativa cisteina proteinasa de T. annulata (nmero de acceso: CAI74839, 89,3 %
de identidad). Las cisteinas proteinasas son esenciales para muchos protozoos parsitos,
como por ejemplo la cruzipaina en Trypanosoma cruzi (Cazzulo 1997) o las falcipainas
en Plasmodium falciparum (Kumar 2007), donde han mostrado ser inmunognicas.
La razn por la que se incluyeron TE2 y TE8 en la lista de posibles candidatos para
diagnstico es que se encontr que poseen pptido seal y que activan linfocitos T
citotxicos en una infeccin experimental (Graham 2006). La presencia de pptido seal
es un indicio de que la protena puede ser secretada por el parsito o que puede
encontrarse en la superficie del mismo, permitiendo la unin de anticuerpos especficos.
Como se mencion en la introduccin en el caso de T. parva, la principal defensa que
tiene un bovino infectado con este parsito es una respuesta de clulas T citotxicas. La

116

activacin de linfocitos T citotxicos se produce por la presentacin de epitopes en el
complejo mayor de histocompatibilidad de clase I, de protenas que est secretando el
parsito dentro del linfocito infectado (McKeever 1994). Si este linfocito infectado se
destruye antes que algn linfocito T citotxico lo fagocite, estas protenas quedarn
expuestas a anticuerpos que se encuentren en circulacin y por lo tanto tambin podrn
estimular una respuesta de tipo B.
Por su parte, TESP es un fragmento de una protena que mostr similitud con TASP, un
antgeno de superficie de T. annulata, en el cual se bas el desarrollo de un test de
ELISA indirecto para este organismo (Bakheit 2004) y que es tambin considerado un
candidato vacunal (Schnittger 2002). TASP pertenece a la superfamilia de protenas
transportadoras de cobre, por lo que posiblemente desempee un rol esencial para T.
annulata. El dominio que define a esta familia se encuentra en la regin de TASP para
la cual se encontr similitud en TESP, por lo cual se puede especular que TESP tambin
se est expresando en T. equi.
En este trabajo, se produjeron formas recombinantes de TE2, TE8 y TESP, y se ensay
su antigenicidad exponindolas a sueros de equinos infectados con T. equi. Como
control positivo de estos ensayos, se utiliz EMA-1. Ninguna de las protenas nuevas
fue reconocida por ninguno de los sueros utilizados, que por otra parte, siempre dieron
reaccin positiva con EMA-1. Dada su falta de antigenicidad, estas tres protenas fueron
descartadas para el desarrollo de un test de diagnstico serolgico.
A partir de este anlisis de posibles candidatos diagnsticos, se seleccion a EMA-1
para el desarrollo de un ELISA indirecto. Se produjo una forma recombinante de esta
protena en un sistema de expresin procaritico en E. coli, utilizando el vector
pBAD/thioTOPO. La produccin de protenas recombinantes en este sistema se utiliza
con frecuencia en el laboratorio donde se desarroll esta Tesis, y esta es una de las
razones por las cuales fue aplicado. La produccin en E. coli es simple y rpida y los
medios de cultivo que se utilizan son de bajo costo. La expresin de todas las protenas
estudiadas fue muy satisfactoria en este sistema. En particular, la expresin de EMA-1
fue particularmente abundante. Un enfoque que result favorable en estos experimentos
fue el eliminar las regiones hidrofbicas del marco de lectura abierto, que corresponden
a los extremos amino y carboxi terminal. Asimismo, la purificacin de EMA-1 por
cromatografa de afinidad mostr un alto rendimiento, producindose 3,9 mg de
protena recombinante a partir de 100 ml de cultivo de E. coli.

117

Se analiz la purificacin de esta protena por electroelucin ya que por este mtodo se
recupera casi el total de la protena sembrada en el gel de acrilamida. Sin embargo, la
masa total de protena por gel es demasiado baja (0,8 mg) para la cantidad necesaria
para la sensibilizacin de las placas de ELISA (0,3 mg). Se especula que la diferencia
de diluciones observadas para la protena EMA-1 purificada por cromatografa y por
electroelucin, sera debido a la conservacin de algunos epitopes conformacionales en
la purificacin por afinidad.
Una vez obtenida una preparacin de EMA-1 purificada, se pusieron a punto parmetros
ptimos para la realizacin de este ELISA, incluyendo tipo y concentracin de
bloqueante, concentracin de detergente, temperatura de incubacin y neutralizacin de
los sueros. Las reacciones inespecficas debidas al reconocimiento de protenas de E.
coli por los sueros equinos se minimizaron neutralizando los sueros con antgenos
bacterianos. Una vez puesto a punto este ELISA, se analizaron sueros equinos
muestreados en varias provincias argentinas tanto con este ensayo como con el ELISA
competitivo comercial. Se realiz un test de concordancia entre ambos ensayos y se
obtuvo un valor de k de 0,83, que corresponde a una calificacin muy buena.
Estos resultados indican que la sensibilidad y especificidad del ELISAi desarrollado en
esta Tesis posee un valor comparable con los del cELISA y por consiguiente nuestro
ELISAi parece ser adecuado para el relevamiento epidemiolgico de la Theileriosis
equina en nuestro pas.
Utilizando este ELISAi, se obtuvieron algunos datos preliminares de prevalencia de la
Theileriosis equina en distintas regiones de Argentina. Es importante aclarar que los
valores obtenidos corresponden a prevalencias preliminares, dado que no fue posible
obtener el nmero de sueros que hubiera sido necesario para datos de prevalencia
estadsticamente significativos. Sin embargo, el test desarrollado, dada la simplicidad de
su uso y su bajo costo permitir este tipo de estudios en el futuro.
En el caso de la localidad de Mision Laishi, provincia de Formosa, la prevalencia
preliminar observada fue de 89,23 %. Este alto valor no es sorprendente, dado que esta
regin es endmica para los tres vectores descriptos para estos parsitos. Por otra parte,
en Salta se encontr que la prevalencia era muy heterognea. En esta provincia el
porcentaje promedio de todas las regiones fue de 28 %.

118

En la provincia de Entre Ros, a pesar de haberse obtenido un nmero bajo de casos
positivos, los resultados muestran claramente la presencia de T. equi en la regin.
Si bien la provincia de Entre Ros se considera libre de R. microplus Ammblyoma
cajennense y Dermacentor nitens, la presencia de piroplasmosis equina en caballos
oriundos de esta regin podra estar indicando diversas situaciones: (i) transmisin de T.
equi por R. sanguineus; (ii) el corrimiento hacia el sur de las reas de influencia de los
otros vectores debido al cambio climtico; (iii) transmisin transplacentaria en el caso
de equinos nacidos en esa regin pero cuyas madres fueran originarias de regiones de
alta prevalencia.
El nico equino positivo a T. equi y B. caballi encontrado en la provincia de Buenos
Aires posiblemente consista en un animal que haya sido transportado desde una regin
endmica.
Existen muy pocos datos previos de prevalencia de piroplasmosis equina, realizados por
inmunodifusin en gel de agar (Aguirre 2004). Se encontraron porcentajes de 28,9 y
32,6 % en la provincia de Formosa en dos estudio sobre 1958 y 1049 animales
respectivamente, realizados en la dcada del 80. Sin embargo, al no existir informacin
sobre el departamento en que se realizaron esos estudios (ver Tabla 1), no se pueden
realizar comparaciones con valor estadstico. Pero puede notarse que el porcentaje
obtenido en esta Tesis en Formosa supera ampliamente estos valores. De igual manera
cuando se analizan los valores de positividad en Entre Ros (17,3 %), superan los
valores obtenidos en Corrientes por Brihuega (2,6 %), pese a que esta ltima provincia
tiene un clima ms apto para el desarrollo de garrapatas que Entre Ros. Por la gran
diferencia obtenida entre los resultados, se podra especular que se deba a una mayor
sensibilidad del ELISAi que la inmunodifusin en gel de agar o a un aumento de la
prevalencia de la enfermedad en esta regin en las dos ltimas dcadas o a ambas
razones.
El conocimiento de la prevalencia de piroplasmosis equina en distintas regiones de
nuestro pas puede tener implicancias importantes en la toma de decisiones sobre el
manejo de equinos con respecto a otros pases del MERCOSUR. As, algunos criadores
favorecen la idea de un trfico sin barreras fronterizas entre Brasil y la regin de la
Pampa Hmeda de Argentina. Sin embargo, si esta regin tuviera una prevalencia de
piroplasmosis equina significativamente menor que las regiones de cra de caballos

119

brasileas, esta situacin con su potencial peligro de expansin de la enfermedad por
contagio iatrognico o presencia de vectores podra ser muy desventajosa para nuestro
pas (Dra. Mara Barrandeguy, comunicacin personal).
En esta Tesis, se desarroll asimismo un ELISAi para B. caballi, el otro agente causal
de la piroplasmosis equina. En este caso, se seleccion RAP-1 como antgeno de
diagnstico (Kappmeyer 1999). RAP-1 es una protena de las roptrias, organelas
exocticas de los Apicomplexa que estn posiblemente involucradas en la invasin
celular (Suarez 1998). Se han tambin descripto protenas tipo RAP-1 en otros
miembros del gnero Babesia (B. bovis y B. bigemina), y en todos los casos, son
protenas altamente conservadas y antignicas. RAP-1 es el antgeno en el que se basa el
test de cELISA disponible comercialmente para B. caballi. Se han desarrollado tests
diagnsticos para B. bovis y B. bigemina, tambin basados en sus correspondientes
antgenos RAP-1 (Kappmeyer 1999 y Suarez 2003).
Al igual que para EMA-1, se produjo una forma recombinante de RAP-1 en el sistema
de expresin procaritico pBAD/thioTOPO. Si bien la expresin no fue tan alta para
RAP-1 como para EMA-1, fue lo suficientemente abundante como para poder ser
detectada en un gel por tincin argntica. Posiblemente, su mayor tamao haya sido un
factor importante para su baja expresin. La purificacin por cromatografa de afinidad
dio un rendimiento de 1,2 mg con 100 ml de cultivo.
Las condiciones utilizadas para la puesta a punto del ELISAi para B. caballi fueron las
mismas que para el de T. equi. En este caso, se probaron 180 sueros provenientes de
Formosa, Bs. As. y Brasil, y los resultados se compararon con los obtenidos con el
cELISA comercial. De esta manera se obtuvo un valor k de 0,72 que corresponde a una
calificacin de buena concordancia.
Es interesante destacar que solo 7 de los 336 animales procedentes de distintas regiones
de Argentina result positivo para B. caballi cuando se los analiz con el ELISAi. Es
interesante que uno de los sueros corresponde a un animal de exportacin de la
provincia de Buenos Aires, que result tambin positivo para T. equi. La diferencia
obtenida entre los resultados para T. equi y B. caballi podra estar indicando que este
ltimo parsito se encuentra en muy baja prevalencia en nuestro pas, sugiriendo algn
tipo de competencia entre ambos parsitos en el vector o en el mamfero.

120

Dado que el tratamiento y prevencin de la piroplasmosis equina es el mismo, ya sea
que el causante sea T. equi o B. caballi, se consider interesante el desarrollo de un
ELISAi dual que pudiera detectar anticuerpos contra ambos parsitos.
Sin embargo en vista de los resultados obtenidos, ser necesario buscar otro enfoque
para su desarrollo. Una posibilidad sera la produccin de protenas recombinantes que
fusionen fragmentos de las protenas EMA-1 y RAP-1.
La babesiosis bovina es otra enfermedad transmitida por garrapatas de importancia
veterinaria y econmica en nuestro pas. Sus agentes causales son los piroplsmidos
Babesia bovis y B. bigemina, los cuales son transmitidos en Argentina por la garrapata
Rhipicephalus microplus. Esta garrapata tiene una distribucin restringida a zonas
tropicales y subtropicales del planeta y en nuestro pas afecta al NOA y el NEA, aunque
el rea de influencia se est extendiendo hacia el Sur debido a la sucesin de inviernos
templados en la regin pampeana en los ltimos aos. La babesiosis bovina causa
cuadros clnicos severos en los bovinos, caracterizados por anemia, daos renales,
hemoglobinuria, abortos, prdidas en la produccin de carne y leche, cuadros nerviosos
en el caso de B. bovis y la muerte del animal cuando no es tratado.
Como se mencion anteriormente, R. microplus tambin parasita caballos, a los que
transmite T. equi y B. caballi. Por este motivo, nos result interesante analizar si los
caballos de regiones endmicas para esta garrapata tambin podan ser infectados por
los hemoparsitos B. bovis y B. bigemina. Para ello se analizaron muestras de sangre de
equinos de la localidad Mision Laishi por un test de qPCR o Real Time PCR,
desarrollado para la deteccin y cuantificacin de B. bovis o B. bigemina, el cual est
basado en la amplificacin del gen del citocromo b (Criado-Fornelio 2009). El qPCR es
un mtodo altamente sensible debido a la utilizacin de sondas fluorescentes, pero
adems, dado que existen alrededor de 100 copias de citocromo b en el genoma de estos
parsitos, se amplifica la seal detectada. Utilizando este mtodo, se encontr que 35
muestras de las 47 analizadas eran positivas para B. bovis, 3 para B. bigemina, y 2 para
ambos parsitos. La identidad del ADN hallado fue confirmada por secuenciacin.
Por otra parte, estas muestras fueron analizadas por otro mtodo de deteccin de ADN,
el RLB (reverse line blot hybridization). Este mtodo se basa en la amplificacin del
gen 18S, utilizando cebadores de regiones conservadas en todos los piroplsmidos,
seguido de la hibridizacin de los amplicones con un oligonucletido especfico (para
cada especie) unido a una membrana, y su posterior deteccin por una reaccin de

121

quimioluminiscencia. Este mtodo fue desarrollado para el anlisis de infecciones
mltiples producidas por patgenos transmitidos por garrapatas, tanto en bovinos
(Gubbels 1999) como en pequeos rumiantes (Schnittger 2000). Al no disponer de la
membrana comercial que permite el anlisis conjunto de todos los hemoparsitos
conocidos, se elabor una membrana con sondas para B. bovis y B. bigemina; y para
aumentar la sensibilidad de la amplificacin se utiliz una PCR semianidada. Con este
mtodo, se obtuvieron 34 muestras positivas para B. bovis, una de las cuales tambin lo
fue para B. bigemina.
Comparando los resultados de las dos tcnica se obtuvo un 68 % de coicidencias en el
diagnstico de B. bovis y ninguna para B. bigemina. La razn de esta discrepancia se tal
vez que las dos tcnicas amplifican secuencia distintas de los parsitos y tal vez
pequeas diferencias en las secuencias blanco de los cebadores, hagan a alguna de las
tcnicas tener ms o menos sensibilidad por alguna cepa.
A pesar de que estos mtodos tienen una sensibilidad muy alta (alrededor de 2 X 10
-5
%
de parasitemia), no son tan sensibles como para poder detectar un inculo de parsitos
presentes en la saliva de garrapatas que se alimenten de los equinos. En otras palabras,
la deteccin de ADN de estos parsitos indica que estos estn realizando su ciclo
asexual en eritrocitos del equino. En el caso de B. bovis, estos resultados son
consistentes con la observacin que estos parsitos pueden, en cultivos in vitro, infectar
eritrocitos de humanos, ovinos, equinos, porcinos, caprinos (Gaffar 2003). No se han
realizado estudios de este tipo para B. bigemina.
Estos resultados estaran indicando que el caballo podra actuar como reservorio para
estos hemoparsitos bovinos, lo cual es un dato muy interesante desde el punto de vista
epidemiolgico, que puede ser til en la implementacin de medidas de control.
Nuestros resultados coinciden con un trabajo anterior de Criado-Fornelio et al (2006),
en el cual se encontr la infeccin de un equino de Espaa con B. bovis. El alto
porcentaje de equinos positivos para B. bovis observado indicara que este es un
hallazgo comn y no ocasional en zonas endmicas para la garrapata R. microplus. En el
caso de B. bigemina, no exista ningn trabajo previo que mostrara que el caballo poda
ser infectado por este parsito.
En estudios realizados en nuestro laboratorio, y en los cuales particip como
colaborador (Ferreri 2008) encontramos que el bfalo de agua (Bubalus bubalis)
tambin actuara como reservorio de B. bovis. En este estudio, se analizaron muestras de
sangre de bfalos de la provincia de Corrientes, y se encontr que un porcentaje

122

importante era positivo para este parsito por amplificacin de un fragmento de ADN
especfico utilizando nested PCR. Tambin, se encontr ADN de B. bigemina en
muestras de bfalos por un mtodo similar (resultados no publicados). En el estudio
mencionado, se aplic tambin un test de ELISA competitivo para B. bovis desarrollado
en nuestro laboratorio (Dominguez 2004), y se encontr que un 48% de los sueros
bubalinos analizados tenan anticuerpos contra B. bovis, lo cual indica que el sistema
inmune de los bfalos reacciona a la presencia de estos parsitos desarrollando una
respuesta humoral. Este test de cELISA para B. bovis ser aplicado en investigaciones
futuras a los sueros equinos para analizar si lo mismo ocurre en el caso de los caballos
infectados con este parsito.
En el caso de los bfalos de agua, no hay informacin sobre casos clnicos de babesiosis
bovina, por lo que se cree que la infeccin ocurre en estos animales de manera
esencialmente asintomtica. En investigaciones en curso, en colaboracin con
investigadores de la Estacin Experimental de INTA en Mercedes, Corrientes, se
analizar la validez de esta suposicin al comparar la respuesta de bfalos y bovinos
inoculados con una misma cepa patgena de B. bovis, en cuanto a signos clnicos,
descenso del hematocrito, temperatura corporal y parasitemia. Sera interesante realizar
en el futuro una experiencia similar para estudiar la respuesta aguda de equinos
infectados con estos parsitos. Sin embargo, para corroborar definitivamente la
capacidad de los equinos y bfalos en actuar como reservorios de estos parsitos, sera
necesario incluir un experimento para verificar si garrapatas alimentadas de la sangre
infectada de estos animales son capaces de transmitir el parsito a bovinos sanos.
Adems de los aspectos epidemiolgicos implicados en la presencia de hemoparsitos
bovinos en la sangre de equinos, se nos plante el interrogante si la eventual generacin
de anticuerpos contra B. bovis y/o B. bigemina no podra interferir con los ensayos de
piroplasmosis equina desarrollados. El enfoque utilizado para contestar este interrogante
fue el de exponer formas recombinantes de EMA-1 de T. equi y RAP-1 de B. caballi a
sueros bovinos positivos para B. bovis o para B. bigemina y analizar por Western blot si
haba reconocimiento. Los resultados obtenidos permiten concluir que los anticuerpos
generados en bovinos infectados con estos hemoparsitos no reaccionan con las
protenas utilizadas en los ELISAs para piroplasmosis equina, por lo que pueden
descartarse reacciones cruzadas en casos de infeccin simultnea.

123

En conclusin, esta Tesis aporta dos tests de diagnstico simples y econmicos para el
diagnstico serolgico de la piroplasmosis equina, que han permitido comenzar con un
relevamiento epidemiolgico de esta enfermedad de gran importancia econmica para la
actividad hpica, lo cual es esencial para la implementacin de medidas de control.
Asimismo, este trabajo abre la posibilidad futura de hacer un escalado de la produccin
de estos ELISAs, lo cual podra generar un producto biotecnolgico de fabricacin
nacional de alto valor agregado y con potencial comercializacin a nivel mundial. La
incorporacin de un conjugado realizado en huevo tambin de produccin nacional
permitira reducir an ms los costos de produccin del mismo, as como agregar un
aspecto totalmente novedoso que podra justificar su proteccin intelectual, y por ende
su valor para la transferencia al sector.
Finalmente, los datos generados en esta Tesis con respecto al caballo como reservorio
de los hemoparsitos bovinos B. bovis y B. bigemina son altamente relevantes para
aumentar el conocimiento de la epidemiologa para mejorar el control de la babesiosis
bovina

124

6. Bibliografa

Aguirre DH; Cafrune MM; Rada M y Torioni de Echaide S. (2004). Babesiosis clnica
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709


132

7. Lista de abreviaturas

Abs: absorbancia
Abs
600
: absorbancia a 600 nanmetros
ABTS: cido sulfnico 2-2-azino-bis-3-etilbenceno-6-tiazolin
ADN: cido desoxirribonucleico
APS: persulfato de amonio
ARN: cido ribonucleico
c.f.: concentracin final
CICVyA: Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronmicas
CIP: Control Interno de Placa
HMC: Complejo Mayor de Histocompatibilidad
CNIA: Centro Nacional de Investigaciones Agronmicas
C: grados Celsius
D.O.: densidad ptica
dil: dilucin
dNTPs: desoxirribonuclesidos trifosfato
EDTA: cido etilendiaminotetractico
ELISA: Enzime-Linked Immunosorbent Assay
g: gravedad
h: hora/s
His: histidinas
Ig: inmunoglobulina
INTA: Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria
kb kilo: pares de bases
log
10
:logaritmo en base 10
mAb: anticuerpo monoclonal
min: minuto/s
ml: mililitros
mM: milimolar
MPM: marcador de peso molecular
NCBI: National Center for Biotechnology Information
NVLS: National Veterinary Service Laboratory
N: nmero/s
nt: nucletido
OIE: Organizacin Mundial de Sanidad Animal
ORF: marco de lectura abierto (open reading frame)
pb: pares de bases
PBS: buffer fosfato salino
PBS-T: Buffer fosfato-Tween 20
PM: peso molecular
PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo
PCR: reaccin en cadena de la polimerasa (polimerase chain reaction)

133

p/v: peso en volumen
RT: real time
SDS: dodecil sulfato de sodio
seg: segundo/s
Taq ADN pol: ADN polimerasa de Thermophilus aquaticus
UV: ultravioleta
V: volts
VMRD: Veterinary Medical Research & Development
vol: volumen
g: microgramos
l: microlitros


134

8. Agradecimientos:

A la gente honrada que paga los impuestos, porque gracias a ese dinero yo pude
realizar mi trabajo. Espero haber retribuido bien con mi labor.
Al aumento del presupuesto de Ciencia y Tecnologa que hubo en el ao 2004, sin el
cual no creo hubiera obtenido mi beca de INTA-Conicet para realizar el Doctorado.
Al Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas (Conicet) y al
Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA) por la financiacin de mi beca.
A Mnica por aceptarme en su grupo de trabajo. Porque siempre me motiv con su
optimismo. Porque siempre me alent a hacer cosas nuevas. Porque me di la
oportunidad de viajar y trabajar en otros laboratorios. Por toda la confianza que deposit
en m. Porque me apoy para que realizara Congresos y cursos. Porque siempre se
preocup para que llegue a tiempo en las entregas de informes y trabajos; y por la
habilidad que tiene para expresarse.
A mi grupo de trabajo: Mara, Anabel, Lucas, Gisela, Mariana, Daniel, Marina,
Agustina, Leo, Sandra, Alicia y Liliana. Por todas la veces que me ayudaron con ideas y
con trabajo.
A Mara Barrandeguy por su preocupacin y gran predisposicin todas las veces que
la necesit.
A Silvina Wilkowsky por aceptarme como becario, por su apoyo y sus consejos.
A Fernando Fernndez, por haberme aceptado en el Instituto de Virologa y haberme
mantenido despus.
A Carlos Suarez por la bsqueda de antgenos ortlogos a T. parva y T. annulata en
el genoma de T. equi
A Sergio Ariel Llamas, por su ayuda desinteresada en la recoleccin de muestras en
Misin Laishi.
A Daniel Benitez, Mara Mesplet y Marcelo Rivalora por su ayuda en los muestreos
de Formosa y Entre Ros.
A Irene Alvarez por los sueros de Salta y el prstamo de pBAD thio TOPO.
A Angel Criado por permitirme realizar la parte de qPCR en su laboratorio.
A Marisa Farber por permitirme realizar la parte de RLB en su laboratorio.
A Paula Ruybal y Romina por su enorme ayuda para que pudiera realizar el RLB en
tan poco tiempo.

135

A Ignacio Echaide y a Susana Torioni de Echaide por la sangre infectada con B.
caballi y el antgeno de B. bovis.
A Marcos Suarez por los sueros de Brasil infectados con B. caballi.
A Andrs Wigdorovich y Pablo Chacana por su colaboracin con el conjugado anti-
equino para incluirlo en mi tesis.
A Viviana Parreo y Patricia Zamorano por sus consejos para poner a punto los
ELISAS.
A los directores de grupo: Andy, Majo, Patricia, Fonde, Gaby, Ariel, Viviana, Mara,
Mariano y Karina por sus aportes desinteresados de drogas y equipos.
Al Instituto de Biotecnologa por el uso del sonicador, cuarto fro y Nanodrop.

Muchas gracias!
A Marta y Rodolfo por todo lo el amor que me dieron y me dan. Por todo su apoyo.
Por todo lo que significan para m.
A Eugenia por su amor, su apoyo y por estar al lado mo siempre.
A Camila y Matas, por el amor que despiertan en m.
A Pabli, Gaby, abu, Laura, Juli, Mauro, Cami, Nahuel, Sol y sobrinos que vengan,
porque los quiero mucho. Por todos los fines de semana en familia.
A mis amigos de toda la vida Dami, Herni, Pablo, Andy, Fercho y Chino. Por
compartir tantas cosas juntos. Porque son tan buenas personas. Porque siempre es bueno
tenerlos al lado.
A Seba, Fede, Dora, Ubaldo y Mara del Carmen, por todo su cario.
A mis amigos de laboratorio: Mari, Belu, Lucas y Gise, por su apoyo, su compaa,
sus mimos, sus charlas y opiniones.
A todos los amigos y compaeros de Viro: Juan P, Diegui C., Beto, Demi, Diego G.,
Chiave, Marina M., Solcito, Andre, Aye, Fer, Luciano, Leo, Pame, Marta, Digi, Seba P.,
Vale O., Vale Q., Ceci, Nacho, Matas, Fio, Marimoa, Dario, Ftima L., Anita, Silvina,
Carlitos, Paula, Gaby P., Sele, Lili, Mariana A., Analia, Santiago, Bety, Debora, Sole,
Claudia, Ramn, Marcelo, Bessie, Agustina, Danilo, Myriam, Mariana N., Juan, Guille,
Marina L., Gaby D., Javier, Diego, Pablo, Irene, Gero, Cintia, Vicki, Romina, Sabri,
Antonio, Osvaldo, Teresa, Estela, Daniel, Gastn, Samu, Aldana, Luciana, Sandra y
Ftima. Por hacer cada da que paso en el INTA un momento agradable, por todo el
cario que me dan.

136

A mis otros amigos y compaeros de INTA: Kari, Andre, Martn, Virginia, Betiana,
Rosala, Paula, Romina, Pablo, Eliana, Isa, Vilma, Aide, Majo, Natalia, Vanesa, Raquel,
Mara, Fernando D.
A Mnica y Leo por las caminatas y las clases en ingls.
A Amalia y Angel Criado por haberme tratado tan bien en mi estada en su
Universidad, por la paella y el karaoke en su casa.
A Betiana y Marina por todas las veces que se preocuparon para que cobrramos en
tiempo y forma las becas.
A todos los buenos docentes que tuve a lo largo de mi formacin universitaria. En
especial a Juan Jos Cazzulo.
A todos los investigadores que aman esta profesin y lo demuestran todos los das
con su esfuerzo e inteligencia en su trabajo, porque me incentivan y sirven de ejemplo.