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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ

GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
ESCUELA DE MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA

PRUEBAS DE INFECTIVIDAD EN VIRUS


Y DIAGNOSTICO SEROLOGICO

AUTORES: AYCACHI INGA ROMULO


ARIAS MATOS LISBETH
CHAFLOQUE MILLONES ALEX
CULQUI LOZADA LILIANA

Seminario Monografía que se


presenta como requisito parcial del
curso de Virología.

LAMBAYEQUE, 2007

-1-
DEDICATORIA

A nuestros padres por ser los que día a día


nos dan fuerza para continuar luchando por
la vida y hacer posible nuestras metas, a
nuestros profesores por ser los que nos
forman profesionalmente.

-2-
CUANDO LA VIDA TE PRESENTE MIL RAZONES PARA
LLORAR, DEMUESTRALE QUE TIENES MIL Y UNA
RAZONES PARA SONREIR

Facundo Cabral

-3-
AGRADECIMIENTO

A Dios por permitirnos vivir. A quienes


con su comprensión y cariño nos han
permitido la elaboración de este
Seminario - Monográfico

-4-
INDICE

PÁG.
I. INTRODUCCIÓN 1
II. PRUEBAS DE INFECTIVIDAD 2
2.1 Inoculación de animales susceptibles 2
2.2. Inoculación de huevos embrionados (fecundados) 5
2.3 Aislamiento en cultivos celulares 7
2.3.1 Sistemas de cultivo más utilizados 9
2.3.2 Aislamiento y detección 11
III. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO 13
3.1 METODOS DIRECTOS 14
3.1.1 La Presencia de Antígenos Virales (técnicas inmunológicas) 14
A.-INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID) 14
B.-TEST DE AGLUTINACION EN LATEX 15
C.- INMUNOENSAYO 16
3.1.2 El Virus Como Partícula Viral 17
A. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA 17
3.1.3 Técnicas de Diagnóstico Molecular 18
A. ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN. 19
B. TÉCNICAS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO 21
NUCLEICO.
C. VENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES. 24
D. DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES. 25
3.2. MÉTODOS INDIRECTOS 25
3.2.1 Pruebas serológicas Indirectas que dependen de la capacidad 25
del anticuerpo que se une al antígeno para ejercer alguna
función no relacionada con el virus. Dentro de estoas pruebas
tenemos:
A. Fijación del Complemento: (FC) 25
B. Hemoaglutinación Indirecta. 27
C. Aglutinación de látex. 28
3.2.2 Pruebas Serológicas Indirectas que revelan la capacidad de los 28

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anticuerpos para bloquear la infección viral especifica; dentro
de estas pruebas tenemos:
A. Neutralización Viral. 28
B. Inhibición de la Hemoaglutinación : (IH) 30
3. 2.3. Pruebas Serológicas que miden la Interacción Antígeno- 31
Anticuerpo
A. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) 31
B. Inmunoensayo Ligado a Enzimas (ELISA) 32
C. Inmunoblot o Western Blot 33
Referencias 35

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I. INTRODUCCIÓN

Debido a que los virus, como ocurre con los plásmidos, se replican solo dentro de
células vivas, la investigación sobre virus requiere el uso de hospedadores apropiados.
Para el estudio de los virus bacterianos se usan cultivos axénicos en medio líquido o en
medio semisólido con agar. Como la mayor parte de las bacterias son fáciles de cultivar,
resulta relativamente simple estudiar los virus bacterianos y por esta razon se dispone de
un crecimiento detallado de la multiplicación de estos virus.
En lo que respecta a los virus de los animales, el hospedador inicial puede ser un
animal susceptible al virus, pero a efectos de investigación es deseable disponer de
hospedadores mas manejables. En 1907 el biólogo estadounidense Ross Granville
Harrison descubre que los tejidos vivos pueden cultivarse, es decir, pueden crecer fuera
de su órgano original. Este fue el comienzo para el desarrollo de los cultivos de tejidos y
mas adelante el de los cultivos celulares (lineas celulares). Muchos virus animales
pueden ser cultivados en cultivos de tejidos o cultivos celulares, y el uso de tales
cultivos ha facilitado enormemente la investigación sobre los virus.
Los anticuerpos, al ser específicos de antígeno y por tanto específicos del patógeno,
son componentes críticos de la respuesta inmune, interaccionan específicamente con el
antígeno sobre las células diana pero no matan a las células. Existe un grupo de enzimas
inespecíficas conocido en conjunto como complemento que puede fijarse a los
anticuerpos unidos al patógeno y lisar las células con el anticuerpo unido. La respuesta
inmune es específica para anticuerpos individuales y depende de anticuerpos
específicos, pero puede ser mediada o estimulada a través de mecanismos específicos
como el complemento.
En muchos casos, la inmunidad mediada por anticuerpos no es un mecanismo eficaz
para controlar la diseminación de la infección. Algunos agentes infecciosos parasitan el
organismo desde el interior de las células. P.ej. los virus animales se reproducen
utilizando los sistemas celulares del hospedador y, en consecuencia, gran parte de su
ciclo vital transcurre en el interior de las células del hospedador. Teniendo en cuenta que
los anticuerpos están armados para reconocer al patógeno libre en la sangre, o a nivel de
las superficies mucosas, las células infectadas del hospedador deben ser identificadas y
destruidas por diferentes medios, generalmente a través de interacciones célula a célula
propias de la inmunidad celular. Por fortuna, todos los patógenos endógenos producen
antígenos que a su vez son presentados sobre la superficie de células diana infectadas.

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El antígeno es reconocido por una célula T citotóxica (TC) u actúa directamente sobre la
célula diana infectada secretando proteínas citolíticas, llamadas perforinas, que
destruyen la célula infectada.
En el diagnostico de una enfermedad infecciosa no siempre es posible el aislamiento
del patógeno. Una posible alternativa, en estos casos, es cuantificar el título de
anticuerpos frente al patógeno que se sospecha. Cuando un individuo sufre una
infeccion de la que se sospecha el patógeno etiológico, el título de anticuerpos, puede
medirse mediante aglutinación, precipitación, enzimoinmunoanálisis (ELISA), métodos
de inmovilización o radioinmunoensayo (RIA). La tecnica general consiste en
establecer una serie de diluciones del suero (habitualmente diluciones al doble: 1:2, 1:4,
1:8,1:16, 1:32, y así sucesivamente) y determinar la dilución máxima a la que se
produce la reacción antígeno-anticuerpo.
Una sola medida del título de anticuerpos no indica infección activa. Después de la
infeccion, muchos anticuerpos dan títulos altos durante mucho tiempo; para establecer
que una enfermedad aguda se debe a un determinado patógeno, es esencial demostrar
una elevación del título de anticuerpos en muestras sucesivas de suero del mismo
enfermo.
En algunos casos, sin embargo, la mera presencia de anticuerpos puede ser
suficiente para indicar infección. Así sucede cuando el patógeno se presenta raramente
en la población. La presencia de anticuerpos es suficiente para indicar la existencia de
una infección en el individuo. Un ejemplo significativo es el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Se dispone actualmente de una prueba de ELISA
muy sensible y fiable para la detección de anticuerpos contra el VIH. La exquisita
sensibilidad del ELISA permite incluso la detección de título de anticuerpos muy bajo,
por lo que se utiliza el ELISA rutinariamente para el rastreo de la infección por VIH en
muestras de sangre.

II. PRUEBAS DE INFECTIVIDAD

2.1 Inoculación de animales susceptibles

En los primeros intentos para cultivos de virus, se utilizaba el huésped animal


definido del agente por estudiar. Estos intentos tropezaban con la complejidad
propia del animal entero, y las grandes diferencias de sensibilidad de un animal
a otro, incluso dentro de una misma especie. El descubrimiento y desarrollo de

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cultivo in Vitro de células capaces de mantener la duplicación hizo que ya no se
requiriera a los animales para la conservación ordinaria de la mayor parte de
agentes virales. Hoy en dia la inoculación de animales susceptibles es usada en
estudios de infectividad, ya que algunos virus no provocan efectos reconocibles
en cultivos celulares pero originan la muerte en animales. También es usada para
estudiar la oncogénesis viral, la patogenia de los padecimientos virales, la
respuesta inmune a los virus y el efecto de los factores ambientales sobre las
infecciones virales, así como el aislamiento primario de ciertos agentes.
El método que se utiliza para inocular los virus a los animales depende de la
sensibilidad del huésped respecto al virus, así como de la naturaleza de la prueba
o del experimento. Es frecuente recurrir a las siguientes vías de inoculación:

- Intravenosa - Intranasal
- Intracerebral - Intratraqueal
- Intraperitoneal - Intradermica

Una vez lograda la duplicación del virus, se recogen tejidos pertenecientes a las
zonas correspondientes del organismo, se les secciona u homogeniza y se almacena
(generalmente a baja temperatura) para emplearla después como fuente de virus.
El procedimiento general para una prueba de infectividad es realizar una dilucion
seriada de la muestra desconocida, normalmente por diluciones decimales sucesivas,
e inyectar muestras de cada dilucion a un cierto número de animales sensibles. Tras
un periodo de incubación adecuado, se cuentan los animales vivos y muertos
inyectados con cada una de las diluciones de la serie. Se suele considerar como valor
de referencia la dilucion a la cual la mitad de los animales mueren. Aunque los
métodos de diluciones seriadas son más prolijos y menos exactos que los basados en
cultivos celulares, resultan esenciales en el estudio de algunos tipos de virus.
Otros usos de las inoculaciones en animales susceptibles son la comprobación de la
inocuidad y poder protector de vacunas (poliomielitis), elaboración de éstas (rabia,
viruela), efecto neutralizante de sueros inmunes y de pacientes (con fines
comerciales y diagnósticos), etc., aunque su importancia se restringe cada vez más
por los avances logrados con los cultivos de tejidos. Entre los animales que se
emplean están monos, conejos, aves, ratas y ratones; estos últimos más que ningún
otro.

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Diferentes tipos de animales usados en laboratorio para la inoculación de virus

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2.2. Inoculación de huevos embrionados (fecundados)

Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante mas de 15 años. El
cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por primera vez por
Burnet en 1935, demostrando que el embrión de pollo es un medio muy sensible
para el aislamiento de estos virus, siendo además un medio estéril y poco costoso.
Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo
fecundado, o en el propio embrión en desarrollo. También se emplearon huevos de
pato y de ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de
incubación mas prolongado que el pollo; pero como regla, sigue usandose huevo de
gallina de 6 a 8 días de incubación aproximadamente (a veces se usa huevos de mas
tiempo de incubación).
Para preparar los huevos para el cultivo, en primer lugar se desinfecta la superficie
de la cáscara con yodo, y se perfora con un pequeño taladro estéril. Tras la
inoculación, el agujero del taladro se sella con gelatina y se incuba el huevo. Los
virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por
consiguiente, se deben inyectar en la region apropiada, P. ej. los mixovirus crecen
bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere
la cavidad alantoidea. La infección puede producir una lesion tisular local conocida
como pústula, cuyo aspecto, a menudo, es caracteristico del virus.
El método exacto de inoculación y la edad del embrión que se emplea, dependen del
virus problema. P. ej. para aislar en forma primaria el virus de la influenza a partir de
material recogido de la garganta, suele inocularse este en la cavidad amniótica de
embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica fácilmente en la membrana
alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después de varias resiembras
(“adaptación”) en el amnios. Los focos mas utilizados para la inoculación, a parte de
las cavidades amniótica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco
vitelino. Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrión en
desarrollo, recurriendo a la inculacion intravenosa, intraperitoneal o intracerebral.
Una vez que se duplicó el virus dentro de las células de las membranas o del
embrión, puede liberarse a los líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una
buena fuente de virus. P. ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema
respiratorio del embrión y en las células de la membrana amniótica, pasa al liquido
amniótico, que luego puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros

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virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana
corioalantoidea, siguen unidos a las células en las lesiones o “pústulas” que se
forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una solucion salina isotónica
las membranas, logran liberarse estos virus.
En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrión de pollo puede provocar
la muerte del embrio (p.ej. virus de la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la
membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar
hemaglutininas en los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar
virus infectante (p.ej. poliovirus tipo 2).
En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la técnica
de inoculación de huevos embrionados al correlacionar el número de pústulas
contadas con la dilucion viral inoculada.
Actualmente el método preferido para cultivar virus de influenza aviar es la
inoculación en huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) o huevos
negativos a anticuerpos específicos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de
las muestras se inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 días de
incubación y se incuba a 35-37ºC durante 4-7 días. Luego los huevos con embriones
muertos, cuando esto ocurra, o los que queden al final del periodo de incubación se
refrigeran a 4ºC y el líquido alantoideo se chequea con la prueba de
hemaglutinación. Si se detecta actividad de hemoaglutinatión hay una probabilidad
alta de la presencia de virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos
que den reacción negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos.

Inoculación de huevos embrionados para cultivo de virus de la gripe aviar

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Estructura y puntos de inoculación en un huevo embrionado

2.3 Aislamiento en cultivos celulares

Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben utilizar


sistemas basados en líneas celulares que permitan su desarrollo. Los cultivos
celulares son un tipo de biosustrato empleados para la propagación de los virus,
constituyen, desde 1950, el sistema más empleado para el aislamiento y propagación de
la mayoría de los virus, consisten en un sistema formado por células provenientes de un
órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composición
química definida y en condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad
controladas. Dentro de éstos, los más usados son los cultivos en monocapa, aunque
hay otros sistemas (cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos
en microcarriers, etc). Los cultivos celulares en monocapa consisten en una capa de
células que crecen adheridas a la superficie del recipiente que las contiene. Estos
cultivos se preparan tratando el tejido original u otra monocapa con un agente que
dispersa las células (una enzima o un agente quelante, o ambos combinados) para
luego transferir la suspensión celular obtenida a un recipiente de vidrio o plástico en
donde las células se adhieren y multiplican. La invasión viral se evidencia a través
de un cambio celular o efecto citopático (EC) y mediante pruebas complementarias.

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No existe un cultivo celular susceptible a todos los virus, de modo que un laboratorio de
diagnóstico viral debe disponer de distintos cultivos celulares. Por ejemplo, el virus
herpes simplex crece bien in vitro en cultivos primarios, cepas y líneas celulares
(MRC-5, RK, HEp-2, HeLa, Vero u otras); en cambio, otro virus de la misma familia, el
citomegalovirus (CMV) sólo crece en cultivos primarios de pulmón fetal humano o bien
en algunas cepas celulares derivadas del mismo órgano y especie (MRC-5). Por otro
lado, una línea celular como HEp-2 puede ser bastante sensible a adenovirus, VRS,
parainfluenza, herpes simples, poliovirus y otros, pero no permitir el crecimiento de
CMV, rotavirus, influenza, etc; además, es posible que los pasajes sucesivos de una línea
la hagan disminuir su sensibilidad a algunos virus, como sucede con Hep-2 en relación a
VRS.

Tipos caracteristicos en cultivos celulares

Medio de cultivo para tejidos Coloración de Giemsa

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2.3.1 Sistemas de cultivo más utilizados

• Cultivos primarios: Se caracterizan por tener varios tipos de células. La


mayoría son de crecimiento limitado in vitro, generalmente resisten 5 a 10
subcultivos y son permisivas a un amplio rango de virus; p. e., células de riñón
embrionario humano (REH).
• Cepas de células diploides: Derivadas de tejidos normales, se utilizan en la
producción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materiales
tóxicos. Están constituidas por un tipo de células que retienen su número
cromosómico diploide original; p.e., los fibroblastos de pulmón.
• Líneas celulares: Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten (n)
número de pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de tumores
malignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., células Vero
(riñón de mono verde africano), LLC-MK2 (riñón mono rhesus) y BSC-1
(también de tejido normal de riñón de mono) y HeLa y HEp-2 derivadas de
células humanas malignas. Éstas generalmente tienen un número variable de
cromosomas y a veces también son denominadas líneas celulares heteroploides.
Otras líneas celulares existentes son A9 (fibroblastos subcutáneos de ratón),
BHK21 (fibroblastos de hámster), BRL3A (epitelio de hígado de rata), GHI,
GH3 (epitelio de rata), L929, LS, S180 (fibroblastos de ratón), L1210, L5178Y,
P388D1 (linfocitos de ratón), MCF7 (epitelio humano), 3T3-L1 (fibroblastos de
ratón suizo), 3T3-A31 (fibroblastos de ratón BALB/c) y NRK49F (fibroblastos
de riñón de rata). Algunos ejemplos de lineas celulares son:

HEP-2: Células heteroploides humanas derivadas de carcinoma laríngeo.


Recomendadas para RSV y ADENOVIRUS.
MDCK: Línea celular diploide de riñón canino; para INFLUENZA y
ocasionalmente PARAINFLUENZA.
LLC-MK2: Línea celular heteroploide de riñón de mono Rhesus. Se recomienda
para el aislamiento del virus PARAINFLUENZA. Requiere el agregado de tripsina
cristalina al medio.
MRC5: Línea celular diploide fibroblástica de pulmón embrionario humano. Se
recomienda para el aislamiento de CITOMEGALOVIRUS, HERPESVIRUS.

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Entre las líneas celulares que se emplean con más frecuencia están las células Hep-
2, HeLa y Vero, en cuanto a células diploides las más utilizadas son las líneas de
fibroblastos de pulmón (MRC5) que se usan para el aislamiento de
citomegalovirus (CMV). El cultivo primario más utilizado es el riñón humano
embrionario (RHE) que es permisible a los virus de circulación frecuente como el
herpes (HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV)
etc. En todo caso la elección por una u otra línea celular dependerá del virus que se
quiera evidenciar.

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2.3.2 Aislamiento y detección

Aunque el aislamiento viral es una buena técnica para el diagnóstico de


infecciones virales asintomáticas, crónicas y recurrentes, su eficacia depende del
momento en que se tome la muestra, del transporte óptimo y rápido de las
muestras; además que se debe escoger el tipo de células que sean permisivas para
el virus que se va a demostrar.
Para los cultivos virales se utilizan monocapas celulares adheridas al lecho de un
tubo, que requieren de sustratos esenciales para su mantenimiento, una solución
amortiguadora y un pH adecuado, además se deben suplementar con suero fetal
bovino, que contiene múltiples factores promotores de crecimiento celular. Una
vez que la monocapa se inocula con una muestra pretratada que proviene de un
individuo infectado, el virus se puede descubrir por:

• EFECTO CITOPATICO (ECP):


El efecto citopático son cambios degenerativos específicos observados en una línea
celular como consecuencia de la replicación de un virus infectante. Éste puede
aparecer después de 3 ó 4 días.
A través de éstos cambios morfológicos celulares es posible poner en evidencia la
presencia de un virus en determinado tipo de cultivo de células. La observación
microscópica de las células en busca de ECP debe realizarse diariamente. El ECP
puede ser de varios tipos: la formación de sincicios, o de vesículas o inclusiones o
el redondeamiento y desprendimiento de la monocapa celular.
A veces la inoculación de una muestra o el virus semilla produce efectos tóxicos
transitorios o irreversibles sobre el cultivo celular. Estos pueden tener un efecto
parecido al ECP. Tal toxicidad puede hacerse evidente dentro de las 24 horas y
puede ser reducida o evitada cambiando el medio.
Algunos ECP caracteristicos de virus son:

1. Virus Respiratorio Sincicial: formación de sincicios o células gigantes en Hep-2.


2. Adenovirus: células redondeadas en Hep-2 con formación de racimos dejando
áreas sin células.

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• CUERPOS DE INCLUSION: En ciertas virosis es posible comprobar la
presencia de estructuras anómalas dentro del citoplasma o núcleo de las células
parasitadas, demostrables por tinción según métodos de Mann, Sellers o
Giemsa. Por lo general estas estructuras, llamadas cuernos de inclusión,
muestran afinidad por colorantes ácidos (eosina o fucsina ácida) y son
eosinófilas.
Las inclusiones intracitoplásmicas son redondas u ovales, de aspecto granular, y
caracterizan a algunas infecciones, como la rabia (cuerpos de Negrí) y la viruela
(cuernos de Guarnieri). Las intranucleares son de dos tipos, A y B; la primera
provoca fuerte reacción de la materia nuclear, de modo que la inclusión se
aprecia con un halo claro a su alrededor, libre de cromatina. Estas formas se ven
en la fiebre amarilla y el herpes simple; las de tipo B ocasionan poca respuesta
en la célula y por lo común ocupan los espacios sin cromatina. Se observan en la
poliomielitis.
Los cuerpos de inclusión son de distintos tamaños; se presentan uno o varios en
el citoplasma o en el núcleo y, por fusión, algunos ocupan todo el espacio
nuclear, como sucede en el sarampión. Por medio del microscopio electrónico se
ha comprobado en unos cuantos su integración por agregados de cuerpos
elementales, aunque falta conocer su verdadera estructura.
Los cuerpos de inclusión son de enorme valor en determinadas virosis (los
cuerpos de Negri son peculiares de la rabia), pero en tejidos sanos y en
enfermedades no virales se han encontrado formaciones parecidas a ellos.
El aspecto particular y característico de cada tipo de inclusión suele orientar
sobre el grupo de virus que la produce. La formación de cuerpos de inclusión
ocurre tanto in vivo, en las infecciones naturales, como en los cultivos celulares
infectados.
Aparte de la acción citopática directa, la lesión de las células infectadas por un
virus puede deberse a la respuesta inmune dirigida contra antígenos codificados
por el virus y expresados en la superficie celular.

• HEMADSORCIÓN:
Existen otros métodos para descubrir y caracterizar un virus en cultivo celular
cuando todavía no se produce el ECP, o éste no es evidente o en los casos en que

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el virus se debe reconocer por otras propiedades o características en cultivo.
Dentro de las técnicas que ayudan a identificar estas propiedades virales está la
hemadsorción, que consiste en que cuando el virus infectante incorpora proteínas
virales con propiedad de hemaglutininas en la membrana celular, las células
infectadas se pueden descubrir por la adsorción de eritrocitos de ciertas especies
animales, que se puede observar al microscopio de luz. Es el caso de los
ortomixovirus y paramixovirus que se pueden reconocer por la hemadsorción de
eritrocitos de cobayo a las células; la identificación se confirma con la
inmunofluorescencia directa mediante anticuerpos específicos.
Esta técnica se basa en la capacidad de glóbulos rojos de determinada especie
animal de unirse a proteínas virales que están siendo incorporadas en la
membrana plasmática en las células infectadas. Agregando glóbulos rojos a una
monocapa infectada con virus es posible observar microscópicamente la
adherencia de los mismos a células que contienen virus y que están expresando
antígenos virales en su superficie.
Por medio de esta técnica, es posible demostrar la infección por aquellos virus
que presentan proteínas hemoaglutinantes.

III. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO

Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden
clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia
del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta
de anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.

Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico virológico se basan en pruebas


serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas
antigénicas. Igualmente la detección del genoma viral puede favorecer la precocidad del
diagnóstico viral y su confirmación. En la última década se han desarrollado una serie de
técnicas para el diagnóstico viral basadas en la detección de ácidos nucleicos. De ellas la
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada.

En el momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear


nuevas y más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de
ácidos nucleicos con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido.

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3.1 METODOS DIRECTOS

Son aquellos que detectan:

3.1.1 La Presencia de Antígenos Virales (técnicas inmunológicas)

A.-INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID)


Es una de las técnicas más antiguas y de uso más difundido en el laboratorio clínico.
El principio básico de la inmunofluorescencia directa se ilustra en la figura 1.

Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde


se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con
isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se
combinan con los antígenos víricos en el interior de las células. La reacción
antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la
aparición de fluorescencia de color verde manzana.
Esta técnica se puede utilizar para una identificación rápida del virus directamente
sobre la muestra (por ejemplo: células eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado
nasofaríngeo), o se la puede emplear para la confirmación del efecto citopático
observado en cultivos celulares. Además con el uso de anticuerpos monoclonales
específicos para los antígenos tempranos inmediatos del Citomegalovirus (CMV) es
posible determinar la presencia del CMV en cultivos celulares días antes del
reconocimiento del efecto citopático. Sin embargo la realización de la reacción es

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laboriosa, depende mucho de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio de
fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnóstico certero,
así como una recolección y preparación de la muestra adecuada. Aun así, el método,
en manos de una persona con experiencia resulta útil para la identificación rápida de
ciertos virus como los virus respiratorios, ya que nos proporciona un diagnóstico
etiológico en el curso de una jornada de trabajo. Además puede estudiar varias
muestras simultáneamente. El advenimiento de los anticuerpos monoclonales, ha
incrementado la especificidad y en algunos casos la sensibilidad de estos ensayos.
Los anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína pueden
utilizarse para identificar el virus Respiratorio Sincicial (VRS), Influenza A y B,
Parainfluenza 1,2 y 3 y Adenovirus entre otros, así como para subtipificar especies
virales como, por ejemplo, virus Herpes Simple (HSV) de tipo 1 y 2. Esta técnica
requiere sólo 2-4hs, y se ha reportado una sensibilidad del 70-80 % comparada con
cultivos celulares para la identificación de virus Herpes Simple, 80-95% para VRS y
71% para Influenza A. La tinción con inmunoperoxidasa es similar a la de la
inmunofluorescencia y es la técnica de elección en algunos laboratorios. El
procedimiento implica unos pocos pasos adicionales ya que en este caso el
anticuerpo
monoclonal esta marcado con una enzima que requiere la adición de un substrato
para evidenciar la reacción por un cambio de color que es visible micro y
macroscópicamente.

B.-TEST DE AGLUTINACION EN LATEX

Las partículas de látex son esferas de poliestireno que se unen fácilmente al


fragmento cristalizable (Fc) de moléculas de inmunoglobulina G (IgG) o
inmunoglobulina M (IgM), esta última es mucho más eficiente en aglutinar
partículas naturales. Los fragmentos de unión del anticuerpo (FAb) quedan
expuestos y son capaces de unirse al antígeno que se encuentra en la muestra.
Cuando los antígenos tienen varios epítopes (o estructuras antigénicas repetitivas),
los anticuerpos multivalentes acoplados a múltiples partículas de látex se unen al
antígeno y se produce un entramado de las partículas de látex que dan como
resultado una aglutinación visible. Esta técnica se aplica ampliamente en el
laboratorio de microbiología, porque es fácil de realizar, requiere sólo unos

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minutos y no necesita equipo, pues se lee a simple vista. Sin embargo, ofrece como
desventaja la presencia de reacciones cruzadas sobre todo con otros antígenos en la
muestra y también ocurren interferencias por el fenómeno de prozona, en el que un
exceso de anticuerpos no permite la formación del entramado. Esta técnica se usa
comúnmente para la demostración de antígenos de rotavirus en materias fecales.

C.- INMUNOENSAYO

Ensayos de captura del antígeno (sándwich), inmunocromatografía. Son


inmunoensayos en fase sólida donde se fijan los anticuerpos específicos para el
virus en la superficie de una matriz, tubo o microplaca y luego se pone en
presencia del suero o muestra que contiene el antígeno que se quiere demostrar;
una vez ocurre la reacción antígeno-anticuerpo, se hace un lavado y se agrega un
anticuerpo marcado, que depende de la marcación del anticuerpo. La prueba se
denomina radioinmunoensayo (RIA) o inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA o
EIA) dependiendo del trazador que se utilice para evidenciar la reacción.

• Se denomina RIA cuando el anticuerpo se marca con un isótopo radioactivo, el


más utilizado es el yodo, el anticuerpo que reacciona a manera de sandwich, se
pega a los epítopes del antígeno que han quedado expuestos; después de varios
lavados, se mide o cuantifica la radioactividad mediante un contador de
centelleo. El número de destellos por minuto es directamente proporcional a la
concentración del antígeno que reacciona y de acuerdo con una serie de
estándares de concentración conocida, se realiza una curva y se extrapolan los
valores de la muestra.
• En la técnica ELISA el anticuerpo se marca con una enzima que puede ser la
fosfatasa alcalina (FA) o la peroxidasa de rábano (PR) y para revelar la
reacción se coloca el sustrato específico para la enzima que es modificado por
ésta y produce un compuesto coloreado. En el caso de la FA el sustrato es el
paranitrofenilfosfato y para la PR es el peróxido de hidrógeno en una solución
de ortofenilendiamina (OPD) que hace visible la reacción. Para la
cuantificación se mide la absorbancia en una longitud de onda determinada en
un espectrofotómetro. La absorbancia será directamente proporcional a la

- 22 -
cantidad de antígeno descubierto. Estas técnicas se utilizan ampliamente en el
diagnóstico de hepatitis A y B, rotavirus, el agente Norwalk, ADV, el RSV,
parainfluenza, influenza A y B. Para la hepatitis B la demostración de antígeno
de superficie diagnóstica la infección activa y en VIH la demostración del
antígeno p 24 es útil en el diagnóstico de la infección en niños y en pacientes
que se encuentran en ventana inmunológica, además es de gran utilidad en el
pronóstico y la progresión de la infección así como en el control de la terapia
antirretroviral.

3.1.2 El Virus Como Partícula Viral

A. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

- 23 -
Mediante el microscopio electrónico es posible observar la morfología de los
viriones presentes en muestras clínicas. La limitación del método además del costo
del microscopio, es que necesita de una alta concentración de viriones
(aproximadamente 109 partículas virales/ml, dependiendo del virus) presentes en
la muestra, por ello es poco sensible. Esto hace que sea una técnica poco utilizada,
más aún con el desarrollo de técnicas alternativas de utilidad similar. El
microscopio electrónico nos permite, por ejemplo, obtener resultados positivos
rápidos de muestras de materias fecales de pacientes con diarrea, ya que tanto los
Rotavirus, como los Adenovirus, Coronavirus y Calicivirus pueden ser
visualizados e identificados como causantes de enfermedad. Por ejemplo, los
Rotavirus poseen una forma característica en doble rueda y un tamaño distintivo,
70nm de diámetro, y se los encuentra en concentraciones de hasta 10 11 partículas
virales por gramo de heces. También en otras muestras, como líquido vesicular,
biopsia de tejidos, verrugas, orina o suero es posible obtener resultados positivos,
mediante coloración negativa. Si la concentración de virus en la muestra clínica es
baja, y por tanto no visible directamente por microscopio electrónico, se pueden
utilizar técnicas que aumenten la visualización, por ejemplo, la
inmunoelectromicroscopía, que consiste en el agregado de anticuerpos específicos
antivirales y la formación de agregados de partículas que son más fácilmente
visibles que las partículas solas. Fig. 5.

3.1.3 Técnicas de Diagnóstico Molecular

- 24 -
Para el diagnóstico de una enfermedad infecciosa, además del diagnóstico directo
(visualización y/o cultivo del agente infeccioso) y del diagnóstico indirecto
(detección de anticuerpos frente al agente infeccioso), disponemos de la
posibilidad de analizar la presencia de los ácidos nucleicos del agente infeccioso
en la muestra clínica mediante técnicas de diagnóstico molecular. Este
procedimiento permite, entre otras ventajas, detectar de una forma rápida
microorganismos difícilmente cultivables, como muchos virus (VIH, hepatitis B) y
bacterias orales (Treponema denticola).
Las ventajas de las técnicas moleculares ha sido ampliamente publicitadas en los
últimos 7 años, lo que sin duda ha aumentado la presión en los laboratorios
clínicos para comenzar a usarlas en una amplia variedad de enfermedades
infecciosas, genéticas, oncológicas y neurológicas.
Las técnicas de diagnostico molecular comprenden técnicas que evidencian o
descubren el material genético específico viral conservado y replicable ya sea que
se encuentre en un fluido, en una célula o tejido, ya sea activo o latente. Estas
técnicas, que son más rápidas que las tradicionales, permiten hacer estudios en
tejidos almacenados y se pueden clasificar en dos categorías:

A. ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN.

 Hibridación con sondas.


La emergencia de la biología molecular ha dado lugar a nuevas herramientas
moleculares que han adaptado rápidamente al campo del diagnostico viral. El
diagnostico basado en el DNA esta revolucionando al abordaje integral de la
identificación y monitorización de las enfermedades infecciosas, genéticas, y
neoplásicas, y otros cuadros clínicos, este nuevo enfoque utiliza factores
genotípicos mas que fenotípicos para identificar patógenos específicos. El poder
del diagnostico basado en el DNA se debe a dos hechos: (1) los ácidos nucleicos
pueden medirse de forma rápida y sensible, y (2) la secuencia de nucleótidos en
una determinada molécula de DNA es tan específica que pueden usarse los análisis
de hibridación para diagnostico clínicos fiables.

En un ensayo de hibridación molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones


pueden ser: DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA.

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Para realizar este ensayo se dispone de sondas de acidos nucleico, pues esta sonda
es una sola hebra de DNA que contiene secuencias caracteristicas de un
determinado virus.

La sonda de acido nucleico se obtiene, se obtiene la extraer secuencias secuencias


específicas de un fragmento de ADN por medio de las endonucleasas de
restricción. Luego estas secuencias extraídas, se pueden desnaturalizar y marcar ya
sea con una enzima o con un isótopo radioactivo. A estas cadenas marcadas y que
tienen una secuencia conocida se llaman sondas de ácidos nucleicos. Hoy en día se
están produciendo sondas de ácidos nucleicos sintéticas, con lo que se obtiene
sondas de oligonucleótidos de muy alta especificidad que están disponibles
comercialmente y son las más usadas en los laboratorios.

Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los


ácidos nucleicos. Posteriormente se añade un DNA marcado, complementario del
DNA del virus y se incuba en condiciones para que se produzca la hibridación. La
muestra se pasa entonces por una columna que contiene un gel que separa la sonda
ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada.

Dependiendo de como este marcada la sonda, se detecta la hibridación: Si está


marcada con un isótopo radiactivo se puede hacer una lectura en un contador
gamma de manera que la cantidad de radiación medida en la columna es
directamente proporcional a la cantidad de DNA viral presente en el suero
problema o también se puede realizar la electroforesis del DNA hibridado con la
sonda marcada en gel de poliacrilamida y detectar la radioactividad emitida por la
sonda mediante la aplicación de una placa de rayos X (Autoradiografía). Si esta
marcada con una enzima se detecta por una simple evaluación colorimétrica.

ADN blanco Desnaturalización de ADN Hibridización de la sonda con el ADN blanco

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Hibridación con sondas

B. TÉCNICAS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO.

 Reacción en cadena de la Polimerasa. (PCR)

Una nueva técnica, llamada Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), fue


desarrollada por Saiki et al., para incrementar el número de moléculas de DNA
blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una
única molécula de DNA y una sola copia de genes puede ser extraída, de mezclas
complejas de secuencias genómicas y visualizada como bandas diferentes en geles
de agarosa.

La PCR es, por tanto, una amplificación de secuencias específicas del DNA. Se basa
en la utilización de secuencias cortas de nucleótidos sintéticos llamados primers o
cebadores, que se hibridan de forma especifica con cada una de las cadenas de DNA
, previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reacción
tenga lugar se usa una enzima, Taq pol (ADN Polimerasa termoestable obtenida de
la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucleótidos trifosfatos. La función natural de
la DNA polimerasa consiste en reparar y replicar el DNA. Los deoxinucleótidos
trifosfatos se necesitan como ladrillos para la construcción. El nucleótido al cual se
una la polimerasa será complementario de la base en la posición correspondiente de
la cadena templado. Se sintetiza así una cadena simple de DNA, complementaria y
alineada a cada "primer”.

Este método se basa en una serie repetida de ciclos, cada uno de los cuales esta
compuesto por 3 pasos fundamentales:

• 1º Desnaturalización del ADN doble cadena


• 2º Acoplamiento de los cebadores (primers) sintéticos
• 3º Elongación del cebador usando una ADN polimerasa.
En el primer paso el ADN aislado de la muestra es desnaturalizado a elevada
temperatura (95ºC) quedando las hebras complementarias libres.

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En el segundo paso a una temperatura menor (dependiente de la temperatura de
hibridización de los primers), se acoplan los cebadores a las secuencias complementarias
que se encuentran en regiones adyacentes a la secuencia seleccionada.
El paso final del ciclo consiste en la elongación (extensión) del cebador para sintetizar la
hebra complementaria. En esta última etapa la temperatura generalmente utilizada es de
72ºC, (aunque puede variar según la enzima utilizada) permitiendo la incorporación de
desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) a partir del extremo 3´OH del cebador. Este
proceso es catalizado por la Pol I Thermus aquaticus (Taq pol). Dicha polimerasa
permite el apareamiento de las bases complementarias al ADN molde.
Estos tres pasos básicos ocurren durante varios ciclos (generalmente entre 25 y 35)
en donde el ADN se elonga a una velocidad de 120 nucleótidos/segundo en
dirección 5´→3´.
La repetición de tales ciclos es lo que permite la amplificación del ADN. Es importante
destacar que cada uno de los productos obtenidos en cada ciclo, actúa como molde para
el ciclo siguiente, produciéndose de esta forma una síntesis exponencial del fragmento
inicial de ADN.
Otros componentes necesarios en la PCR son: buffers que contengan Mg+2 (muy
importante para el funcionamiento de la enzima), cationes monovalentes y algunos
solventes que ayuden a estabilizar la enzima.
Las variaciones de temperaturas y los tiempos necesarios son críticos en esta técnica,
para ello se utiliza el Termociclador, el cual realiza estas variaciones automáticamente.
Aunque la PCR ha sido diseñada en base a la amplificación de ADN, ésta técnica puede
ser empleada en el análisis de ARN.
La técnica de RT-PCR ha aumentado considerablemente la sensibilidad en la
detección de virus ARN. Para ello es necesario generar en primer lugar el ADN
complementario (ADNc) a partir del ARN. En esta reacción se utiliza la enzima llamada
transcriptasa reversa. Una vez sintetizado el ADNc, éste se amplifica siguiendo el
mismo

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procedimiento descrito para la PCR actuando este último como molde.

Reacción en cadena de la polimerasa

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Método de reacción de polimerasa en cadena (PCR), en que se muestra
progresión de la síntesis de nuevas hebras.

 OTRAS TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN.

- Reacción en cadena de la ligasa o LCR.


- Sistema QB replicasa.

C. VENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES.

Sensibles para genes de importancia para la investigación y para


el diagnóstico clínico. Algunas de las ventajas de las técnicas de
sondas de ácidos nucleicos se discuten a continuación.
 La unión entre ácidos nucleicos es más fuerte que la avidez del
anticuerpo por el antígeno. También los ácidos nucleicos son
mucho más estables que las proteínas a alta temperatura, alto
pH, solventes orgánicos y otros compuestos.
 Los agentes infecciosos involucrados en la patogénesis de una
enfermedad pueden ser cuantificados aun cuando estén
presentes en cantidades de subpicogramos o como infecciones
latentes.

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 En una infección microbiana, las sondas de DNA o RNA pueden
detectar la presencia de secuencias genéticas en lugar de los
productos de genes. Así, las primeras etapas de la enfermedad
se pueden diagnosticar en pacientes en los cuales las pruebas
serológicas o histopatológicas fallan en descubrir la causa.
 La prueba de hibridación in s i tu es suficientemente sensible
para detectar bajos niveles de DNA o transcripciones de RNA
directamente en la células o tejido afectado. Esta técnica es
particularmente útil para la localización de áreas afectadas en
un órgano y para la identificación de fenotipos de células
infectadas. Esto no es posible cuando se extrae el DNA o RNA
total.
 Son rápidos para identificar a las partícula viral, en tiempo de
2 a 4 horas (hibridación de sondas)ç, de 4 a 8 horas(PCR).
 Permite detectar cantidades muy pequeñas de virus.
 Presenta una sensibilidad y especificidad alta.

D. DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES.

 Son caros, tienen un alto costo.


 La necesidad de cebadores específicos para encontrar determinado
microorganismo y por ello hay la posibilidad de falso (+), lo que implica un
conocimiento adecuado de la secuencia de nucleótidos del agente.
 la aplicación de estas técnicas exige una infraestructura y entrenamientos
adecuados.
 La prueba se tiene que efectuar en condiciones adecuadas de astringencia es
decir, a una temperatura, pH y concentración de cebadores y nucleótidos
adecuados. Si hay fallas, pueden ocurrir amplificaciones inespecíficas y
contaminaciones con DNA extraño.

3.2. MÉTODOS INDIRECTOS

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Las métodos indirectos a comparación de las pruebas directas son aquellas en
lasque se demuestra, un contacto del huésped con el agente viral, mediante la
determinación de anticuerpos específicos contra el virus.
Estos métodos o técnicas serológicas son las que se usan con mas frecuencia para
descubrir anticuerpos contra un determinado agente viral, teniendo en cuenta que
la exposición al agente viral produce una respuesta por parte del sistema inmune
del huésped.
Las técnicas serológicas indirectas se clasifican en tres grupos, teniendo como base
la cuantificación de la reacción antígeno – anticuerpo:

3.2.1 Pruebas serológicas Indirectas que dependen de la capacidad del


anticuerpo que se une al antígeno para ejercer alguna función no
relacionada con el virus. Dentro de estoas pruebas tenemos:

A. Fijación del Complemento: (FC)

Es un sistema semicuantitativo, que proporciona de manera exacta la


cantidad de antígenos o de los anticuerpos contra esos antígenos. Este
método de cuantificación de las proteínas virales es particularmente útil para
la detección de las infecciones virales abortivas, es decir cuando solo se
expresa parte de la información genética presente en el genoma viral y no se
producen partículas virales. Hoy en día se utiliza como estándar de
comparación para las nuevas pruebas comerciales. Una de sus aplicaciones
consiste en determinar anticuerpos contra agentes de baja prevalencia como
los virus coxsackie, o también para determinar la actividad de ciertas
infecciones como por ejemplo la rubéola.
El proceso que se lleva a cabo es el siguiente:
• En un principio el antígeno reacciona con anticuerpo que se encuentra en
la muestra de suero del paciente y en presencia de complemento, titulado
previamente.
• Si el antígeno y el anticuerpo reaccionan se activa la vía clásica del
complemento.
• Seguidamente se añade el indicador constituido por eritrocitos cubiertos
con anticuerpos y de esta forma, si el complemento se fija y es activado por
el complejo antígeno viral – anticuerpo, los eritrocitos no se lisarn; pero si

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no hay unión antígeno - anticuerpo, el complemento permanece libre y se
une al complejo indicador y produce lisis de los eritrocitos.

En conclusión este método emplea el complemento para lisar eritrocitos que


a su vez funcionan como indicadores.
La interpretación de la prueba de fijación de complemento es que la lisis es
resultado negativo de la prueba y la ausencia de lisis un resultado positivo.

Fijación de complemento Positiva

Antígeno Reacción Ag-Ac


Anticuerpo No hay lisis
Hematíes
fija
en suero prueba positiva
complemento

Fijación de complemento Negativa

Presencia de
Anticuerpo No hay reacción lisis
Antígeno inespecífico Hematíes
en suero C libre prueba
negativa

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B. Hemoaglutinación Indirecta.

Para realizar esta prueba se utilizan antígenos ligados a glóbulos rojos o


eritrocitos, para detectar anticuerpos específicos. Los eritrocitos se pueden
sensibilizar con diversos antígenos y se pueden utilizar como sistema
indicador; la variedad de antígenos que pueden unirse a glóbulos rojos
pueden ser: Carbohidratos, proteínas etc.
Esta prueba se usa para demostrar anticuerpos contra virus como fiebre
amarilla, influenza, parainfluenza y dengue; dado que este método es
altamente exacto y rápido para cuantificar partículas virales.
• El proceso se lleva a cabo realizando diluciones seriadas en una placa
multipocillos de fondo en U: en los pocillos se realizan las diluciones
seriadas de los sueros y sobre ellos se depositan la suspensión de hematíes
sensibilizados con el antígeno.
• Si hay anticuerpos suficientes para aglutinar se forma una malla que se
deposita y se observa una especie de velo que cubre el fondo del pocillo.
• Cuando no existan anticuerpos o estén en cantidad insuficiente, entonces las
células sedimentarán de forma independiente y resbalaran por los bordes del
pocillo hasta acumularse en el punto mas bajo del mismo, el cual se observa
como un acumulo nítido en el fondo.

C. Aglutinación de látex.

Similar a la técnica de látex ya descrita sólo que en este caso el antígeno se


encuentra fijo a la partícula de látex y, por tanto, se espera descubrir los
anticuerpos que se encuentran en la muestra.

Este ensayo generalmente son pruebas de filtro (tamizaje) pues sólo


determinan la presencia o no de anticuerpos y los resultados se pueden
interpretar como «inmune» (si es positivo) o «susceptible» (si es negativo),
como en el caso de determinar el estado inmune para el virus de la rubéola,
VIH, rotavirus del grupo C, virus de Epstein-Barr(EBV). La información que
suministra corresponde a exposición al agente o infección pasada;

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generalmente las pruebas de látex no son específicas para ésta. En virología se
utiliza con más frecuencia la técnica de aglutinación de látex directa.

3.2.2 Pruebas Serológicas Indirectas que revelan la capacidad de los


anticuerpos para bloquear la infección viral especifica; dentro de estas
pruebas tenemos:

B. Neutralización Viral.

La neutralización de los virus se define como la disminución del poder


infectante del virus a consecuencia de su interacción con el anticuerpo
especifico, la unión que se da entre el antígeno viral y el anticuerpo no altera
irreversiblemente a ninguno de los componentes que forman el complejo, puesto
que dichos componentes se pueden recuperar por disociación tanto el virus
como el anticuerpo.
Dicho ensayo es bastante relativo y el mecanismo por el cual el anticuerpo
neutraliza el poder infectante del virus va depender de los siguientes factores:
- virus.
- Variedad de anticuerpo.
- de la relación cuantitativa.
- Del comportamiento especial de determinada célula huésped frente al
complejo antígeno – anticuerpo.

Los mecanismo por los cuales los anticuerpos de neutralización logran su efecto
es mediante.
• Inhibición de la absorción viral sobre las células.
Cuando los anticuerpos se unen a la superficie del virión para impedir la
adsorción como por ejemplo la IgG que posee 2 focos de fijación al antígeno
permitiendo, así el establecimiento de 2 enlaces específicos con 2 grupos
determinantes sobre un mismo visión. El coeficiente de temperatura, cuando se
da el complejo antígeno – anticuerpo es elevado, lo cual da lugar a cambios de
conformación en ambos moléculas. Estos cambios bastan para inhibir la
fijación del virus que se combinarían con los receptores celulares.

• Aumento de la degradación del virus

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Se dan en los casos en los que la interacción del virus con el anticuerpo no
impide su fijación sobre las células sensibles, a pesar de que las proyecciones
superficiales del virus estén cubierto de anticuerpos, para esto el virus cubierto
de anticuerpos es fagocitado y el anticuerpo ejerce su efecto de neutralización
dentro de la célula impidiendo la liberación normal de núcleos virales.
En conclusión el complejo antígeno anticuerpo se desarrolla como unidad dentro
del fagosoma por efecto de enzimas de lisosomas y volviéndose el genoma
vírico soluble e impidiendo su duplicación del Acido - Nucleico. Esta técnica se
ha utilizado para el diagnostico de las infecciones por dengue.
Resultado Positivo

Partícula Anticuerpos Bloqueo Células no


viral en suero Ac + Ag infectadas

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Resultado Negativo

Células
Anticuerpos No hay infectadas por
Partícula viral
en suero reacción virus libre no
neutralizado

B. Inhibición de la Hemoaglutinación : (IH)

Esta prueba demuestra la capacidad de algunos antígenos virales para aglutinar


eritrocitos. Esto lo hacen debido a que sus proteínas, para poder absorberse a
las células interactúan con receptores sobre la superficie del eritrocito: sin
embargo la interacción es impedida por anticuerpos específicos en el suero del
paciente evitando la aglutinación de los eritrocitos por tales antígenos; los
antígenos implicados en esta reacción son los componentes de la superficie de
la partícula viral, los cuales poseen determinantes antigénicos mas específicos
de tipo.
Esta prueba de la inhibición de la hemoaglutinación es un medio altamente
específico para la caracterización de los virus.
Para realizar la prueba se hacen diversas diluciones del suero con el fin de
hacer una titulación y determinar el nivel de anticuerpos del paciente.
La reacción constituye la base para numerosas pruebas diagnosticas, las
enfermedades en la que se puede demostrar la respuesta de anticuerpos por la
prueba de IH son: Influenza., Enf.de New Castle, Rubéola, Sarampión,
Dengue, infecciones por reovirus, etc.
La interpretación de la prueba de IH se lee de la siguiente manera:
- Aglutinación positiva; se forma un recubrimiento rojo granular difuso
en el fondo del tubo.

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- Aglutinación negativa; botón rojo compacto en el fondo del tubo que se
desliza al inclinarlo.

Antígeno Anticuerpos Ag-Ac bloquean Inhibición de


viral específicos aglutininas HA

3. 2.3. Pruebas Serológicas que miden la Interacción Antígeno-Anticuerpo

A. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

IFI; es un método rápido y confiable que permite la detección de


anticuerpos o antivirales en el suero de paciente. Se basa en la unión de
anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente a los antígenos
virales expresadas en la superficie de células infectadas. El procedimiento
se basa en lo siguiente:
• Primeramente se fija el antígeno (células infectadas y no infectadas) a
un portaobjetos y se incuba con el suero; si existe anticuerpos
específicos, se unirán a los determinantes antígenicos.
• Seguidamente se realiza un lavado y se lleva a incubar la muestra con
la antiglobulina marcada para revelar la presencia del primer
anticuerpo.
• Luego el conjugado se unirá a los anticuerpos del paciente; y si la
reacción es positiva se revelara el inmunocomplejo que vendría hacer
el anticuerpo especifico.
En la prueba de IFI el lavado de ambos pasos elimina los anticuerpos que no
se han fijado específicamente; y la utilización de antiglobulina marcada, que

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puede ser anticuerpo antiinmunoglobulina G humana conjugada con
isotiocianato de fluoresceína, que es una sustancia que se vuelve fluorescente
a la exposición de la luz ultravioleta y emite una luz verde característica.
La presencia de anticuerpos de evidencia por la aparición de fluorescencia en
el citoplasma y superficie de células infectadas, mientras que las células
control no fluorescen.
Esta técnica se ha utilizado para descubrir anticuerpos contra rubéola, VIH,
etc. Actualmente ha sido remplazada por la prueba de ELISA debido a que
presenta una especificidad similar y se puede leer mediante equipos
automatizados lo que elimina la subjetividad inherente al observador en IFI y
la necesidad del microscopio de fluorescencia.

B. Inmunoensayo Ligado a Enzimas (ELISA)

La prueba ELISA indirecta tiene un principio semejante al de la ELISA


directa, sólo que en este caso, un antígeno específico está unido a una fase
sólida que puede ser un tubo, microplaca o perlas de vidrio; luego se añade el
suero del paciente que posee los anticuerpos y después se adiciona el

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conjugado constituido por un anti-anticuerpo IgG o IgM unido a una enzima;
posteriormente se adiciona el sustrato específico para la enzima, que lo va a
modificar y produce un compuesto coloreado, cuya intensidad es
proporcional a la concentración de anticuerpo en el suero del paciente.

Esta prueba se utiliza ampliamente; más aún, con el advenimiento y la


disponibilidad de los sistemas automatizados se puede efectuar en un periodo
de 1 a 2 horas. Su utilidad en virología es básicamente para determinar
anticuerpos contra antígenos específicos del dengue, HSV, VIH, RSV, CMV,
rubéola, hepatitis A, B y C principalmente, y en infecciones por EBV se usa
para demostrar marcadores serológicos tempranos de la infección, que se
pueden utilizar en el manejo de huéspedes inmunocomprometidos.

C. Inmunoblot o Western Blot

Las técnicas inmunológicas de Inmunoblot están encontrando amplias


aplicaciones en el diagnóstico virológico; esta tecnica utiliza un control para
comparar y poder determinar el tipo de proteína para la cual hay antígenos
específicos; y de esta forma poder definir exactamente contra cuáles
proteínas están dirigidos los anticuerpos del paciente y asimismo determinar
la fase de la infección en que se encuentra.. Son particularmente útiles para el
diagnóstico del HIV.

La técnica de WB se basa en la separación electroforética de proteínas virales


que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto
de determinar la presencia de anticuerpos específicos contra cada una de esas
proteínas.

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Esta técnica se realiza esquemáticamente en 3 pasos:

• Se produce en cultivos celulares grandes cantidades de virus que luego


son tratados químicamente para su disgregación e inactivación. Los
antígenos resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel
de Poliacrilamida.
• Se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag
separados a una membrana de nitrocelulosa.
• Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de nitrocelulosa.
Posteriormente se añaden anticuerpos anti-inmunoglobulina humana
unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y, por último, se
agrega el substrato enzimático para la visualización de las bandas
reactivas con un producto final coloreado.

Esta prueba es muy específica y se utiliza como suplementaria y confirmatoria


en infección por el VIH o HTLV-I cuando ELISA da resultados contradictorios o
difíciles de interpretar. También se utiliza para diferenciar entre infección por
VIH1 y VIH2.

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Referencias

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- MADIGAN, M. y J. PARKER (1997) Brock Microbiología de los Microorganismos.
8º Edic. Edit. Mc Graw Hill. Mexico D.F.
- JAWETZ E., J. MELNICK, E. SDELBERG (1996) Microbiología Médica. 15º edic.
Edit. El Manual Moderno. Mexico D.F.
- Microsoft ® Encarta ® 2007. © 1993--2006 Microsoft Corporation. Reservados
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- PRESCOTT L., J. HARLEY, D. KLEIN (1999). Microbiologia. 4º edic. Edit. Mc
Graw Hill Mexico D.F.
- METODOS DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO VIRAL. disponible en:
http://www.ciencia-hoy.retina.ar/hoy20/sondas.htm
- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (LA PCR) Jean-Pierre
HERVEG y Maritza BARCIA-MACAY. Disponible en:
www.icampus.ucl.ac.be/.../PCR/PCR.html

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