Ctedra de Enfermedades Infecciosas Facultad de Medicina Universidad de Mendoza

Titulo:Diagnsticos de Laboratorio para ser aplicados al paciente infectado.

Dr.Hugo Pagella Profesor Asociado

DESCUBRIENDO EL MUNDO INVISIBLE DE LA MICROBIOLOGIA

Las enfermedades son antiguas y no han cambiado nada. Somos los seres humanos quienes cambiamos, al reconocer lo que antes era imperceptible.
John Martn Charcot

DIAGNOSTICO CLINICO Y LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

El Mdico y el Microbiologo son responsables de determinar la etiologa de las infecciones y es esencial que estn intercomunicados de manera activa.
PACIENTE: Presenta un sndrome clnico infeccioso.(con o sin foco)

BASES: Clnicas -Por Imgenes-Epidemilogicas-Microbiolgicas DIAGNOSTICO ETIOLGICO

OBJETIVOS: Tratamiento

Pronstico
PREVENCION

Practicas del Laboratorio en Infectologa

Que vamos a solicitar?:
a-Laboratorio de Anlisis Clnico:
Hemograma- EritoGlucemia-Uremia-PCR Orina-Transaminasas.LDH. Fisicos/Quimicos etc

b-Laboratorio de Microbiologia

CultivosIdentificacin de grmenes Antibiograma Dosajes de Ac IgM- IgG Ac.Dosaje de Ag Genomas PCR

INTERPRETACION DE RESULTADOS

Analtica en el Paciente Infectado

Cuando hacemos los pedidos siempre tener presente las siguientes preguntas Para que me va a servir el dato? Cmo lo relaciono a la clnica? Cmo lo interpreto? El dato obtenido cambia mi orientacin clnica? Alguna enfermedad de base y/o medicacin puede alterar esos parmetros? Hay correlacin clnica/laboratorio?

Que, Cuando, Como Solicitarlo

Que debemos evaluar en cada parmetro? Hemograma: Anemia/plaquetopenia Leucocitosis/Leucopenia Neutrofilia: desviacin a la izquierda o a la derecha Granulaciones patolgicas Linfocitosis/Eosinofilia Formas inmaduras Eritrosedimentacion Glucemia Uremia PCR/Cuantitativa Perfil de Enzimamatico (GOT-GPT-FAL.Amilasa .LDH) Ac Lactico PCR/Procalcitonina Orina/% de PMN Materia fecal

Diagnsticos Microbiolgicos Directos e Indirectos

Directos: Son todos aquellos que nos va a permitir observar y/o
aislar el agente etiolgico infectivo o su genoma, presente en un material clnico. Los mismos son aplicables a :Bacteriologia, Micologia, Parasitologia y Virologia. Ventajas: Se identifican gneros, y especies que permiten dirigir una teraputica o determinar si la especie circulante ha sufrido mutaciones (virus/vacunas). Identifican Infecciones Agudas. Significa que vamos a: (1).VER, por Microscopia OPTICA los microorganismo: Bacterias, Hongos y Parsitos utilizando exmenes en fresco y coloraciones Los virus se observan por microscopia electrnica (No rutina) (2)AISLAR, el agente causal VIABLE (3)IDENTIFICARLO (4)Probar sensibilidad a los antimicrobianos

 Desventajas: Su Sensibilidad y Especificidad puede depender de polifactores: (a)Pacientes con antimicrobianos circulantes. (b)Muestras no representativas (c)Inoculo bajo (d)Muestras contaminadas ( competencia microbiana). (e)Tcnicas de laboratorio (exigencias nutricionales). (f)Tcnicas laboriosas y lentas en virus (lineas celulares) PARA TENER EN CUENTA Y RECORDAR

SOLO SON DEMOSTRABLES Y CONFIRMADAS LAS INFECCIONES POR MICROSCOPIA Y CULTIVOS EN UN

30 % DE LOS CASOS

 METODOS INDIRECTOS: Son aquellos que nos permiten determinar elementos estructurales de los diferentes agentes que estn o han estado produciendo una infeccin. NO OLVIDAR ESTOS CONCEPTOS:
PATOGENICIDAD: Es la capacidad del agente infeccioso para inducir enfermedad. VIRULENCIA: Es la apacidad de un agente de producir casos graves o fatales de una enfermedadINFECTIVIDAD: Es la propiedad del agente de poder alojarse y multiplicase (Infectar) dentro del huesped. INFECCION: Es la entrada y multiplicacin de un agente infeccioso en un ser vivo NO ES SINONIMO DE ENFERMEDAD

Ag (antigenos)
METODOS INDIRECTOS: Dosamos Ac (anticuerpos) IgM,IgG Ag: Se definen como toda sustancia de origen lipidica,proteinica, polisacarida,
acidos nucleicos, capsulas, restos de pared ,flagelos y toxinas de microorganismos y no microbianos (polen, clara de huevo,etc)

de formas de globinas, sea forma compacta y globar de ah su nombre inmunoglobulinas (Ig) Se producen en respuesta al estmulo de un Ag (anfgeno) La primera en aparecer es la IgM (a partir de los linfocitos B, para luego ser remplazadas por las IgG. TODA TECNICA DE DIAGNOSTICO INDIRECTO CAPTURA Anticuerpos Toda prueba o exmenes positivos indican confirmacin de enfermedad Si la enfermedad esta presente Cul es la probabilidad de que el resultado sea positivo? De aqu surge la definicin de SENSIBILIDAD considera los aciertos positivos y se mide por la proporcin de individuos en que el procedimiento resulto positivo en relacin a los que tienen la enfermedad. ESPECIFICIDAD: Considera los aciertos negativos, es decir cuando el resultado obtenido es negativo y la enfermedad esta ausente, sea mide la proporcin de individuos negativos y sin patologa

Anticuerpos Ac : Son protenas

QU TAN UTIL ES UN

ESTUDIO PARA EL
DIAGNOSTICO ?

En un algoritmo, cada va propuesta tiene como fundamento una investigacin clnica que demuestra que tanto un signo o sntoma cuantitativamente forma parte del cuadro (sensibilidad). Y en que proporcin cuando no exista ( el signo o sntoma) puede descartar la enfermedad (especificidad).

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD

SENSIBILIDAD: Es la posibilidad en los enfermos, de tener la prueba positiva ESPECIFICIDAD: Es la posibilidad en los sanos, de que la prueba sea negativa VALOR PREDICTIVO POSITIVO: La posibilidad de que los que tengan la prueba positiva, tengan la enfermedad VALOR PREDICTIVO NEGATIVO: La posibilidad de que los que tengan la prueba negativa no tengan enfermedad

ESQUEMA GENERAL

ENFERMEDAD
Presente Positivo Ausente

RESULTADO

a c

b d

Negativo

SENSIBILIDAD
ENFERMEDAD Presente Positivo Ausente

RESULTADO

a
c

b
d

Negativo

SENSIBILIDAD = a / a + c ( tasa de positividad en presencia de enfermedad)

SENSIBILIDAD
ENFERMEDAD Presente Ausente

Positivo

Verdaderos positivos

Falsos positivos

55
RESULTADO

4
Verdaderos negativos

Falsos negativos
Negativo

740 800

SENSIBILIDAD = 55 / 56 = 0.98 = 98%

Posibilidades

De 800 pacientes 56 tuvieron la patologa 55 fueron correctamente identificados, verdaderos positivos 4 se diagnosticaron incorrectamente, falsos positivos 1 enfermo no lo detect la prueba, falsos negativos 740 sin patologa se identificaron bien CONCLUSION: Con sensibilidad de 98%, de los prximos 100 pacientes, la prueba ser positiva en 98

ESPECIFICIDAD
ENFERMEDAD Presente Positivo Ausente

RESULTADO

a
c

b
d

Negativo

ESPECIFICIDAD = d / b + d ( tasa de negatividad en ausencia de enfermedad)

ESPECIFICIDAD
ENFERMEDAD Presente Ausente

Positivo

Verdaderos positivos

Falsos positivos

55
RESULTADO

4
Verdaderos negativos

Falsos negativos
Negativo

740 800

ESPECIFICIDAD = 740 / 744 = 0.99 = 99%

Posibilidades De 800 pacientes 55 tuvieron la patologa, verdaderos positivos 4 se diagnosticaron incorrectamente, falsos positivos 1 enfermo no lo detect la prueba, falsos negativos 740 sin patologa se identificaron bien, verdaderos negativos CONCLUSION: Con especificidad de 99%, en los prximos 100 pacientes sin enfermedad, la prueba ser negativa en 99

VALOR PREDICTIVO POSITIVO

El valor predictivo positivo de una prueba es la probabilidad de que una

persona que tiene la prueba positiva tenga tambin la enfermedad

VALOR PREDICTIVO POSITIVO

ENFERMEDAD Presente Ausente

Positivo

RESULTADO

a
c

b
d

Negativo

VALOR PREDICTIVO POSITIVO = a / a + b ( tasa de probabilidad despus de la prueba o probabilidad posterior de enfermedad)

VALOR PREDICTIVO NEGATIVO

El valor predictivo negativo de una prueba es la probabilidad de que una persona que tiene la

prueba negativa realmente no tenga la enfermedad

DIAGNOSTICOS MICROBIOLOGICOS
Diagnostico Directos: Todos aquellos que se recupera el agente infeccioso que esta
produciendo la invasin/primo infeccin o infeccin.

Son todas Tcnicas de cultivos y Biologa Molecular Indirectos:Son todas aquellas tcnicas que se basan en la Respuesta
Inmunolgica del Husped frente al Agente agresor ( Anticuerpos) y/o frente a las diferentes protenas y/o polisacridos que constituyen parte de la estructura del microorganismo de los mismos ( Antgenos)

ANTICUERPOS:Son inmunoglobulinas con especificidad definida producida

por las clulas plsmaticas. Se clasifican en 3 mayores. IgG- IgM.IgA y 2 menores IgD- IgE( menos del 1%)

Postulados de Koch
Creador de la Bacteriologa cuantitativa, Robert Koch
Demostr el origen bacteriano de una enfermedad y que cada enfermedad infecciosa especfica est causada por un tipo de bacteria diferente. El microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos. El microorganismo debe poder aislarse del hospedador en un cultivo puro.

La inoculacin de organismos aislados en cultivos puros a animales sanos debe poder provocar la aparicin de sntomas especficos de la enfermedad en cuestin. El organismo debe poder ser aislado del hospedador en

FLORA BACTERIANA NORMAL

El cuerpo humano normalmente contiene miles de especies de bacterias y menor nmero de virus, hongos y protozoarios. No transportamos todos los organismos durante todo el tiempo, en un momento dado cada uno de nosotros poseemos un espectro determinado de especies. El hombre hasta el momento de la rotura de membranas es exnico es decir estril. Enseguida comienza la colonizacin con estos microorganismos. Primero se coloniza piel y mucosas al atravesar el canal de parto, luego lo hacen las vias respiratorias, digestivas y otros nichos. Es un proceso fisiolgico que lleva a la formacin de la flora normal, la cual va a variar cuali y cuantitativamente a lo largo de la vida segn la edad, alimentacin, higiene, medicamentos, ciclo menstrual, etc.

La colonizacin del hombre es el establecimiento de la flora en el organismo y es el resultado de: Adherencia y multiplicacin bacteriana. *Adherencia: la bacteria se une a la clula resistiendo los mecanismos de defensa del husped. En este proceso intervienen adhesinas y receptores.

Adhesinas: son estructuras especializadas de las bacterias tales como pilis o fimbrias de las bacterias Gram negativas, cidos lipoteicoicos de las bacterias Gram positivas

Receptores: son estructuras de la superficie de la clula husped. La relacin bacteria-husped es especfica. No cualquier bacteria puede adherirse en cualquier lugar. *Multiplicacin: Es cuando en un determinado sitio del organismo residen y proliferan bacterias activamente.

FUNCIONES:
La flora normal juega un papel importante en:
Proteccin contra los organismos patgenos dada la Competicin por los nutrientes Competicin por los receptores de la clula husped Produccin de bacteriocinas u otros agentes antimicrobianos Estimulacin de inmunofactores comunes Modificacin de condiciones fsico-qumica como: ph y potencial de oxido-reduccin Participacin en procesos fisiolgicos: En el lumen intestinal interviene en la sntesis de vitamina k, biotina, riboflavina, piridoxina y en la digestin y absorcin

IMPORTANCIA MEDICA
1- El diagnstico Microbiolgico: Para realizar un correcto diagnstico de infeccin a partir de muestras clnicas provenientes de sitios normalmente colonizados es imprescindible conocer a la flora normal de ese lugar. El hallazgo de microorganismos reconocidos como patgenos en estos sitios es altamente sugestivo de agentes etiolgicos si esto se acompaa de un cuadro clnico compatible. Mientras que la recuperacin de cualquier microorganismo proveniente de muestras de sitios estriles se considera Agente Etiolgico de Infeccin. 2- El desarrollo de infecciones endgenas: provienen de la flora normal propia del paciente. Ejemplo clsico pueden ser las infecciones hospitalarias. No es fcil establecer hasta cuando un microorganismo que forma parte de la flora habitual deja de ser conviviente para transformarse en un patgeno oportunista o un patgeno potencial. Existen microorganismos patgenos verdaderos que solo se aslan de procesos infecciosos y que nunca fueron aislados formando parte de la flora habitual como: Neisseria gonorrhoeae, Salmonella spp, Shigella spp, Brucella spp.

Flora o Biota Normal: Conjunto de microorganismos que normalmente colonizan piel y mucosas.

CLASIFICACION:
Flora residente: Se encuentra regularmente en un lugar y a una edad
determinada, si se destruye se restablece rpidamente porque est bien adaptada a las condiciones ecolgicas de la zona.

Flora transitoria: Formada por microorganismos que pueden colonizar

temporalmente piel y mucosas sin establecerse en forma duradera. Pueden proliferar cuando se altera la flora residente.

Flora Patgena Estricta: Siempre es causa de infeccin

Ciertos agentes pueden ir y venir como habitantes espordicos, por ejemplo: Neisserias meningitidis/gonorrheae ,SBHGA ,Bacillus antrhasis. Shigella. Los microorganismos que pertenecen a la flora habitual pueden causar enfermedades en determinados tejidos y rganos dependiendo de las condiciones del husped.

QU ES UN MUESTRA CLNICA?
Es la mnima porcin de material orgnico obtenido del paciente en la que es ms probable encontrar el microorganismo causal.
a-Diagnstico Directo: Agente b-( Diagnstico indirecto): o la respuesta inmune especifica

UNA MUESTRA APTA DEBE RESPONDER A TRES INTERROGANTES. QU? CMO? CUNDO? QUE? a-Ser representativa del sitio de la lesin.
b-Poseer volumen suficientes c-Evitar la contaminacin con flora saprofita.

CMO? Es la tcnica correcta de obtencin (hispados, aspirados,puncines).

Realizar limpieza y asepsia previa a la obtencin. Recolectar en recipientes adecuados estriles y hermticos.

CUANDO? Depende del periodo evolutivo de la infeccin, tratando SIEMPRE ANTES

DEL TRATAMIENTO CON ATB.

SEROLOGIA INFECCIOSA
QUE ES? Son Mtodos que utilizan las propiedades inmunolgicas del husped cuali
o cuantificando las Protenas (Ac.Ag.Inmunoglobulinas,toxinas,etc)

CUANDO Y COMO SE APLICAN ?

Por ej frente a las caractersticas de un virus DNA de la Hepatitis B, Marca deteccin y curso de las infecciones de acuerdo a sus Ag y Ac. MARCADORES SEROLOGICOS: (Hbs Ag )Antigeno de superficie Detecta al husped con la infeccin aguda o crnica (Ac anti Hbs)Anticuerpo anti superficie Identifica husped que han tenido una infeccin con en virus de la hepatitis b. Determina inmunidad post vacunacin. (Ag Hbe) Antigeno e Identifica husped con replicacin viral de alto riesgo de transmitir el virus. (Ac anti Hbe)Anticuerpo anti antigeno e Identifica husped con menor riesgo de trasmitir el virus.

 (Ac anti Hbc) Anticuerpos totales anti-core Identifica husped con infeccin aguda o pasada. Su positividad significa que ha habido contacto con el virus. IgM anti Hbc IgG antiHbc Inmunoglobulina M anticore Identifica husped con infeccin aguda o reciente Inmunoglobulina G anticore Identifica husped con infeccin aguda o reciente. Dnasa-PCR: Identifica rapidamendamente copias del genoma vira.(Altamente sensible y especifico) ES UN METODO DIRECTO

DIAGNOSTICOS DE HEPATITIS A
Sintomas

Clinica

Epidemiologia

Signos
Hemograma-Erito-PCR

Laboratorio GOT-GPT-FAL-Bilirrubina-Orina
IgM para VHA

Que diagnostico diferencial deberamos tener en cuenta? Si la IgM VHA da negativa?

 Solicitar : IgM-VEB-IgM VCM Si sospechamos una VHC?? Se debe solicitar PCR para aguda Ac Anti VHC para cronica

Si sospechamos una VHE?? Solicitamos PCR

DIAGNOSTICO DE SIFILIS
DIRECTO: Nos permite ver el agente Treponema pallidum.

En que periodo lo solicitamos?

PRIMARIO y SECUNDARIO Cmo lo solicitamos? Microscopia de campo oscuro

De dnde obtenemos la muestra clnica y como?

Periodo Primario Chancro Periodo secundario condilomas

Que es la microscopia de campo oscuro? Es un microscopio ptico que por medio de un diafragma permite que el haz luz emitida no incida en forma perpendicular si no horizontal, permitiendo ver la Morfologa y Movimiento danzante de la espiroqueta Treponema pallidum

VENTAJA:Es diagnostico confirmado DESVENTAJA. Poco sensible depende de la toma de muestra, de la destreza del operador y del inculo presente

METODOS INDIRECTOS SEROLOGICO

Dan positivas entre la 1ra y 3ra semana de la aparicin del chancro

CUALES SON?
NO TREPONEMICAS VDRL:Veneral Disease Research Laboratory TREPONEMICAS
FTA.abs MAH.T.P.

RPR:Prueba rpida de reagina

TP.PA
Western Blot ELISA PCR

V.D.R.L. Prueba de Floculacin, que detecta Anticuerpos (IgM-IgG)

que no son ESPECIFICOS contra el Treponema pallidum,
Son llamados Ac reagnico. Son Ac que actan contra lpidos titulares liberados durante la fase precoz de la sfilis y que estn presentes en la superficie de los treponemas. El Antgeno usado es la CARDIOLIPINA, del corazn de vaca. Es la nica prueba que se puede utilizar para detectar NEUROSILIFIS en LCR

R.P.R: Mide tambin el Antgeno ( cardiolipina) por

AGLUTINACION, con el Ac del suero del paciente NO DEBE SER UTILAZADA EN LCR.

INTERPRETACION DE RESULTADOS:

Cualitativa
Screening inicial Positiva
Confirmar con Treponmica

Cuantitativa
Diluciones crecientes
1dil/2dil/4dil/8dil/16/dil..1

Positiva
Control de Tratamiento

Positiva

Negativiza luego de varios meses o aos

Falsos Positivos
Procesos infeccioso Lepra Hepatitis Mononucleosis Procesos no Infecciosos Embarazo Colagenopatias Autoinmunes

TREPONEMICAS:
Detectan Anticuerpos especficos de Treponema pallidum. Son positivas antes que las no treponmicas y no negativizan casi nunca.
FTA.ABS :(Fluorescent Treponemal Antibody Absorpsion) Se llama absorbida por que
mediante anticuerpos neutralizantes absorben cualquier Ac de otros Treponemas no pallidum/pallidum (Monoclonales) MHA.T.P : (Microhemoaglutinacion Treponema pallidum) TP.PA( aglutinacin de partculas) ELISA: ENZIMOINMUNOENSAYO Western Blot: Test confirmatorio especifico. Se usan clulas complejas de Treponema como antgeno.Permite la transferencia de las protenas a la menbrana. con el bloqueo de la menbrana no ocupada por las protenas y una unin del ligando a las protenas transferidas
4.Deteccin mediante un anticuerpo secundario.

PCR :Detecta el genoma, lo amplifica lo revela y lo compara con un patron

SENSIBILIDAD 99,9 % ESPECIFICIDAD 100% Estn siendo utilizadas para LCR, en Neonatos. e inmunocomprometidos

INTERPRETACION:
Las pruebas NO TREPONEMICAS se debe utilizar en el seguimiento de la enfermedad y tratamiento. Siempre van a ser positiva despus que las Treponmicas, su titulo va a ir disminuyendo aunque los pacientes no estn tratado y un 25% de los pacientes con Sfilis tarda son negativas. Si el tratamiento es eficaz los ttulos disminuyen considerablemente, por lo que sirven como vigilancia del tratamiento. LAS TREPONEMICAS: Son menos influibles por las terapias Se mantiene generalmente durante toda la vida y la seroconvercin se observa e menos del 25 % de los pacientes. La positividad en los lactantes hijos de madres infectadas puede representar transferencia pasiva de Ac o una respuesta inmunologica especifica frente a la infeccin, por lo tanto se trabaja con muestras pareadas en el lapso de seis meses En nios no infectados los ttulos disminuyen en los 3 primeros meses.

Diagnostico de Infecciones del Tracto Respiratorio Inferior INFECCIONES RESPIRATORIA.

Neumona de la comunidad.(N.C.) Neumona Nosocomial (N.N.) Neumona Asociada a Respirador( A.R.M)

Para Recordar:
El (T.R.A.S.): Es la fuente ms importante de contaminacin para Muestras como:

Esputos, STB, BAL, ( en saliva y crestas gingivales hay entre 10(6 12) ufc\ml con ms de 200 gneros. El rbol traqueobronquial en personas sanas normalmente es ESTERIL, o con muy bajas concentraciones bacterianas.

 B.A.L. Es ms confiable y representativo, pero en pacientes no intubados

internados se invade zonas altamente colonizadas como la orofaringe y en los intubados el tubo endotraqueal. Es valorable citologicamente como el esputo la diferencia es el punto de cohorte > o = a 10 (4) ufc\ml.
El Neumonlogo deber siempre descartar la primera toma.

MINI-BAL: Muestra menos invasiva la muestra es obtenida por el Medico

terapista la obtiene inyectando solucin fisiolgica por el tubo endotraqueal a 2cm por encima de la bifurcacin de la traquea (carina),realizando un lavado sin el broquiofibroscopio a ciegas. Es mas valorable que la STB y menos que el BAL; pero mantienen el mismo punto de corte que el BAL

B.A.L. (con cepillo protegido). Altamente representativa.

Punto de corte > o= 10(2) ufc\ml.

S.T.B. Muestra poco confiable muy colonizada por lo menos con 5 gneros
distintos. Su valor en pacientes con RMA,es relativo,es representativo para valorar la flora colonizante
Punto de corte> o = 10(6)ufc\ml.

Biopsia Cielo Abierto: Confirmatoria en diagnsticos Sobre todo en Micosis.

Metodos Diagnosticos para Mycobacterias

En los ltimos aos, en los pases desarrollados se ha asistido a un aumento del aislamiento de numerosas especies micobacterianas, tanto conocidas como de nueva descripcin. As, dentro del gnero Mycobacterium se incluyen ms de 100 especies, muchas de ellas con gran repercusin clnica, ya que son los agentes causales de infecciones humanas con una importante morbilidad y mortalidad, como la tuberculosis y la lepra, entre otras. No obstante, aunque Mycobacterium tuberculosis es, con mucho, la micobacteria ms importante y aislada con ms frecuencia, las micobacterias no tuberculosas (MNT) representan, en la actualidad, entre el 10 y el 30% del total de las aisladas en la mayora de los laboratorios de microbiologa clnica

Adems,un gran nmero de ellas son patgenas para el hombre (micobacteriosis), por lo que requieren un tratamiento especfico para cada caso. Por ello, ante cualquier aislamiento micobacteriano clnico, se recomienda llevar a cabo una identificacin precisa de especie, incluso dentro del complejo M. tuberculosis. Para la identificacin del gnero Mycobacterium existen diversos tipos de abordaje metodolgico: convencional o fenotpico, cromatogrfico y los nuevos mtodos, como el fagotpico y el genotpico o molecular. Los mtodos tradicionales se basan en una identificacin preliminar mediante el tiempo de crecimiento (lento o rpido), los aspectos morfolgicos y de cromogenicidad o produccin de pigmento de las colonias (fotocromgenas, escotocromgenas y no cromgenas). Posteriormente, se llevan a cabo diferentes pruebas bioqumicas para llegar a una identificacin especfica. Sin embargo, la laboriosidad de los mtodos fenotpicos y el crecimiento lento de estas bacterias demoran la identificacin definitiva varias semanas. y en muchos casos es imposible identificar la especie.

MYCOBACTERIOSIS
Complejo Tuberculosis :
Mycobacterium tuberculosis-bovis. africanun-microtti

Mycobacterias Atipicas:
Crecimiento Rpido Crecimiento Lento Fotocromogenas -Escotocromogenas No cromgenas (Kansasii-Marinum-Chelonae- Avium-Abscesus-Smegmatis, et)

METODOS DIRECTOS RAPIDOS Baciloscopia. ( B.A.A.R) Fluorescencia Coloracin de Ziehl-Neelsen.

Caractersticas de coloracin
Micobacteria son llamadas cido alcohol
resistente (BAAR) por su apariencia microscpica despus de la decoloracin Aparecen rojos en un campo azul

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Diagnstico de Laboratorio de TB: Baciloscopa

Rpida Fcil de realizar Bajo costo Detecta la mayora de los casos infecciosos Relativamente sensible

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Tincin fluorescente
Cuando se realiza tincin de los extendidos con los fluorocromos auramina-O auramina- rodamina, los BAAR se ven como bastoncillos amarillos fluorescentes. Para observarlos se utilizan microscopios de fluorescencia con luz halgena y un sistema especial de filtros. Los extendidos son examinados con un objetivo de poco aumento, 40x, lo que permite observar una superficie mucho mayor del frotis en menor tiempo. Uno de los inconvenientes de esta tcnica es que se produce mayor cantidad de artefactos. Por consiguiente se debe confirmar las baciloscopias positivas recoloreando el mismo frotis teido con fluorocromo por la tcnica de Ziehl Neelsen. En cambio, los frotis coloreados mediante la tcnica de Ziehl Neelsen no pueden ser reteidos con fluorocromos.

CULTIVO
El cultivo incrementa la posibilidad de detectar el bacilo de la tuberculosis en las muestras de casos que estn afectados por un bajo nmero de bacilos, como los nios (tuberculosis primaria) o pacientes con tuberculosis extrapulmonar. Adems, permite diferenciar el bacilo de la tuberculosis de otras micobacterias en muestras donde se pueden encontrar ambos, como en orina, contenido gstrico, o las de pacientes que viven con VIH . Por ltimo, permite conocer la sensibilidad de bacilos a drogas antituberculosas e identificar los casos que pueden no responder al esquema de tratamiento de primer lnea. . Esto puede ocurrir entre pacientes tratados en forma irregular o con dosis insuficientes, y entre sus contactos. El laboratorio debe encauzar la investigacin por cultivo

 Medio de Cultivo Loewenstein Jensen

El cultivo es el mtodo estndar de oro, pero dado el lento crecimiento de las micobacterias, el resultado puede demorar hasta 60 das en medios slidos y hasta 30 das en medios lquidos Estos mtodos permiten la identificacin de gneros y especie. Se basan en una identificacin preliminar mediante el tiempo de crecimiento (lento o rpido),los aspectos morfolgicos y de cromogenicidad o produccin de pigmento de las colonias (fotocromgenas, escotocromgenas y no cromgenas). Posteriormente, se llevan a cabo diferentes pruebas bioqumicas para llegar a una identificacin especfica. Fenotipica.

Nuevas Tcnicas Diagnosticas

Cultivos lquido Bactec TB.460

: Equipo semiautomatizado que requiere de

personal especializado. Se basa en la accin del Ac. Palmitico marcado con C14 se capta y se transforma en una cmara de iones leda por sensores. Mide cuantitativamente CO2 producido durante el metabolismo del substrato marcado con 14C presente en el medio. Permite tener sensibilidad antimicrobiana. Resultado a los 8-15 das LIMITACIONES Costos elevados.

Bactec 960-fluoro mtrico: Similar al TB 460, pero no trabaja con istopos

radioactivos, capta alo de fluorescencia en presencia del O2 por emisin de luz ultravioleta. Se obtiene resultados entre 7 a 10 das. Automatizado realiza pruebas de sensibilidad.

MGIT: Similar al 960,pero puede ser utilizado en forma manual, los tubos tienen
indicadores de crecimientos, que emites una luz fluorescente Ventajas 1.Reduce contaminacin cruzada 2.No emplea agujas para inoculacin 3.No Istopos radiactivos 4.Es mas econmico

Tubo indicador de crecimiento bacteriano MGIT

Mtodos de Ultima Generacin

Identificacin cromatogrfica Una alternativa a la identificacin tradicional es el anlisis cualitativo de la composicin lipdica de la pared celular de estos microorganismos (hasta el 40% de su peso seco), mediante diversos estudios cromatogrficos: cromatografa en capa fina (TLC), cromatografa de gases (GLC) y cromatografa lquida de alta presin (HPLC). Identificacin mediante fagos especficos Entre los nuevos mtodos de identificacin, recientemente ha aparecido la utilizacin de bacterifagos con afinidad especfica por las micobacterias. Desde 1947, se han descrito ms de 250 micobacterifagos.

Amplificacin de secuencias de ADN especficas Este grupo de tcnicas son en la actualidad las que presentan un mayor inters y capacidad de desarrollo. Todas ellas requieren de una amplificacin, mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) u otro sistema, de una zona de ADN concreta (diana) y la observacin directa de los fragmentos obtenidos o de un posterior anlisis post amplificacin ms completo mediante restriccin, hibridacin o secuenciacin.

PCR

TECNICA SEROLOGICA

Prueba de la tuberculina

La prueba tuberculina es un extracto de cultivos de M. tuberculosis obtenido del filtrado del cultivo de bacilos tuberculosos, esterilizado y concentrado. Util para diferenciar individuos infectados y no infectados y por lo tanto considerada como buen mtodo para detectar la infeccin tuberculosa en individuos asintomtico Actualmente el tipo de anfgeno que se utiliza en la tuberculina es el PPD(purified protein derivative). La tcnica mas comn para realizar la PT es la intradermorreaccion, conocida como tcnica de Mantoux. Se practica mediante la inyeccin intradrmica en la cara ventral de antebrazo de 0,1ml de PPD, a la dosis de 2UT. Para evitar errores y garantizar que se administra intradermicamente, es importante que, tras la inyeccin, aparezca un pequeo globito que se desvanece poco tiempo despus. La lectura se realiza a las 4872h, aunque puede ser valida en los primeros7das. Se debe medir el dimetro transversal respecto al eje longitudinal del antebrazo exclusivamente de la induracin.

FUNDAMENTO INMUNOLGICO DE LA PT
La prueba de tuberculina se basa en el hecho que infecciones por M. tuberculosis producen sensibilidad, ya que la tuberculosis es una enfermedad para la inmunologa considerada un modelo clsico por excelencia donde se presentan las interacciones entre un microorganismos intracelular y los sistemas de defensa tanto innatos como adquiridos y de la relacin entre la inmunidad mediada por clulas (CMI) y la hipersensibilidad celular retardada (HCR) donde una misma reaccin inmunolgica bsica puede resultar en una respuesta protectora o en dao tisular. El conocimiento acumulado sobre estos aspectos nos permite definir la TB, adems de cualquier otra definicin, como enfermedad inmunolgica en la que: Estn comprometidos todos los componentes del sistema inmune identificados hasta el momento. El dao tisular es causado por la respuesta inmune anti-microbiana, ms que por un efecto directo de la micobacteria, o alguno de sus productos, sobre un tejido o clula en particular. En los pacientes con TB se encuentran alteraciones inmunolgicas de diversa ndole que pueden explicar muchos de los fenmenos clnicos observables en ellos. Con la prctica de la PT se pone al individuo en contacto con los antgenos bacilares (AG) contenidos en la tuberculina, que han sido obtenidos de cultivos de M. tuberculosis que contiene diversos antgenos que son comunes a todas las especies del gnero Mycobacterium, por esto, la PT es poco especfica

Si no est infectado por el bacilo tuberculoso, no se produce ninguna reaccin y el sujeto es catalogado como no-reactor o tuberculino negativo.

Si la persona est infectada por el M. tuberculosis, los Ag. de la tuberculina estimulan los linfocitos T sensibilizados y desencadenan, en el lugar de contacto una reaccin de hipersensibilidad celular retardada, que se manifiesta pasada 48 horas, por una zona de infiltracin y eritema, a veces con vesiculacin o necrosis que se trata de la PT o reaccin tuberculina positiva. Lo nico que indica que una PT es positiva es la capacidad de responder del organismo frente a uno o a varios antgenos del M. tuberculosis como consecuencia del contacto natural o adquirido con el germen, por lo tanto la prueba positiva no evala la inmunidad, sino el grado de hipersensibilidad celular retardada que est inducida y mantenida por bacilos vivos, o sus antgenos, localizados en cualquier punto del organismo del husped. En la mayora de los nios la reactividad tuberculnica aparece por primera vez a las 3 a 6 semanas y en ocasiones hasta 3 meses despus de la infeccin inicial. La reactividad tuberculnica causada por infeccin por M. tuberculosis contina toda la vida de los individuos, incluso despus de administrar quimioterapia preventiva.

No existe ningn mtodo confiable para distinguir las reacciones tuberculinicas causadas por vacunacin con BCG de las causadas por infeccin natural. La inmunidad mediada por clulas y la hipersensibilidad retardada (HCR), son fenmenos estrechamente relacionados que ocurren en el husped como resultado de la activacin de los linfocitos T. La HCR es una reaccin inmunolgica del husped a la infeccin, pero no participa en la deteccin o destruccin del germen infeccioso; es responsable de la positividad de la prueba cutnea a la tuberculina. Tambin la HCR es responsable de algunos efectos deletreos de la tuberculosis como son, la caseosis y la cavitacin10. Por lo tanto, mientras la HCR se considera que tiene procesos en detrimento del husped, la CMI ejerce acciones benficas. El balance entre HCR y la CMI es diferente entre individuos y est genticamente determinado. Lo anterior es importante para conocer, cmo un individuo responder a una infeccin activa por M tuberculosis.

Para considerar una PT como positiva e indicativa de infeccin tuberculosa se debe tener en cuenta la probabilidad de que el individuo se haya infectado por el bacilo tuberculoso y el riesgo que tenga para desarrollar la enfermedad. Para poder interpretar de forma adecuada la PT es conveniente buscarla cicatriz de la vacuna BCG. La prueba se considera positiva cuando la induracin es mayor a 5mm en las personas que no han sido vacunadas con BCG. Casi el 90% de los pacientes que muestran una induracin de 10 ml, como respuesta al PPD-S y prcticamente todas las de 15 ml estn infectados; las induraciones de 5 a 9 ml deben considerarse sospechosas de tuberculosis en reas de incidencias reducidas de micobacterias no tuberculosas, si la reaccin es de 5 ml, se considera negativa Una PPD positiva en un nio a quien no se le ha aplicado BCG, significa que est infectado con el bacilo tuberculoso, pero si recibi la vacuna BCG, es de esperar una reaccin positiva sin haber un modo de diferenciar, si esta es por la vacuna o la infeccin. En el caso de antecedente de aplicacin de vacuna BCG, corroborado con cicatriz, se considera como positiva una induracin de igual o mayor de 15 ml hasta por 3 a 5 aos de aplicacin de la vacuna. Una prueba de tuberculina no sensibiliza a una persona no infectada, pero puede aumentar la hipersensibilidad inducida tiempo atrs, por lo tanto un paciente con reaccin dudosa, debe realizarse un refuerzo cuatro4 semanas ms tarde, para evitar el efecto de refuerzo (booster) y posiblemente tenga una reaccin positiva mayor de 10 ml.

 Segn indican algunos Autores las causas ms comunes de falsos negativos a la prueba de la tuberculina son la desnutricin severa, las formas severas de TBC y la infeccin por HIV. Las causas ms frecuentes de falsos positivos son infeccin por otras micobacterias, vacunacin previa con BCG, aplicacin o interpretacin inadecuada. . Existen diversos factores que permiten que un nio tenga una prueba de tuberculina negativa, incluyendo enfermedad general anergizante, tuberculosis sistmica grave (se observa en un 20%), infecciones vrales como sarampin, varicela, infeccin por VIH SIDA, desnutricin, teraputica con inmunosupresores, administracin reciente de vacunas con virus vivos, defecto en la conservacin de PPD o en la tcnica de aplicacin. Una reaccin de Mantoux negativa nunca excluye la infeccin o la enfermedad tuberculosa. Aproximadamente el 10% de los nios inmunocompetentes con TB documentada por cultivo no reaccionan inicialmente a 5 UT de PPD13. Las reacciones cutneas de control para evaluar anergia indicadas en pacientes con inmunosupresin sospechada o comprobada y en aquellos con posible enfermedad diseminada grave disponible es el BCG test. Las causas de PPD falso positivo incluyen infeccin por micobacteria no tuberculosa o atpicas, alergia a los componentes del PPD, Vacuna previa con BCG (menos del 10% de los casos e interpretacin incorrecta).

En los vacunados con BCG la interpretacin de la PT es complicada por la interferencia de la vacunacin en la PT y la dificultad de discernir entre el efecto de la vacuna y la infeccin

Pruebas de determinacin de la produccin de interfern gamma

Las tcnicas se basan en la deteccin del interfern gamma en sangre (interferon gamma releaseassay [IGRA]), una citocina fundamental en el control de la infeccin tuberculosa, que se libera como respuesta a la estimulacin in vitro de las clulas T sensibilizadas con antgenos especficos de M. tuberculosis. En la actualidad se emplean para la estimulacin de las clulas T los antgenos de la regin gentica RD1: early secretory antigen target (ESAT-6) y culture filtrate protein 10 (CFP10),y el antgeno de la regin genetica RD11: RV2654, presentes en el complejo M. tuberculosis pero ausentes tanto en la vacuna BCG como en la mayora de las restantes micobacterias (excepto en Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum Las tcnicas IGRA permiten discriminar a los individuos infectados por M. tuberculosis de los vacunados por BCG y de los infectados por otras micobacterias, excluyendo las mencionadas. Adems, incorporan controles para detectar anergia y excluir, asi, a los falsos negativos. Por otra parte, pueden repetirse inmediatamente sin el riesgo de estimulacin de la inmunidad, con lo que se evita el efecto booster. En la actualidad se dispone de 2 pruebas comercializadas: QuantiFERON-TB Gold In-Tube, que utiliza tecnicas de ELISA, y T-SPOT-TB, basado en la tecnica ELISPOT