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Pruebas de Infectividad y Diagnóstico Serológico en Virología

Pruebas de Infectividad y Diagnóstico Serológico en Virología

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Publicado porRomulo Aycachi Inga
Diferentes pruebas realizadas en la actualidad para el diagnóstico y la demostración de virus. Descripcion de cada uno de los procedimentos realizados.
Diferentes pruebas realizadas en la actualidad para el diagnóstico y la demostración de virus. Descripcion de cada uno de los procedimentos realizados.

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS ESCUELA DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

PRUEBAS DE INFECTIVIDAD EN VIRUS Y DIAGNOSTICO SEROLOGICO

AUTORES:

AYCACHI INGA ROMULO ARIAS MATOS LISBETH CHAFLOQUE MILLONES ALEX CULQUI LOZADA LILIANA

Seminario Monografía que se presenta como requisito parcial del curso de Virología.

LAMBAYEQUE, 2007

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DEDICATORIA
A nuestros padres por ser los que día a día nos dan fuerza para continuar luchando por la vida y hacer posible nuestras metas, a nuestros profesores por ser los que nos forman profesionalmente.

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CUANDO LA VIDA TE PRESENTE MIL RAZONES PARA LLORAR, DEMUESTRALE QUE TIENES MIL Y UNA RAZONES PARA SONREIR
Facundo Cabral

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AGRADECIMIENTO

A Dios por permitirnos vivir. A quienes con su comprensión y cariño nos han permitido la elaboración de este Seminario - Monográfico

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INDICE PÁG. 1 2 2 5 7 9 11 13 14 14 14 15 16 17 17 18 19 21 24 25 25 25

I. INTRODUCCIÓN II. PRUEBAS DE INFECTIVIDAD 2.1 Inoculación de animales susceptibles 2.2. Inoculación de huevos embrionados (fecundados) 2.3 Aislamiento en cultivos celulares 2.3.1 Sistemas de cultivo más utilizados 2.3.2 Aislamiento y detección III. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO 3.1 METODOS DIRECTOS 3.1.1 La Presencia de Antígenos Virales (técnicas inmunológicas) A.-INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID) B.-TEST DE AGLUTINACION EN LATEX C.- INMUNOENSAYO 3.1.2 El Virus Como Partícula Viral A. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA 3.1.3 Técnicas de Diagnóstico Molecular A. ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN. B. TÉCNICAS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO. C. VENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES. D. DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES. 3.2. MÉTODOS INDIRECTOS 3.2.1 Pruebas serológicas Indirectas que dependen de la capacidad del anticuerpo tenemos: A. Fijación del Complemento: (FC) B. Hemoaglutinación Indirecta. C. Aglutinación de látex. 3.2.2 Pruebas Serológicas Indirectas que revelan la capacidad de los -5que se une al antígeno para ejercer alguna función no relacionada con el virus. Dentro de estoas pruebas

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anticuerpos para bloquear la infección viral especifica; dentro de estas pruebas tenemos: A. Neutralización Viral. B. Inhibición de la Hemoaglutinación : (IH) 3. 2.3. Pruebas Serológicas que miden la Interacción AntígenoAnticuerpo A. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) B. Inmunoensayo Ligado a Enzimas (ELISA) C. Inmunoblot o Western Blot Referencias 31 32 33 35 28 30 31

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I. INTRODUCCIÓN Debido a que los virus, como ocurre con los plásmidos, se replican solo dentro de células vivas, la investigación sobre virus requiere el uso de hospedadores apropiados. Para el estudio de los virus bacterianos se usan cultivos axénicos en medio líquido o en medio semisólido con agar. Como la mayor parte de las bacterias son fáciles de cultivar, resulta relativamente simple estudiar los virus bacterianos y por esta razon se dispone de un crecimiento detallado de la multiplicación de estos virus. En lo que respecta a los virus de los animales, el hospedador inicial puede ser un animal susceptible al virus, pero a efectos de investigación es deseable disponer de hospedadores mas manejables. En 1907 el biólogo estadounidense Ross Granville Harrison descubre que los tejidos vivos pueden cultivarse, es decir, pueden crecer fuera de su órgano original. Este fue el comienzo para el desarrollo de los cultivos de tejidos y mas adelante el de los cultivos celulares (lineas celulares). Muchos virus animales pueden ser cultivados en cultivos de tejidos o cultivos celulares, y el uso de tales cultivos ha facilitado enormemente la investigación sobre los virus. Los anticuerpos, al ser específicos de antígeno y por tanto específicos del patógeno, son componentes críticos de la respuesta inmune, interaccionan específicamente con el antígeno sobre las células diana pero no matan a las células. Existe un grupo de enzimas inespecíficas conocido en conjunto como complemento que puede fijarse a los anticuerpos unidos al patógeno y lisar las células con el anticuerpo unido. La respuesta inmune es específica para anticuerpos individuales y depende de anticuerpos específicos, pero puede ser mediada o estimulada a través de mecanismos específicos como el complemento. En muchos casos, la inmunidad mediada por anticuerpos no es un mecanismo eficaz para controlar la diseminación de la infección. Algunos agentes infecciosos parasitan el organismo desde el interior de las células. P.ej. los virus animales se reproducen utilizando los sistemas celulares del hospedador y, en consecuencia, gran parte de su ciclo vital transcurre en el interior de las células del hospedador. Teniendo en cuenta que los anticuerpos están armados para reconocer al patógeno libre en la sangre, o a nivel de las superficies mucosas, las células infectadas del hospedador deben ser identificadas y destruidas por diferentes medios, generalmente a través de interacciones célula a célula propias de la inmunidad celular. Por fortuna, todos los patógenos endógenos producen antígenos que a su vez son presentados sobre la superficie de células diana infectadas.

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El antígeno es reconocido por una célula T citotóxica (TC) u actúa directamente sobre la célula diana infectada secretando proteínas citolíticas, llamadas perforinas, que destruyen la célula infectada. En el diagnostico de una enfermedad infecciosa no siempre es posible el aislamiento del patógeno. Una posible alternativa, en estos casos, es cuantificar el título de anticuerpos frente al patógeno que se sospecha. Cuando un individuo sufre una infeccion de la que se sospecha el patógeno etiológico, el título de anticuerpos, puede medirse mediante aglutinación, precipitación, enzimoinmunoanálisis (ELISA), métodos de inmovilización o radioinmunoensayo (RIA). La tecnica general consiste en establecer una serie de diluciones del suero (habitualmente diluciones al doble: 1:2, 1:4, 1:8,1:16, 1:32, y así sucesivamente) y determinar la dilución máxima a la que se produce la reacción antígeno-anticuerpo. Una sola medida del título de anticuerpos no indica infección activa. Después de la infeccion, muchos anticuerpos dan títulos altos durante mucho tiempo; para establecer que una enfermedad aguda se debe a un determinado patógeno, es esencial demostrar una elevación del título de anticuerpos en muestras sucesivas de suero del mismo enfermo. En algunos casos, sin embargo, la mera presencia de anticuerpos puede ser suficiente para indicar infección. Así sucede cuando el patógeno se presenta raramente en la población. La presencia de anticuerpos es suficiente para indicar la existencia de una infección en el individuo. Un ejemplo significativo es el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Se dispone actualmente de una prueba de ELISA muy sensible y fiable para la detección de anticuerpos contra el VIH. La exquisita sensibilidad del ELISA permite incluso la detección de título de anticuerpos muy bajo, por lo que se utiliza el ELISA rutinariamente para el rastreo de la infección por VIH en muestras de sangre. II. PRUEBAS DE INFECTIVIDAD 2.1 Inoculación de animales susceptibles En los primeros intentos para cultivos de virus, se utilizaba el huésped animal definido del agente por estudiar. Estos intentos tropezaban con la complejidad propia del animal entero, y las grandes diferencias de sensibilidad de un animal a otro, incluso dentro de una misma especie. El descubrimiento y desarrollo de -8-

cultivo in Vitro de células capaces de mantener la duplicación hizo que ya no se requiriera a los animales para la conservación ordinaria de la mayor parte de agentes virales. Hoy en dia la inoculación de animales susceptibles es usada en estudios de infectividad, ya que algunos virus no provocan efectos reconocibles en cultivos celulares pero originan la muerte en animales. También es usada para estudiar la oncogénesis viral, la patogenia de los padecimientos virales, la respuesta inmune a los virus y el efecto de los factores ambientales sobre las infecciones virales, así como el aislamiento primario de ciertos agentes. El método que se utiliza para inocular los virus a los animales depende de la sensibilidad del huésped respecto al virus, así como de la naturaleza de la prueba o del experimento. Es frecuente recurrir a las siguientes vías de inoculación: Intravenosa Intracerebral Intraperitoneal Intranasal Intratraqueal Intradermica

Una vez lograda la duplicación del virus, se recogen tejidos pertenecientes a las zonas correspondientes del organismo, se les secciona u homogeniza y se almacena (generalmente a baja temperatura) para emplearla después como fuente de virus. El procedimiento general para una prueba de infectividad es realizar una dilucion seriada de la muestra desconocida, normalmente por diluciones decimales sucesivas, e inyectar muestras de cada dilucion a un cierto número de animales sensibles. Tras un periodo de incubación adecuado, se cuentan los animales vivos y muertos inyectados con cada una de las diluciones de la serie. Se suele considerar como valor de referencia la dilucion a la cual la mitad de los animales mueren. Aunque los métodos de diluciones seriadas son más prolijos y menos exactos que los basados en cultivos celulares, resultan esenciales en el estudio de algunos tipos de virus. Otros usos de las inoculaciones en animales susceptibles son la comprobación de la inocuidad y poder protector de vacunas (poliomielitis), elaboración de éstas (rabia, viruela), efecto neutralizante de sueros inmunes y de pacientes (con fines comerciales y diagnósticos), etc., aunque su importancia se restringe cada vez más por los avances logrados con los cultivos de tejidos. Entre los animales que se emplean están monos, conejos, aves, ratas y ratones; estos últimos más que ningún otro. -9-

Diferentes tipos de animales usados en laboratorio para la inoculación de virus

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2.2. Inoculación de huevos embrionados (fecundados) Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante mas de 15 años. El cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por primera vez por Burnet en 1935, demostrando que el embrión de pollo es un medio muy sensible para el aislamiento de estos virus, siendo además un medio estéril y poco costoso. Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo fecundado, o en el propio embrión en desarrollo. También se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de incubación mas prolongado que el pollo; pero como regla, sigue usandose huevo de gallina de 6 a 8 días de incubación aproximadamente (a veces se usa huevos de mas tiempo de incubación). Para preparar los huevos para el cultivo, en primer lugar se desinfecta la superficie de la cáscara con yodo, y se perfora con un pequeño taladro estéril. Tras la inoculación, el agujero del taladro se sella con gelatina y se incuba el huevo. Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por consiguiente, se deben inyectar en la region apropiada, P. ej. los mixovirus crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infección puede producir una lesion tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a menudo, es caracteristico del virus. El método exacto de inoculación y la edad del embrión que se emplea, dependen del virus problema. P. ej. para aislar en forma primaria el virus de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en la cavidad amniótica de embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica fácilmente en la membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después de varias resiembras (“adaptación”) en el amnios. Los focos mas utilizados para la inoculación, a parte de las cavidades amniótica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino. Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrión en desarrollo, recurriendo a la inculacion intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se duplicó el virus dentro de las células de las membranas o del embrión, puede liberarse a los líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrión y en las células de la membrana amniótica, pasa al liquido amniótico, que luego puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros

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virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las células en las lesiones o “pústulas” que se forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una solucion salina isotónica las membranas, logran liberarse estos virus. En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrión de pollo puede provocar la muerte del embrio (p.ej. virus de la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas en los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante (p.ej. poliovirus tipo 2). En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la técnica de inoculación de huevos embrionados al correlacionar el número de pústulas contadas con la dilucion viral inoculada. Actualmente el método preferido para cultivar virus de influenza aviar es la inoculación en huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) o huevos negativos a anticuerpos específicos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de las muestras se inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 días de incubación y se incuba a 35-37ºC durante 4-7 días. Luego los huevos con embriones muertos, cuando esto ocurra, o los que queden al final del periodo de incubación se refrigeran a 4ºC y el líquido alantoideo se chequea con la prueba de hemaglutinación. Si se detecta actividad de hemoaglutinatión hay una probabilidad alta de la presencia de virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reacción negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos.

Inoculación de huevos embrionados para cultivo de virus de la gripe aviar - 12 -

Estructura y puntos de inoculación en un huevo embrionado

2.3 Aislamiento en cultivos celulares Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben utilizar sistemas basados en líneas celulares que permitan su desarrollo. Los cultivos celulares son un tipo de biosustrato empleados para la propagación de los virus,
constituyen, desde 1950, el sistema más empleado para el aislamiento y propagación de la mayoría de los virus, consisten en un sistema formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad controladas. Dentro de éstos, los más usados son los cultivos en monocapa, aunque

hay otros sistemas (cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos en microcarriers, etc). Los cultivos celulares en monocapa consisten en una capa de células que crecen adheridas a la superficie del recipiente que las contiene. Estos cultivos se preparan tratando el tejido original u otra monocapa con un agente que dispersa las células (una enzima o un agente quelante, o ambos combinados) para luego transferir la suspensión celular obtenida a un recipiente de vidrio o plástico en donde las células se adhieren y multiplican. La invasión viral se evidencia a través de un cambio celular o efecto citopático (EC) y mediante pruebas complementarias.

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No existe un cultivo celular susceptible a todos los virus, de modo que un laboratorio de diagnóstico viral debe disponer de distintos cultivos celulares. Por ejemplo, el virus herpes simplex crece bien in vitro en cultivos primarios, cepas y líneas celulares (MRC-5, RK, HEp-2, HeLa, Vero u otras); en cambio, otro virus de la misma familia, el citomegalovirus (CMV) sólo crece en cultivos primarios de pulmón fetal humano o bien en algunas cepas celulares derivadas del mismo órgano y especie (MRC-5). Por otro lado, una línea celular como HEp-2 puede ser bastante sensible a adenovirus, VRS, parainfluenza, herpes simples, poliovirus y otros, pero no permitir el crecimiento de CMV, rotavirus, influenza, etc; además, es posible que los pasajes sucesivos de una línea la hagan disminuir su sensibilidad a algunos virus, como sucede con Hep-2 en relación a VRS.

Tipos caracteristicos en cultivos celulares

Medio de cultivo para tejidos

Coloración de Giemsa

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2.3.1 Sistemas de cultivo más utilizados • Cultivos primarios: Se caracterizan por tener varios tipos de células. La mayoría son de crecimiento limitado in vitro, generalmente resisten 5 a 10 subcultivos y son permisivas a un amplio rango de virus; p. e., células de riñón embrionario humano (REH). • Cepas de células diploides: Derivadas de tejidos normales, se utilizan en la producción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materiales tóxicos. Están constituidas por un tipo de células que retienen su número cromosómico diploide original; p.e., los fibroblastos de pulmón. • Líneas celulares: Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten (n) número de pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de tumores malignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., células Vero (riñón de mono verde africano), LLC-MK2 (riñón mono rhesus) y BSC-1 (también de tejido normal de riñón de mono) y HeLa y HEp-2 derivadas de células humanas malignas. Éstas generalmente tienen un número variable de cromosomas y a veces también son denominadas líneas celulares heteroploides. Otras líneas celulares existentes son A9 (fibroblastos subcutáneos de ratón), BHK21 (fibroblastos de hámster), BRL3A (epitelio de hígado de rata), GHI, GH3 (epitelio de rata), L929, LS, S180 (fibroblastos de ratón), L1210, L5178Y, P388D1 (linfocitos de ratón), MCF7 (epitelio humano), 3T3-L1 (fibroblastos de ratón suizo), 3T3-A31 (fibroblastos de ratón BALB/c) y NRK49F (fibroblastos de riñón de rata). Algunos ejemplos de lineas celulares son: HEP-2: Células heteroploides humanas derivadas de carcinoma laríngeo. Recomendadas para RSV y ADENOVIRUS. MDCK: Línea celular diploide de riñón canino; para INFLUENZA y ocasionalmente PARAINFLUENZA. LLC-MK2: Línea celular heteroploide de riñón de mono Rhesus. Se recomienda para el aislamiento del virus PARAINFLUENZA. Requiere el agregado de tripsina cristalina al medio. MRC5: Línea celular diploide fibroblástica de pulmón embrionario humano. Se recomienda para el aislamiento de CITOMEGALOVIRUS, HERPESVIRUS.

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Entre las líneas celulares que se emplean con más frecuencia están las células Hep2, HeLa y Vero, en cuanto a células diploides las más utilizadas son las líneas de fibroblastos de pulmón (MRC5) que se usan para el aislamiento de citomegalovirus (CMV). El cultivo primario más utilizado es el riñón humano embrionario (RHE) que es permisible a los virus de circulación frecuente como el herpes (HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV) etc. En todo caso la elección por una u otra línea celular dependerá del virus que se quiera evidenciar. - 16 -

2.3.2 Aislamiento y detección Aunque el aislamiento viral es una buena técnica para el diagnóstico de infecciones virales asintomáticas, crónicas y recurrentes, su eficacia depende del momento en que se tome la muestra, del transporte óptimo y rápido de las muestras; además que se debe escoger el tipo de células que sean permisivas para el virus que se va a demostrar. Para los cultivos virales se utilizan monocapas celulares adheridas al lecho de un tubo, que requieren de sustratos esenciales para su mantenimiento, una solución amortiguadora y un pH adecuado, además se deben suplementar con suero fetal bovino, que contiene múltiples factores promotores de crecimiento celular. Una vez que la monocapa se inocula con una muestra pretratada que proviene de un individuo infectado, el virus se puede descubrir por: • EFECTO CITOPATICO (ECP):

El efecto citopático son cambios degenerativos específicos observados en una línea celular como consecuencia de la replicación de un virus infectante. Éste puede aparecer después de 3 ó 4 días. A través de éstos cambios morfológicos celulares es posible poner en evidencia la presencia de un virus en determinado tipo de cultivo de células. La observación microscópica de las células en busca de ECP debe realizarse diariamente. El ECP puede ser de varios tipos: la formación de sincicios, o de vesículas o inclusiones o el redondeamiento y desprendimiento de la monocapa celular. A veces la inoculación de una muestra o el virus semilla produce efectos tóxicos transitorios o irreversibles sobre el cultivo celular. Estos pueden tener un efecto parecido al ECP. Tal toxicidad puede hacerse evidente dentro de las 24 horas y puede ser reducida o evitada cambiando el medio. Algunos ECP caracteristicos de virus son: 1. Virus Respiratorio Sincicial: formación de sincicios o células gigantes en Hep-2. 2. Adenovirus: células redondeadas en Hep-2 con formación de racimos dejando áreas sin células.

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CUERPOS DE INCLUSION: En ciertas virosis es posible comprobar la presencia de estructuras anómalas dentro del citoplasma o núcleo de las células parasitadas, demostrables por tinción según métodos de Mann, Sellers o Giemsa. eosinófilas. Las inclusiones intracitoplásmicas son redondas u ovales, de aspecto granular, y caracterizan a algunas infecciones, como la rabia (cuerpos de Negrí) y la viruela (cuernos de Guarnieri). Las intranucleares son de dos tipos, A y B; la primera provoca fuerte reacción de la materia nuclear, de modo que la inclusión se aprecia con un halo claro a su alrededor, libre de cromatina. Estas formas se ven en la fiebre amarilla y el herpes simple; las de tipo B ocasionan poca respuesta en la célula y por lo común ocupan los espacios sin cromatina. Se observan en la poliomielitis. Los cuerpos de inclusión son de distintos tamaños; se presentan uno o varios en el citoplasma o en el núcleo y, por fusión, algunos ocupan todo el espacio nuclear, como sucede en el sarampión. Por medio del microscopio electrónico se ha comprobado en unos cuantos su integración por agregados de cuerpos elementales, aunque falta conocer su verdadera estructura. Los cuerpos de inclusión son de enorme valor en determinadas virosis (los cuerpos de Negri son peculiares de la rabia), pero en tejidos sanos y en enfermedades no virales se han encontrado formaciones parecidas a ellos. El aspecto particular y característico de cada tipo de inclusión suele orientar sobre el grupo de virus que la produce. La formación de cuerpos de inclusión ocurre tanto in vivo, en las infecciones naturales, como en los cultivos celulares infectados. Aparte de la acción citopática directa, la lesión de las células infectadas por un virus puede deberse a la respuesta inmune dirigida contra antígenos codificados por el virus y expresados en la superficie celular. • HEMADSORCIÓN: Existen otros métodos para descubrir y caracterizar un virus en cultivo celular cuando todavía no se produce el ECP, o éste no es evidente o en los casos en que Por lo general estas estructuras, llamadas cuernos de inclusión, muestran afinidad por colorantes ácidos (eosina o fucsina ácida) y son

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el virus se debe reconocer por otras propiedades o características en cultivo. Dentro de las técnicas que ayudan a identificar estas propiedades virales está la hemadsorción, que consiste en que cuando el virus infectante incorpora proteínas virales con propiedad de hemaglutininas en la membrana celular, las células infectadas se pueden descubrir por la adsorción de eritrocitos de ciertas especies animales, que se puede observar al microscopio de luz. Es el caso de los ortomixovirus y paramixovirus que se pueden reconocer por la hemadsorción de eritrocitos de cobayo a las células; la identificación se confirma con la inmunofluorescencia directa mediante anticuerpos específicos. Esta técnica se basa en la capacidad de glóbulos rojos de determinada especie animal de unirse a proteínas virales que están siendo incorporadas en la membrana plasmática en las células infectadas. Agregando glóbulos rojos a una monocapa infectada con virus es posible observar microscópicamente la adherencia de los mismos a células que contienen virus y que están expresando antígenos virales en su superficie. Por medio de esta técnica, es posible demostrar la infección por aquellos virus que presentan proteínas hemoaglutinantes. III. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección. Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico virológico se basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas. Igualmente la detección del genoma viral puede favorecer la precocidad del diagnóstico viral y su confirmación. En la última década se han desarrollado una serie de técnicas para el diagnóstico viral basadas en la detección de ácidos nucleicos. De ellas la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada. En el momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear nuevas y más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de ácidos nucleicos con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido. - 19 -

3.1 METODOS DIRECTOS Son aquellos que detectan: 3.1.1 La Presencia de Antígenos Virales (técnicas inmunológicas) A.-INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID) Es una de las técnicas más antiguas y de uso más difundido en el laboratorio clínico. El principio básico de la inmunofluorescencia directa se ilustra en la figura 1.

Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los antígenos víricos en el interior de las células. La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana. Esta técnica se puede utilizar para una identificación rápida del virus directamente sobre la muestra (por ejemplo: células eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado nasofaríngeo), o se la puede emplear para la confirmación del efecto citopático observado en cultivos celulares. Además con el uso de anticuerpos monoclonales específicos para los antígenos tempranos inmediatos del Citomegalovirus (CMV) es posible determinar la presencia del CMV en cultivos celulares días antes del reconocimiento del efecto citopático. Sin embargo la realización de la reacción es - 20 -

laboriosa, depende mucho de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnóstico certero, así como una recolección y preparación de la muestra adecuada. Aun así, el método, en manos de una persona con experiencia resulta útil para la identificación rápida de ciertos virus como los virus respiratorios, ya que nos proporciona un diagnóstico etiológico en el curso de una jornada de trabajo. Además puede estudiar varias muestras simultáneamente. El advenimiento de los anticuerpos monoclonales, ha incrementado la especificidad y en algunos casos la sensibilidad de estos ensayos. Los anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína pueden utilizarse para identificar el virus Respiratorio Sincicial (VRS), Influenza A y B, Parainfluenza 1,2 y 3 y Adenovirus entre otros, así como para subtipificar especies virales como, por ejemplo, virus Herpes Simple (HSV) de tipo 1 y 2. Esta técnica requiere sólo 2-4hs, y se ha reportado una sensibilidad del 70-80 % comparada con cultivos celulares para la identificación de virus Herpes Simple, 80-95% para VRS y 71% para Influenza A. La tinción con inmunoperoxidasa es similar a la de la inmunofluorescencia y es la técnica de elección en algunos laboratorios. El procedimiento implica unos pocos pasos adicionales ya que en este caso el anticuerpo monoclonal esta marcado con una enzima que requiere la adición de un substrato para evidenciar la reacción por un cambio de color que es visible micro y macroscópicamente. B.-TEST DE AGLUTINACION EN LATEX Las partículas de látex son esferas de poliestireno que se unen fácilmente al fragmento cristalizable (Fc) de moléculas de inmunoglobulina G (IgG) o inmunoglobulina M (IgM), esta última es mucho más eficiente en aglutinar partículas naturales. Los fragmentos de unión del anticuerpo (FAb) quedan expuestos y son capaces de unirse al antígeno que se encuentra en la muestra. Cuando los antígenos tienen varios epítopes (o estructuras antigénicas repetitivas), los anticuerpos multivalentes acoplados a múltiples partículas de látex se unen al antígeno y se produce un entramado de las partículas de látex que dan como resultado una aglutinación visible. Esta técnica se aplica ampliamente en el laboratorio de microbiología, porque es fácil de realizar, requiere sólo unos

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minutos y no necesita equipo, pues se lee a simple vista. Sin embargo, ofrece como desventaja la presencia de reacciones cruzadas sobre todo con otros antígenos en la muestra y también ocurren interferencias por el fenómeno de prozona, en el que un exceso de anticuerpos no permite la formación del entramado. Esta técnica se usa comúnmente para la demostración de antígenos de rotavirus en materias fecales.

C.- INMUNOENSAYO Ensayos de captura del antígeno (sándwich), inmunocromatografía. Son inmunoensayos en fase sólida donde se fijan los anticuerpos específicos para el virus en la superficie de una matriz, tubo o microplaca y luego se pone en presencia del suero o muestra que contiene el antígeno que se quiere demostrar; una vez ocurre la reacción antígeno-anticuerpo, se hace un lavado y se agrega un anticuerpo marcado, que depende de la marcación del anticuerpo. La prueba se denomina radioinmunoensayo (RIA) o inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA o EIA) dependiendo del trazador que se utilice para evidenciar la reacción. • Se denomina RIA cuando el anticuerpo se marca con un isótopo radioactivo, el más utilizado es el yodo, el anticuerpo que reacciona a manera de sandwich, se pega a los epítopes del antígeno que han quedado expuestos; después de varios lavados, se mide o cuantifica la radioactividad mediante un contador de centelleo. El número de destellos por minuto es directamente proporcional a la concentración del antígeno que reacciona y de acuerdo con una serie de estándares de concentración conocida, se realiza una curva y se extrapolan los valores de la muestra. • En la técnica ELISA el anticuerpo se marca con una enzima que puede ser la fosfatasa alcalina (FA) o la peroxidasa de rábano (PR) y para revelar la reacción se coloca el sustrato específico para la enzima que es modificado por ésta y produce un compuesto coloreado. En el caso de la FA el sustrato es el paranitrofenilfosfato y para la PR es el peróxido de hidrógeno en una solución de ortofenilendiamina (OPD) que hace visible la reacción. Para la cuantificación se mide la absorbancia en una longitud de onda determinada en un espectrofotómetro. La absorbancia será directamente proporcional a la

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cantidad de antígeno descubierto. Estas técnicas se utilizan ampliamente en el diagnóstico de hepatitis A y B, rotavirus, el agente Norwalk, ADV, el RSV, parainfluenza, influenza A y B. Para la hepatitis B la demostración de antígeno de superficie diagnóstica la infección activa y en VIH la demostración del antígeno p 24 es útil en el diagnóstico de la infección en niños y en pacientes que se encuentran en ventana inmunológica, además es de gran utilidad en el pronóstico y la progresión de la infección así como en el control de la terapia antirretroviral.

3.1.2 El Virus Como Partícula Viral A. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

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Mediante el microscopio electrónico es posible observar la morfología de los viriones presentes en muestras clínicas. La limitación del método además del costo del microscopio, es que necesita de una alta concentración de viriones (aproximadamente 109 partículas virales/ml, dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es poco sensible. Esto hace que sea una técnica poco utilizada, más aún con el desarrollo de técnicas alternativas de utilidad similar. El microscopio electrónico nos permite, por ejemplo, obtener resultados positivos rápidos de muestras de materias fecales de pacientes con diarrea, ya que tanto los Rotavirus, como los Adenovirus, Coronavirus y Calicivirus pueden ser visualizados e identificados como causantes de enfermedad. Por ejemplo, los Rotavirus poseen una forma característica en doble rueda y un tamaño distintivo, 70nm de diámetro, y se los encuentra en concentraciones de hasta 10 11 partículas virales por gramo de heces. También en otras muestras, como líquido vesicular, biopsia de tejidos, verrugas, orina o suero es posible obtener resultados positivos, mediante coloración negativa. Si la concentración de virus en la muestra clínica es baja, y por tanto no visible directamente por microscopio electrónico, se pueden utilizar técnicas que aumenten la visualización, por ejemplo, la inmunoelectromicroscopía, que consiste en el agregado de anticuerpos específicos antivirales y la formación de agregados de partículas que son más fácilmente visibles que las partículas solas. Fig. 5.

3.1.3 Técnicas de Diagnóstico Molecular

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Para el diagnóstico de una enfermedad infecciosa, además del diagnóstico directo (visualización y/o cultivo del agente infeccioso) y del diagnóstico indirecto (detección de anticuerpos frente al agente infeccioso), disponemos de la posibilidad de analizar la presencia de los ácidos nucleicos del agente infeccioso en la muestra clínica mediante técnicas de diagnóstico molecular. Este procedimiento permite, entre otras ventajas, detectar de una forma rápida microorganismos difícilmente cultivables, como muchos virus (VIH, hepatitis B) y bacterias orales (Treponema denticola). Las ventajas de las técnicas moleculares ha sido ampliamente publicitadas en los últimos 7 años, lo que sin duda ha aumentado la presión en los laboratorios clínicos para comenzar a usarlas en una amplia variedad de enfermedades infecciosas, genéticas, oncológicas y neurológicas. Las técnicas de diagnostico molecular comprenden técnicas que evidencian o descubren el material genético específico viral conservado y replicable ya sea que se encuentre en un fluido, en una célula o tejido, ya sea activo o latente. Estas técnicas, que son más rápidas que las tradicionales, permiten hacer estudios en tejidos almacenados y se pueden clasificar en dos categorías:

A. ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN.
 Hibridación con sondas. La emergencia de la biología molecular ha dado lugar a nuevas herramientas moleculares que han adaptado rápidamente al campo del diagnostico viral. El diagnostico basado en el DNA esta revolucionando al abordaje integral de la identificación y monitorización de las enfermedades infecciosas, genéticas, y neoplásicas, y otros cuadros clínicos, este nuevo enfoque utiliza factores genotípicos mas que fenotípicos para identificar patógenos específicos. El poder del diagnostico basado en el DNA se debe a dos hechos: (1) los ácidos nucleicos pueden medirse de forma rápida y sensible, y (2) la secuencia de nucleótidos en una determinada molécula de DNA es tan específica que pueden usarse los análisis de hibridación para diagnostico clínicos fiables. En un ensayo de hibridación molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones pueden ser: DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA.

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Para realizar este ensayo se dispone de sondas de acidos nucleico, pues esta sonda es una sola hebra de DNA que contiene secuencias caracteristicas de un determinado virus. La sonda de acido nucleico se obtiene, se obtiene la extraer secuencias secuencias específicas de un fragmento de ADN por medio de las endonucleasas de restricción. Luego estas secuencias extraídas, se pueden desnaturalizar y marcar ya sea con una enzima o con un isótopo radioactivo. A estas cadenas marcadas y que tienen una secuencia conocida se llaman sondas de ácidos nucleicos. Hoy en día se están produciendo sondas de ácidos nucleicos sintéticas, con lo que se obtiene sondas de oligonucleótidos de muy alta especificidad que están disponibles comercialmente y son las más usadas en los laboratorios. Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los ácidos nucleicos. Posteriormente se añade un DNA marcado, complementario del DNA del virus y se incuba en condiciones para que se produzca la hibridación. La muestra se pasa entonces por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada. Dependiendo de como este marcada la sonda, se detecta la hibridación: Si está marcada con un isótopo radiactivo se puede hacer una lectura en un contador gamma de manera que la cantidad de radiación medida en la columna es directamente proporcional a la cantidad de DNA viral presente en el suero problema o también se puede realizar la electroforesis del DNA hibridado con la sonda marcada en gel de poliacrilamida y detectar la radioactividad emitida por la sonda mediante la aplicación de una placa de rayos X (Autoradiografía). Si esta marcada con una enzima se detecta por una simple evaluación colorimétrica.

ADN blanco

Desnaturalización de ADN

Hibridización de la sonda con el ADN blanco

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Hibridación con sondas

B. TÉCNICAS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO.
 Reacción en cadena de la Polimerasa. (PCR) Una nueva técnica, llamada Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), fue desarrollada por Saiki et al., para incrementar el número de moléculas de DNA blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una única molécula de DNA y una sola copia de genes puede ser extraída, de mezclas complejas de secuencias genómicas y visualizada como bandas diferentes en geles de agarosa. La PCR es, por tanto, una amplificación de secuencias específicas del DNA. Se basa en la utilización de secuencias cortas de nucleótidos sintéticos llamados primers o cebadores, que se hibridan de forma especifica con cada una de las cadenas de DNA , previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reacción tenga lugar se usa una enzima, Taq pol (ADN Polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucleótidos trifosfatos. La función natural de la DNA polimerasa consiste en reparar y replicar el DNA. Los deoxinucleótidos trifosfatos se necesitan como ladrillos para la construcción. El nucleótido al cual se una la polimerasa será complementario de la base en la posición correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza así una cadena simple de DNA, complementaria y alineada a cada "primer”. Este método se basa en una serie repetida de ciclos, cada uno de los cuales esta compuesto por 3 pasos fundamentales: • • • 1º Desnaturalización del ADN doble cadena 2º Acoplamiento de los cebadores (primers) sintéticos 3º Elongación del cebador usando una ADN polimerasa.

En el primer paso el ADN aislado de la muestra es desnaturalizado a elevada temperatura (95ºC) quedando las hebras complementarias libres.

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En el segundo paso a una temperatura menor (dependiente de la temperatura de hibridización de los primers), se acoplan los cebadores a las secuencias complementarias que se encuentran en regiones adyacentes a la secuencia seleccionada. El paso final del ciclo consiste en la elongación (extensión) del cebador para sintetizar la hebra complementaria. En esta última etapa la temperatura generalmente utilizada es de 72ºC, (aunque puede variar según la enzima utilizada) permitiendo la incorporación de desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) a partir del extremo 3´OH del cebador. Este proceso es catalizado por la Pol I Thermus aquaticus (Taq pol). Dicha polimerasa permite el apareamiento de las bases complementarias al ADN molde. Estos tres pasos básicos ocurren durante varios ciclos (generalmente entre 25 y 35) en donde el ADN se elonga a una velocidad de 120 nucleótidos/segundo en dirección 5´→3´. La repetición de tales ciclos es lo que permite la amplificación del ADN. Es importante destacar que cada uno de los productos obtenidos en cada ciclo, actúa como molde para el ciclo siguiente, produciéndose de esta forma una síntesis exponencial del fragmento inicial de ADN. Otros componentes necesarios en la PCR son: buffers que contengan Mg+2 (muy importante para el funcionamiento de la enzima), cationes monovalentes y algunos solventes que ayuden a estabilizar la enzima. Las variaciones de temperaturas y los tiempos necesarios son críticos en esta técnica, para ello se utiliza el Termociclador, el cual realiza estas variaciones automáticamente. Aunque la PCR ha sido diseñada en base a la amplificación de ADN, ésta técnica puede ser empleada en el análisis de ARN. La técnica de RT-PCR ha aumentado considerablemente la sensibilidad en la detección de virus ARN. Para ello es necesario generar en primer lugar el ADN complementario (ADNc) a partir del ARN. En esta reacción se utiliza la enzima llamada transcriptasa reversa. Una vez sintetizado el ADNc, éste se amplifica siguiendo el mismo

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procedimiento descrito para la PCR actuando este último como molde.

Reacción en cadena de la polimerasa

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Método de reacción de polimerasa en cadena (PCR), en que se muestra progresión de la síntesis de nuevas hebras.

 OTRAS TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN. Reacción en cadena de la ligasa o LCR. Sistema QB replicasa.

C. VENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES. Sensibles para genes de importancia para la investigación y para el diagnóstico clínico. Algunas de las ventajas de las técnicas de sondas de ácidos nucleicos se discuten a continuación.  La unión entre ácidos nucleicos es más fuerte que la avidez del anticuerpo por el antígeno. También los ácidos nucleicos son mucho más estables que las proteínas a alta temperatura, alto pH, solventes orgánicos y otros compuestos.  Los agentes infecciosos involucrados en la patogénesis de una enfermedad pueden ser cuantificados aun cuando estén presentes en cantidades de subpicogramos o como infecciones latentes.

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 En una infección microbiana, las sondas de DNA o RNA pueden detectar la presencia de secuencias genéticas en lugar de los productos de genes. Así, las primeras etapas de la enfermedad se pueden diagnosticar en pacientes en los cuales las pruebas serológicas o histopatológicas fallan en descubrir la causa.  La prueba de hibridación in s i tu es suficientemente sensible para detectar bajos niveles de DNA o transcripciones de RNA directamente en la células o tejido afectado. Esta técnica es particularmente útil para la localización de áreas afectadas en un órgano y para la identificación de fenotipos de células infectadas. Esto no es posible cuando se extrae el DNA o RNA total.  Son rápidos para identificar a las partícula viral, en tiempo de 2 a 4 horas (hibridación de sondas)ç, de 4 a 8 horas(PCR).  Permite detectar cantidades muy pequeñas de virus.  Presenta una sensibilidad y especificidad alta.

D. DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES.  Son caros, tienen un alto costo.  La necesidad de cebadores específicos para encontrar determinado microorganismo y por ello hay la posibilidad de falso (+), lo que implica un conocimiento adecuado de la secuencia de nucleótidos del agente.  la aplicación de estas técnicas exige una infraestructura y entrenamientos adecuados.  La prueba se tiene que efectuar en condiciones adecuadas de astringencia es decir, a una temperatura, pH y concentración de cebadores y nucleótidos adecuados. Si hay fallas, pueden ocurrir amplificaciones inespecíficas y contaminaciones con DNA extraño. 3.2. MÉTODOS INDIRECTOS

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Las métodos indirectos a comparación de las pruebas directas son aquellas en lasque se demuestra, un contacto del huésped con el agente viral, mediante la determinación de anticuerpos específicos contra el virus. Estos métodos o técnicas serológicas son las que se usan con mas frecuencia para descubrir anticuerpos contra un determinado agente viral, teniendo en cuenta que la exposición al agente viral produce una respuesta por parte del sistema inmune del huésped. Las técnicas serológicas indirectas se clasifican en tres grupos, teniendo como base la cuantificación de la reacción antígeno – anticuerpo: 3.2.1 Pruebas serológicas Indirectas que dependen de la capacidad del anticuerpo que se une al antígeno para ejercer alguna función no relacionada con el virus. Dentro de estoas pruebas tenemos: A. Fijación del Complemento: (FC) Es un sistema semicuantitativo, que proporciona de manera exacta la

cantidad de antígenos o de los anticuerpos contra esos antígenos. Este método de cuantificación de las proteínas virales es particularmente útil para la detección de las infecciones virales abortivas, es decir cuando solo se expresa parte de la información genética presente en el genoma viral y no se producen partículas virales. Hoy en día se utiliza como estándar de comparación para las nuevas pruebas comerciales. Una de sus aplicaciones consiste en determinar anticuerpos contra agentes de baja prevalencia como los virus coxsackie, o también para determinar la actividad de ciertas infecciones como por ejemplo la rubéola. El proceso que se lleva a cabo es el siguiente: • En un principio el antígeno reacciona con anticuerpo que se encuentra en la muestra de suero del paciente y en presencia de complemento, titulado previamente. • • Si el antígeno y el anticuerpo reaccionan se activa la vía clásica del complemento. Seguidamente se añade el indicador constituido por eritrocitos cubiertos con anticuerpos y de esta forma, si el complemento se fija y es activado por el complejo antígeno viral – anticuerpo, los eritrocitos no se lisarn; pero si

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no hay unión antígeno - anticuerpo, el complemento permanece libre y se une al complejo indicador y produce lisis de los eritrocitos. En conclusión este método emplea el complemento para lisar eritrocitos que a su vez funcionan como indicadores. La interpretación de la prueba de fijación de complemento es que la lisis es resultado negativo de la prueba y la ausencia de lisis un resultado positivo. Fijación de complemento Positiva

Antígeno

Anticuerpo en suero

Reacción Ag-Ac fija complemento Hematíes

No hay lisis prueba positiva

Fijación de complemento Negativa

Antígeno

Anticuerpo inespecífico en suero

No hay reacción Hematíes C libre

Presencia de lisis prueba negativa

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B. Hemoaglutinación Indirecta. Para realizar esta prueba se utilizan antígenos ligados a glóbulos rojos o eritrocitos, para detectar anticuerpos específicos. Los eritrocitos se pueden sensibilizar con diversos antígenos y se pueden utilizar como sistema indicador; la variedad de antígenos que pueden unirse a glóbulos rojos pueden ser: Carbohidratos, proteínas etc. Esta prueba se usa para demostrar anticuerpos contra virus como fiebre amarilla, influenza, parainfluenza • y dengue; dado que este método es altamente exacto y rápido para cuantificar partículas virales. El proceso se lleva a cabo realizando diluciones seriadas en una placa multipocillos de fondo en U: en los pocillos se realizan las diluciones seriadas de los sueros y sobre ellos se depositan la suspensión de hematíes sensibilizados con el antígeno. • • Si hay anticuerpos suficientes para aglutinar se forma una malla que se deposita y se observa una especie de velo que cubre el fondo del pocillo. Cuando no existan anticuerpos o estén en cantidad insuficiente, entonces las células sedimentarán de forma independiente y resbalaran por los bordes del pocillo hasta acumularse en el punto mas bajo del mismo, el cual se observa como un acumulo nítido en el fondo. C. Aglutinación de látex. Similar a la técnica de látex ya descrita sólo que en este caso el antígeno se encuentra fijo a la partícula de látex y, por tanto, se espera descubrir los anticuerpos que se encuentran en la muestra. Este ensayo generalmente son pruebas de filtro (tamizaje) pues sólo determinan la presencia o no de anticuerpos y los resultados se pueden interpretar como «inmune» (si es positivo) o «susceptible» (si es negativo), como en el caso de determinar el estado inmune para el virus de la rubéola, VIH, rotavirus del grupo C, virus de Epstein-Barr(EBV). La información que suministra corresponde a exposición al agente o infección pasada;

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generalmente las pruebas de látex no son específicas para ésta. En virología se utiliza con más frecuencia la técnica de aglutinación de látex directa. 3.2.2 Pruebas Serológicas Indirectas que revelan la capacidad de los anticuerpos para bloquear la infección viral especifica; dentro de estas pruebas tenemos: B. Neutralización Viral. La neutralización de los virus se define como la disminución del poder infectante del virus a consecuencia de su interacción con el anticuerpo especifico, la unión que se da entre el antígeno viral y el anticuerpo no altera irreversiblemente a ninguno de los componentes que forman el complejo, puesto que dichos componentes se pueden recuperar por disociación tanto el virus como el anticuerpo. Dicho ensayo es bastante relativo y el mecanismo por el cual el anticuerpo neutraliza el poder infectante del virus va depender de los siguientes factores: - virus. - Variedad de anticuerpo. - de la relación cuantitativa. - Del comportamiento especial de determinada célula huésped frente al complejo antígeno – anticuerpo. Los mecanismo por los cuales los anticuerpos de neutralización logran su efecto es mediante. • Inhibición de la absorción viral sobre las células. Cuando los anticuerpos se unen a la superficie del virión para impedir la adsorción como por ejemplo la IgG que posee 2 focos de fijación al antígeno permitiendo, así el establecimiento de 2 enlaces específicos con 2 grupos determinantes sobre un mismo visión. El coeficiente de temperatura, cuando se da el complejo antígeno – anticuerpo es elevado, lo cual da lugar a cambios de conformación en ambos moléculas. Estos cambios bastan para inhibir la fijación del virus que se combinarían con los receptores celulares. • Aumento de la degradación del virus

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Se dan en los casos en los que la interacción del virus con el anticuerpo no impide su fijación sobre las células sensibles, a pesar de que las proyecciones superficiales del virus estén cubierto de anticuerpos, para esto el virus cubierto de anticuerpos es fagocitado y el anticuerpo ejerce su efecto de neutralización dentro de la célula impidiendo la liberación normal de núcleos virales. En conclusión el complejo antígeno anticuerpo se desarrolla como unidad dentro del fagosoma por efecto de enzimas de lisosomas y volviéndose el genoma vírico soluble e impidiendo su duplicación del Acido - Nucleico. Esta técnica se ha utilizado para el diagnostico de las infecciones por dengue. Resultado Positivo

Partícula Anticuerpos Bloqueo viral en suero Ac + Ag

Células no infectadas

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Resultado Negativo

Células Anticuerpos No hay infectadas por Partícula viral en suero reacción virus libre no neutralizado

B. Inhibición de la Hemoaglutinación : (IH) Esta prueba demuestra la capacidad de algunos antígenos virales para aglutinar eritrocitos. Esto lo hacen debido a que sus proteínas, para poder absorberse a las células interactúan con receptores sobre la superficie del eritrocito: sin embargo la interacción es impedida por anticuerpos específicos en el suero del paciente evitando la aglutinación de los eritrocitos por tales antígenos; los antígenos implicados en esta reacción son los componentes de la superficie de la partícula viral, los cuales poseen determinantes antigénicos mas específicos de tipo. Esta prueba de la inhibición de la hemoaglutinación es un medio altamente específico para la caracterización de los virus. Para realizar la prueba se hacen diversas diluciones del suero con el fin de hacer una titulación y determinar el nivel de anticuerpos del paciente. La reacción constituye la base para numerosas pruebas diagnosticas, las enfermedades en la que se puede demostrar la respuesta de anticuerpos por la prueba de IH son: Influenza., Enf.de New Castle, Rubéola, Sarampión, Dengue, infecciones por reovirus, etc. La interpretación de la prueba de IH se lee de la siguiente manera: - Aglutinación positiva; se forma un recubrimiento rojo granular difuso en el fondo del tubo.

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- Aglutinación negativa; botón rojo compacto en el fondo del tubo que se desliza al inclinarlo.

Antígeno viral

Anticuerpos Ag-Ac bloquean Inhibición de específicos aglutininas HA

3. 2.3. Pruebas Serológicas que miden la Interacción Antígeno-Anticuerpo A. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) IFI; es un método rápido y confiable que permite la detección de anticuerpos o antivirales en el suero de paciente. Se basa en la unión de anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente a los antígenos virales expresadas en la superficie de células infectadas. El procedimiento se basa en lo siguiente: • Primeramente se fija el antígeno (células infectadas y no infectadas) a un portaobjetos y se incuba con el suero; si existe anticuerpos específicos, se unirán a los determinantes antígenicos. • Seguidamente se realiza un lavado y se lleva a incubar la muestra con la antiglobulina marcada para revelar la presencia del primer anticuerpo. • Luego el conjugado se unirá a los anticuerpos del paciente; y si la reacción es positiva se revelara el inmunocomplejo que vendría hacer el anticuerpo especifico. En la prueba de IFI el lavado de ambos pasos elimina los anticuerpos que no se han fijado específicamente; y la utilización de antiglobulina marcada, que

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puede ser anticuerpo antiinmunoglobulina G humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína, que es una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposición de la luz ultravioleta y emite una luz verde característica. La presencia de anticuerpos de evidencia por la aparición de fluorescencia en el citoplasma y superficie de células infectadas, mientras que las células control no fluorescen. Esta técnica se ha utilizado para descubrir anticuerpos contra rubéola, VIH, etc. Actualmente ha sido remplazada por la prueba de ELISA debido a que presenta una especificidad similar y se puede leer mediante equipos automatizados lo que elimina la subjetividad inherente al observador en IFI y la necesidad del microscopio de fluorescencia.

B. Inmunoensayo Ligado a Enzimas (ELISA) La prueba ELISA indirecta tiene un principio semejante al de la ELISA directa, sólo que en este caso, un antígeno específico está unido a una fase sólida que puede ser un tubo, microplaca o perlas de vidrio; luego se añade el suero del paciente que posee los anticuerpos y después se adiciona el

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conjugado constituido por un anti-anticuerpo IgG o IgM unido a una enzima; posteriormente se adiciona el sustrato específico para la enzima, que lo va a modificar y produce un compuesto coloreado, cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpo en el suero del paciente. Esta prueba se utiliza ampliamente; más aún, con el advenimiento y la disponibilidad de los sistemas automatizados se puede efectuar en un periodo de 1 a 2 horas. Su utilidad en virología es básicamente para determinar anticuerpos contra antígenos específicos del dengue, HSV, VIH, RSV, CMV, rubéola, hepatitis A, B y C principalmente, y en infecciones por EBV se usa para demostrar marcadores serológicos tempranos de la infección, que se pueden utilizar en el manejo de huéspedes inmunocomprometidos.

C. Inmunoblot o Western Blot Las técnicas inmunológicas de Inmunoblot están encontrando amplias aplicaciones en el diagnóstico virológico; esta tecnica utiliza un control para comparar y poder determinar el tipo de proteína para la cual hay antígenos específicos; y de esta forma poder definir exactamente contra cuáles proteínas están dirigidos los anticuerpos del paciente y asimismo determinar la fase de la infección en que se encuentra.. Son particularmente útiles para el diagnóstico del HIV. La técnica de WB se basa en la separación electroforética de proteínas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto de determinar la presencia de anticuerpos específicos contra cada una de esas proteínas. - 40 -

Esta técnica se realiza esquemáticamente en 3 pasos: • Se produce en cultivos celulares grandes cantidades de virus que luego son tratados químicamente para su disgregación e inactivación. Los antígenos resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel de Poliacrilamida. • • Se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag separados a una membrana de nitrocelulosa. Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de nitrocelulosa. Posteriormente se añaden anticuerpos anti-inmunoglobulina humana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y, por último, se agrega el substrato enzimático para la visualización de las bandas reactivas con un producto final coloreado. Esta prueba es muy específica y se utiliza como suplementaria y confirmatoria en infección por el VIH o HTLV-I cuando ELISA da resultados contradictorios o difíciles de interpretar. También se utiliza para diferenciar entre infección por VIH1 y VIH2.

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Referencias ACTON, J. (1967) Virología. Edit. Interamericana. Mexico D.F. MADIGAN, M. y J. PARKER (1997) Brock Microbiología de los Microorganismos. 8º Edic. Edit. Mc Graw Hill. Mexico D.F. JAWETZ E., J. MELNICK, E. SDELBERG (1996) Microbiología Médica. 15º edic. Edit. El Manual Moderno. Mexico D.F. Microsoft ® Encarta ® 2007. © 1993--2006 Microsoft Corporation. Reservados todos los derechos. PRESCOTT L., J. HARLEY, D. KLEIN (1999). Microbiologia. 4º edic. Edit. Mc Graw Hill Mexico D.F. METODOS DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO VIRAL. disponible en: http://www.ciencia-hoy.retina.ar/hoy20/sondas.htm REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (LA PCR) Jean-Pierre HERVEG y Maritza BARCIA-MACAY. Disponible en: www.icampus.ucl.ac.be/.../PCR/PCR.html

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