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Bacterias Fitopatogenas

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3 Bacterias Fitopatógenas
Yonis Hemández Las bacterias son organismos microscópicos sumamente pequeños. Se conocen alrededor de 1600 especies de ellas. La inmensa mayoría son organismos estrictamente saprófitos y como tales benefician al hombre ya que ayudan a descomponer las cantidades enormes de materia orgánica que produce anualmente el hombre y sus fábricas en forma de productos de desecho o que son el resultado de la muerte de las plantas y los animales. Varias especies producen enfermedades en el hombre, entre ellas la Tuberculosis, la Neumonía y la Fiebre Tifoidea, y otras producen enfermedades en los animales, como es el caso de la Brucelosis y del Antrax. En relación con las bacteriosis, el reconocimiento de las mismas como agentes causantes de enfermedades en plantas, comenzó recién desde hace alrededor de 100 años. En una década (18771887) T.J.Burril y J.C.Arthur en Estados Unidos, trabajando con tizón violento o fogón de las pomaceas; J.H.Walker en Holanda, trabajando con la amarillez del jacinto y L.Savastano en Italia, trabajando con el mal negro de la vid, demostraron que dichas enfermedades tenían una bacteria como agente causal. A pesar de estos trabajos, muchos patólogos vegetales, no reconocieron la existencia de las bacteriosis y solamente a comienzos del siglo XX las evidencias existentes, permitieron convencer y aceptar universalmente la existencia de enfermedades causadas por bacterias y esto se debe a las numerosas y excelentes aportaciones de E.F.Smith desde 1895. Características de las Bacterias Fitopatógenas Morfología: La mayoría de las bacterias fitopatógenas tienen forma de bastón, la únicas excepciones son un par de especies de Stheptomyces las cuales son filamentosas. Los bastones son más o menos cortos y cilíndricos y en los cultivos jóvenes tienen una longitud que va de 0.6 a 3.5 mm y un diámetro de 0.5 a 1.0 mm. En los cultivos viejos o en altas temperaturas los bastones de muchas especies son mucho más largos e incluso pueden tener forma filamentosa. En ocasiones se dan variaciones de la forma de bastón en la forma de una masa, una Y o una V y otras formas ramificadas. Las paredes celulares de la mayoría de las especies de bacterias están cubiertas por un material viscoso y gomoso que puede ser delgado (caso en el cual se le denomina capa mucilaginoso) o denso, formando una masa relativamente amplia en torno a la célula (en cuyo caso se le denomina cápsula). La mayoría de las bacterias fitopatógenas poseen delicados flagelos en forma de filamentos que a menudo son considerablemente más largos que las células que formaron. En algunas especies bacterianas, cada bacteria presenta un solo flagelo, mientras que otras poseen un ramillete de flagelos en uno de sus extremos, algunas tienen un flagelo simple o un ramillete de ellos en cada extremo y todavía otras poseen flagelos peritrícos, es decir, distribuidos sobre toda la superficie. En las especies filamentosas de Stheptomyces, las células constan de filamentos ramificados cenocíticos (no septados), los cuales a menudo tienen forma espiral y producen conodios en cadena sobre hifas aéreas.

Las células bacterianas presentan paredes celulares delgadas, relativamente firmes y un poco rígidas que al parecer son bastante distintas a la membrana citoplasmática interna pero que en ocasiones parece integrarse y fusionarse en la capa mucilaginoso externa o la cápsula. La pared celular incluye el contenido de la célula y permite la entrada al flujo de nutrientes y la salida de desechos, enzimas digestivas y otros productos emitidos por la célula bacteriana. Todas las sustancias contenidas en el interior de la pared celular constituyen el protoplasto. Este está formado por una membrana citoplásmica o membrana del protoplasto, la cual determina el grado de permeabilidad selectiva de las distintas sustancias que fluyen hacia el interior y desde el exterior de la célula; por el citoplasma que es una mezcla compleja de proteínas, lípidos, carbohidratos, muchos otros compuestos orgánicos, minerales y agua, y por el material nuclear, que aparece como corpúsculos esféricos, elipsoidales o en forma de pesas que se encuentran dentro del citoplasma. Reproducción: Las bacterias fitopatógenas en forma de bastón se reproducen mediante el proceso asexual conocido como ‘fisión binaria’ o ‘fisión’ . Esta se produce por la invaginación de la membrana citoplasmática hacia la parte central de la célula, formando un tabique membranoso transversal, que divide al citoplasma en dos partes aproximadamente iguales. Durante el proceso, se secretan o sintetizan dos capas del material de la pared celular (continuando con la pared celular externa) entre las dos capas de la membrana. Cuando concluye la formación de dichas paredes celulares, las dos capas se separan dando como resultado un par de células. Mientras que la pared celular y el citoplasma están sufriendo fisión, el material nuclear se organiza en una estructura circular en forma de cromosoma la cual se autoduplica y se distribuye por partes iguales entre las dos células formadas a partir de la célula en división. Ecología y Diseminación: La mayoría de las bacterias fitopatógenas se desarrollan principalmente como organismos parásitos en las plantas hospedantes y parcialmente en el suelo como saprófitos. Sin embargo hay grandes diferencias entre especies en cuanto al grado de desarrollo en uno u otro ambiente. Algunas bacterias patógenas, tales como Erwinla amylovora que produce el tizón del fuego, producen sus poblaciones en la planta hospedantes, mientras que en el suelo su número disminuye con rapidez y a menudo no participa en el avance de la enfermedad de una estación a otra. Estos patógenos han desarrollado ciclos de infección sostenidos de planta en planta, con frecuencia a través de insectos vectores y, ya sea debido a la naturaleza perenne del hospedero o a la asociación que se establezca entre las bacterias y sus órganos de propagación vegetativa o semilla, han perdido los requerimientos necesarios para sobrevivir en el suelo. Algunas otras bacterias patógenas, tales como Agrobacterium tumefaciens , la cual produce de la agalla de corona, forman sus poblaciones en el interior de las plantas hospedantes, pero estas poblaciones sólo disminuyen gradualmente cuando se liberan en el suelo. En caso de que hospedantes susceptibles se desarrollen en ese suelo durante varios años, podría liberarse una cantidad suficientemente alta de bacterias para causar un incremento neto en su número poblacional en el suelo

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de una estación a otra. Por último otras bacterias patógenas, tales como Erwinias y Pseudomonas causantes de pudriciones blandas producen parte de sus poblaciones en el suelo. Cuando habitan en el suelo, las bacterias viven principalmente sobre los órganos vegetales y con menos frecuencia libre o saprofíticamente o en su mucílago bacteriano natural el cual las protege de varios factores adversos. Las bacterias pueden sobrevivir en o sobre las semillas, otros órganos de las plantas, insectos, etc., que se encuentran en el suelo. Sobre las plantas, las bacterias pueden sobrevivir epifíticamente en yemas, en heridas, en sus exudados o en el interior de varios tejidos u órganos que infectan. La diseminación de las bacterias fitopatógenas de una planta a otra o a otra parte de la misma planta, se lleva a cabo principalmente a través del agua, los insectos, diversos animales y el hombre. Aún bacterias que poseen flagelos se desplazan sólo a distancias muy cortas. La lluvia por su efecto de lavado o salpicado, lleva y distribuye bacterias de una planta a otra, de uno de sus órganos a otro y del suelo a las partes inferiores. Género de Bacterias Causantes de Enfermedades Los principales géneros de bacterias fitopatógenas son los siguientes: Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Agrobacterium y el anteriormente llamado Corynebacterium que se dividió en 4 géneros Rhodococcus, Arthrobacter, Clavibacter y Cuitobacterium. Existen otros géneros que también causan enfermedades, entre ellos Xilella, Clostridium y Bacillus. Síntomas Producidos por Bacterias Fitopatógenas Manchas y tizones: Las cuales pueden aparecer sobre hojas, tallos, inflorescencias y frutos como manchas de varios tamaños o como necrosis continuas de rápido avance (tizones). La mayoría de las manchas bacterianas son causadas por bacterias de los géneros Xantomonas y Pseudomonas mientras que los tizones verdaderos son causados por especies de Erwinia y Pseudomonas. Marchitamientos vasculares: Afectan plantas herbáceas como hortalizas, cultivos mayores y a plantas tropicales y ornamentales. Entre los géneros de bacterias que producen este tipo de enfermedad se encuentran especies de los géneros Clavibacter, Curtobacterium (antes Corynebactorium), Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas. Pudriciones blandas: Generalmente desprenden un olor desagradable por la producción de sustancias volátiles en el tejido, cuando éste es degradado por la bacteria. Los géneros bacterianos involucrados en este tipo de síntomas son Erwinia, Pseudomonas y Ciostridium. Agallas y proliferación de raicillas: Las agallas se forman en los tallos y raíces de plantas infectadas, principalmente por bacterias pertenecientes al género Agrobacterium. Además está involucrado en esta sintomatología una bacteria del género Pseudomonas. La proliferación de raicillas puede ser ocasionada por bacterias también del género Agrobacterium y Rhodococcus .

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Cánceres: Son producidos por bacterias del género Clavibacter, Xanthomonas y Pseudomonas. Sarnas: Estos son síntomas ocasionados por bacterias del género Streptomices principalmente. Diagnóstico de Bacterias Fitopatógenas La discusión del diagnóstico de bacterias fitopatógenas (Toma de muestras, aislamiento e identificación) es tomada del libro Manual de Laboratorio. Diagnóstico de hongos, bacterias y nemátodos fitopatógenos. Toma de muestras: ¿Cuándo deben analizarse las muestras vegetales en busca de posibles bacterias fitopatógenas? . La respuesta, evidentemente compleja, no puede ser resumida en una proposición concisa y su ambigüedad es tal que resultaría obvio aconsejar: "Cuando se sospeche la existencia de estos microorganismos". En efecto, la aparición sobre diversas partes vegetales de marchitamientos, oscurecimientos vasculares, podredumbres, enanismos, agallas o distorsiones, corresponde a un conjunto de síntomas que pueden tener su orígen en causas diversas: Fisiopatías, ataques de hongos fitófagos, reacciones ante lesiones producidas por nemátodos, por insectos y, desde luego, también por bacterias. No obstante, hay una sintomatología clásica provocada por determinadas infecciones bacterianas en los vegetales que supone: alteraciones de los tejidos con presencia de zonas acuosas o de aspecto aceitoso, exudados y manchas o necrosis angulares. Por otra parte, existen creencias bastante difundidas, basadas en fenómenos organolépticos, que atribuyen a las bacterias fitopatógenas un protagonismo, por lo general, inexistente. De forma más precisa se está aludiendo al “mal olor”, desprendido por algunos vegetales enfermos, y sobre todo por aquellos que presentan una podredumbre blanda. Sin embargo, en gran número de ocasiones, la fetidez se debe a bacterias no fitopatógenas, saprófitas o parásitos secundarios, que crecen sobre tejidos ya muertos o tan viejos y débiles que estando próximos a su fin fisiológico, son incapaces de resistir el ataque de otro organismo; el olor desagradable es producido generalmente por sustancias volátiles originadas durante la desintegración de los tejidos de las plantas cuando son atacadas por saprófitos. Por tanto, el mal olor no implica necesariamente la actuación de una bacteria fitopatógena, aunque en algunos casos pueda ser debido a ella. La toma de muestras constituye un pilar fundamental no sólo para la emisión de dignósticos correctos, sino también para la elaboración de cartografías que permiten un conocimiento general de los patógenos existentes en cualquier país, de sus áreas de dispersión, de los cultivos afectados o de la intensidad de sus daños. Por ello se recomienda la elaboración de fichas de campo lo más completas posible. la localización cartográfica de los lugares muestreados y una selección cuidadosa del material a estudiar.

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Consejos Prácticos para Recolección y Transporte de Muestras Si bien la experiencia dictará la forma más adecuada de efectuar la toma de muestras en cada caso particular, se van a indicar unos consejos que pueden resultar muy prácticos para la ejecución de esta actividad. Equipo básico: La recogida de muestras de campo, sea cual sea la metodología de muestreo elegida, precisa un equipo mínimo sencillo compuesto, en la mayor parte de los casos, por los siguientes elementos: tijeras de podar, navaja, pinzas, recipiente isotérmico, guantes y protectores del calzado de un sólo uso, bolsas de papel y de plástico, papel o aluminio, etiquetas, lápices, rotuladores, fichas o cuaderno de campo, algodón y un recipiente irrompible con alcohol de 96°. Cómo realizar el muestreo: Cuando nos encontremos en el lugar indicado para iniciar el muestreo es conveniente observar la rutina siguiente: 1. Comprobar la localización cartográfica realizando las anotaciones pertinentes en las fichas o cuaderno de campo. Deberán quedar bien reflejados todos los antecedentes planta/anomalía y en este sentido los agricultores de la zona, al conocer la historia del campo y del inicio de la enfermedad, serán una fuente de información muy valiosa. Podría significar gran ayuda para realizar el muestreo en el terreno y orientar los análisis de laboratorio, el saber, por ejemplo, si se ha aplicado algún tratamiento cuyos residuos resulten nocivos en el cultivo actual, si las siembras se han efectuado en el momento oportuno, si han existido condiciones ambientales; lluvias, tormentas- relacionabas con la aparición o expansión de la enfermedad o si las primeras plantas afectadas presentaban características comunes (determinada variedad, lote de semillas, procedencia). Las fichas de campo son aconsejables que se adapten a un modelo único, hecho que no impedirá ampliar determinadas informaciones de acuerdo con problemas específicos. 2. Realizar una toma de muestras representativa de todos los síntomas de la enfermedad que incluya, de forma preferente, los estados iniciales de infección. Esta recomendación resulta válida incluso en muestreos prefijados estadísticamente en los que, sin prejuicio de ser efectuados según el protocolo, se adjuntará como anexo la muestra recogida en las condiciones señaladas. El proceso de toma de muestra deberá realizarse con toda meticulosidad pues una selección incorrecta podría llevar a diagnósticos equivocados. Con el fin de evitar problemas que suelen presentarse al realizar las observaciones y análisis de laboratorio, indicamos que las anomalías sintomatológicas se apreciarán mejor si se comparan con material sano recogido en el mismo estado de crecimiento y los aislamientos se obtendrán con más facilidad si las muestras no presentan estados avanzados de descomposición. Por ello, en el campo, si los síntomas observados son manchas y necrosis en hojas o frutos, deberán seleccionarse hojas y

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frutos, incluso de plantas vecinas a una fuertemente atacada, que tenga zonas acuosas o puntos translúcidos, ya que estas áreas necróticas son lugares con baja densidad de inóculo para intentar los aislamientos y, además están normalmente colonizadas por saprófitos: cuando se aprecien marchitamientos de hojas y/o tallos, o un oscurecimiento del sistema vascular, se recogerá, si es posible, la planta entera puesto que puede haberse producido un bloqueo de los vasos del xilema y no encontrarse el patógeno en la parte de la planta con síntomas (así un aislamiento del agente productor del chancro bateriano del tomate, Clavibacter mchiganense subsp, michiganensis no va a lograrse fácilmente a partir de vasos muy atacado debido a las migraciones del patógeno); en los casos de chancros y desecamientos la muestra tendrá que incluir el borde de la lesión y varios centímetros de tejido sano, pues lo más probable es que el patógeno ya no exista en los tejidos viejos o cancerosos (si se intenta analizar un brote quemado de peral para averiguar un posible ataque de Erwinia amylovora, agente productor del fuego bacteriano, se detectará con más facilidad a varios cm de distancia del frente desecado); cuando se trate de podredumbres blandas, ya sean plantas o tubérculos, sólo se conseguirá un aislamiento relativamente fácil a partir de muestras casi sanas; indicamos también que en los tumores o agallas bien desarrolladas no existen patógenos y sólo cuando son muy jóvenes puede encontrarse en su interior la causa de su formación. Empacar de forma adecuada cada muestra con su etiqueta de identificación correspondiente Las muestras para análisis bacteriológicos suelen introducirse en bolsas de plástico y, dado que este material crea condiciones ambientales favorecedoras de la multiplicación de saprófitos indeseados, es importante que antes de su empaquetado estén libres de humedad superficial. Se aconseja, siempre que sea factible, sustituir el plástico por papel aluminio. Además no deberá utilizarse plástico (las bolsas de papel son más aconsejables) cuando se envuelvan tejidos con síntomas de podredumbre blanda o con alta probabilidad de sufrir alteraciones de ese tipo, como ocurre con la papa y las cebollas. Para una mejor conservación de las muestras, recomendamos guardarlas en neveras portátiles o, por lo menos, mantenerlas protegidas de calores excesivos y desecaciones que se originan, por ejemplo, cuando se dejan expuestas a pleno sol. Evitar cualquier peligro de contaminación. Así cuando las raíces formen parte de una muestra deberá impedirse que la tierra manche al resto de la misma, para ello conviene colocar una bolsa de plástico cerrada alrededor de las raíces y de la parte inferior del tallo e introducir todo a continuación en una segunda bolsa. Si una muestra incluye agallas radiculares debe procurarse no dañarlas, puesto que se contaminarían probablemente con saprófitos del suelo. Al terminar de recoger cada muestra es preciso desinfectarse con alcohol las manos y todos aquellos instrumentos que pudieran haber estado en contacto con agentes nocivos. Esto se hace tanto para evitar la contaminación de nuevas plantas y la diseminación de las enfermedades como para protegernos ante un posible patógeno humano. Si se ha actuado con guantes de plástico y protectores del calzado habrá que recogerlos en una bolsa para su posterior eliminación.

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Tratamientos previos Cuando las muestras lleguen al laboratorio deberán colocarse entre 2°- 5° C, hasta el momento de realizar los correspondientes análisis. En caso de muestras con podredumbre blanda se efectuará lo antes posible para evitar la proliferación de organismos secundarios. Si se trata de manchas foliares puede procederse a herborizar parte de la muestra, sirviendo así como fuente de referencia al sobrevivir muchas bacterias meses o años en material desecado guardado a temperatura ambiente. Si las muestras van a ser enviadas a otro laboratorio es fundamental empaquetarlas adecuadamente para que sufran el menor deterioro posible. Como hemos dicho envolviéndolas en papel de aluminio, normalmente, llegan en unas condiciones óptimas. Si el envío incluye casos de patógenos invasores radiculares, conviene lavar algunas de las muestras dejándola libre de tierra y eliminando el exceso de humedad mediante un secado con papel de filtro; otra parte irá con tierra adherida por si fuese preciso realizar el aislamiento del suelo, pero procurando siempre que la tierra no manche el resto de la planta. Bases del Diagnóstico Antes de proceder a un análisis bacteriológico, en especial cuando no se tiene experiencia con la muestra problema, es importante recabar la máxima información bibliográfica sobre las fitobacterias que pueden atacarla. Se cataloga así una serie restringida de microorganismos. A continuación deberá realizarse una segunda selección en concordancia con la sintomatología observada. Estos pasos previos no se hacen con el fin de emitir un diagnóstico sintomatológico, sino para sacar el máximo partido de las experiencias que legan los investigadores y obtener resultados certeros con un mínimo esfuerzo. Por esta razón se aconseja que una vez efectuadas ambas selecciones, con la idea preconcebida de la posible causa de la enfermedad (uno o dos patógenos normalmente), se proceda según se especifica en capítulos sucesivos. Si los métodos que se utilizan en un proceso de identificación fueran similares o muy parecidos sería más correcto hacer un análisis general y, de acuerdo con el mismo, emitir un diagnóstico. Pero los métodos, lo mismo que los patógenos, son diferentes. Como por ejemplo podremos citar análisis de tubérculos de la patata: en nada se parecen los protocolos que deben seguirse para detectar e identificar las bacterias causantes de podredumbres blandas con los de Clavibacter michiganense subsp. sepedonicum productor de la podredumbre anular de la patata. En éste capítulo se indican de forma general, los pasos previos y los procedimientos que con mayor frecuencia se emplean para un diagnóstico. Su lectura y comprensión constituyen una base imprescindible en cualquier tipo de análisis. Información Inicial: Al encontrarnos en una época en la que el empleo de nuevas técnicas de análisis permite modificar la actual clasificación bacteriana y el aislamiento de nuevos patógenos, se hace indispensable recabar la máxima información actualizada sobre las posibles bacterias que pueden atacar a la muestra problema.

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Para facilitar los diagnósticos más usuales se han recopilado en la tabla siguiente, las bacterias que con mayor frecuencia afectan a diversas especies vegetales. La nomenclatura que normalmente se emplea es aquella que figura en la “ Approved list of bacterial names” (SKERMAN et.al.; 1980). Debemos señalar que en la tabla no están todos los que son, sino sólo los patógenos más frecuentes, y aún así se ha omitido, en algunos casos, bacterias que tienen una gama muy grande de hospedantes, como pueden ser causantes de tumores o de podredumbres blandas. Tampoco se citan bacterias que se encuentran en todas partes y normalmente no producen daños, pero que, en determinadas ocasiones, especialmente cuando las plantas crecen o se almacenan en condiciones inadecuadas, pueden convertirse en “patógenos oportunistas”, así ocurre con agentes pectinolíticos que se localizan normalmente en el suelo, en las raíces, o en la superficie de las hojas.(Pseudomonas marginalis, P. virídiflava, P. fluorescens, Erwinia spp.) Se mencionan, sin embargo, algunos patógenos clasificados recientemente, como el agente causante de la “Enfermedad de Pierce” de la viña, o el productor del “Corkeyroof” de la lechuga, aunque la gama de sus hospedantes, al igual que otros aspectos de su ciclo biológico, no está todavía determinada. Una vez enumerados los posibles patógenos se deberá procederse a su selección, de acuerdo con la sintomatología inducida en las plantas, sin olvidar que en lugares o microclimas determinados pueden aparecer síntomas no citados en la literatura y que un mismo síntoma puede tener orígenes muy diversos. A modo de ejemplo, y limitándonos exclusivamente a bacteriología, citamos los casos de Pseudomonas syringae pv. syringae, P. s. pv. phaseolicola y Xanthomonas campestris pv. phaseolí Productores todos ellos de manchas grasas en hojas de frijol. Selección del material y de los puntos de análisis: Si se quiere efectuar con rapidez un diagnóstico se deberá seleccionar correctamente la parte o partes de la muestra que vayan a analizarse, siendo las ideales aquellas que presenten un único tipo de población: la patógena. Para ello se precisa disponer en el laboratorio de material fresco con síntomas de ataque incipiente. Si la muestra contiene material descompuesto, es vieja, procede de suelo, o se ha empaquetado húmeda, pueden encontrarse muchos saprófitos que dificulten o impidan el aislamiento del patógeno, no sólo por su desarrollo más rápido, sino también por su capacidad competitiva que origina luchas biológicas no deseadas en placas de cultivos. El simple lavado de la muestra con agua del grifo, su introducción en hipoclorito sódico al 0,5% durante dos o tres minutos seguido de un lavado con agua, o el paso de un algodón embebido en alcohol y un ligero flameado, ayudará a eliminar los saprófitos superficiales. Con una desinfección excesiva se corre el riesgo de destruir a la vez saprófitos y patógenos. Se comprende que cuando se busca un patógeno en una mancha foliar deberán tan solo realizarse ligeras desinfecciones (incluso un simple lavado con agua), mientras que si la localización es en el interior de vasos podrá llegarse a la introducción directa de pequeños trozos de muestra en alcohol y su paso por la llama. Contrariamente la desinfección no podrá realizarse cuando se busquen patógenos sobre las superficies (por ejemplo, cubierta de las semillas). A veces resulta práctico efectuar los análisis con y sin desinfección.

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Como lugar o lugares de análisis se elegirán aquellos en los que se sospeche una multiplicación inicial del patógeno. Si se observan, por ejemplo, manchas sobre las hojas, se buscará en primer lugar la existencia de pequeños puntos, de tipo acuoso preferentemente y tal vez sólo observables al trasluz, que se seleccionarán, aunque se realicen otros análisis sobre manchas más desarrolladas. En caso de necrosis en tallos, puede resultar práctico analizar independientemente tanto los límites superior e inferior de la necrosis visible, como diversas zonas colindantes de apariencia totalmente sana, debido a que el frente de avance de la bacteria puede encontrarse a varios centímetros del lugar donde se observan los daños, tal ocurre, como ya se ha dicho, en los casos de Erwinia amylovora en su ataque a brotes de rosáceas. Estas dificultades para la localización del patógeno pueden solventarse mediante un examen microscópico de los diversos tejidos. Así, en los casos de manchas, basta coger un pequeño fragmento de las misma, colocarlo en un porta objetos con una gota de agua y después de taparlo con un cubreobjetos, observarlos a 400 u 800 aumentos; se podrá apreciar como una masa bacteriana fluye y se difunde en el agua a partir de la sección del tejido. Cuando se trata de análisis vasculares, conviene separar y presionar cuidadosamente los vasos para permitir que las bacterias salgan de su interior, observándose de forma similar. Si bien este examen microscópico es importante, la simple detección' de células bacterianas no es suficiente para un diagnóstico. Por una parte, las bacterias pueden confundirse con restos de células de la planta o con gránulos de almidón o clorofila y, por otra parte, la observación microscópica no permite diferenciar saprófitos de patógenos. Extracción bacteriana: Una vez seleccionados los lugares de análisis, para conseguir que las bacterias abandonen las células de la muestra, se procede a disgregar los tejidos de la planta en un medio líquido. Este proceso deberá realizarse de la forma más aséptica posible, si bien la técnica de extracción dependerá del tipo de tejido y el lugar en que se encuentre ubicado el patógeno. Con frecuencia, especialmente en casos de manchas foliares la disgregación se realiza colocando los tejidos en cajas de Petri (a ser posible de vidrio) y partiéndolos finamente con la ayuda de bisturíes. Otras veces, por ejemplo para extraer patógenos del interior de semillas, se procede a la molienda de las muestras. Como medio líquido a menudo se utiliza agua estéril pero en algunas ocasiones es preciso recurrir a determinados tampones o caldos nutritivos que facilitan la extracción y multiplicación del microorganismo. El paso de las bacterias al medio líquido se favorece al agitar los recipientes, placas, matraces, o vasos, que contienen las mezclas; el tiempo óptimo de maceración es variable según el proceso que se realice. Así, por ejemplo, en análisis de semillas cuando se buscan bacterias en su interior, es frecuente proceder a triturar las muestras en molinos y mezclar la harina resultante con un medio líquido. En este caso, no es necesario, ni conveniente, que la muestra permanezca tiempo en remojo, pues la finura de la trituración permite el paso casi instantáneo de las bacterias al líquido, por lo que la permanencia de la harina en remojo va a favorecer sobre todo la multiplicación de saprófitos. Contrariamente, cuando las semillas no se trituran y las bacterias deban salir por sí mismas del interior de las cubiertas el tiempo que precisan es mucho mayor e incluso puede ser necesario emplear un medio líquido tamponado que evite

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las alteraciones del pH además de efectuar siembras progresivas del mismo para determinar el tiempo óptimo de remojo. Siembra, interpretación de cajas y aislamientos: Antes de sembrar debe comprobarse que en las cajas con medio de cultivo no existan contaminaciones. Es fundamental que la superficie del medio no tenga agua libre, ya que la mayor parte de las bacterias puede desplazarse nadando, forma un tapiz de organismos entremezclados en lugar de colonias separadas. Normalmente, si el medio no se ha vertido muy caliente y las cajas se han dejado secar a temperatura del laboratorio, en 24 o 48 horas están en condiciones de uso. Ante una necesidad urgente se forzará el secado, para lo cual se colocan abiertas boca abajo durante 20 o 30 minutos en estufa a 400C o bien se dejan el mismo tiempo abiertas en posición normal, dentro de una cámara de flujo laminar. Para efectuar la siembra se deposita sobre la capa de agar, con ayuda de pipeta Pasteur, asa de inoculación u otro instrumento adecuado, una gota de líquido procedente de la maceración de los tejidos, y se extiende sobre la superficie del medio formando estrías en 4 direcciones perpendiculares. Esta operación puede efectuarse con el asa deslizándola suavemente en posición vertical sobre la superficie del medio; el asa se quemará y enfriará (tocando por ejemplo la superficie del agar entre las estrías) antes de efectuar las extensiones en una nueva dirección, con el fin de favorecer la aparición de colonias separadas. Todo el proceso debe realizarse en máximas condiciones asépticas evitando cualquier corriente de aire incluidas las que origina el operario con sus movimientos. Una vez sembradas las cajas se ponen a incubar en posición invertida, para evitar condensaciones indeseables de agua en la tapa a una temperatura normalmente comprendida entre 25 y 27°C, aunque en ocasiones, por ejemplo, con determinadas bacterias corineformes, resultan más apropiadas temperaturas inferiores de 21 a 23 °C. Si se sospecha que el organismo que se va buscando puede tardar en aparecer (tal como Clavibacter michiganensis subsp. sepedonkum, Xanthomonas ampelina, Xanthomonas fragariae) es aconsejable sellar las placas con papel poroso y elástico. Se consigue así una menor desecación del medio, al mismo tiempo que se protegen de la entrada de ácaros u otras posibles contaminaciones. Las placas de Petri ya sembradas deberán examinarse diariamente, observando y anotando la aparición y las características de las colonias. Estos detalles van a proporcionar una clave para emitir u orientar el diagnóstico. Así las colonias macroscópicas visibles a 24- 36 horas suelen corresponder a sapráfitos mientras que la mayor parte de las Pseudomonas fitopatógenas y los distintos patovares de Xanthomonas campestris producen colonias visibles a simple vista a las 48-72 horas. Cuando se espera la aparición de organismos de crecimiento lento es aconsejable utilizar una lupa para ayudar a su detección y recorrer visualmente tanto el lugar donde se ha depositado la gota, como las diversas estrías. Así pues, el primer dato que hay que anotar es el tiempo de aparición de las colonias y, en sucesivas lecturas, otros detalles como su diámetro variable desde fracción de milímetros a varios centímetros, forma (reticulares, ovaladas, irregulares, con bordes enteros, ondulados, estrellados, llanas sobre el agar, levantadas, acuminadas, lisas o rugosas), color (opacas, translúcidas u opalescentes). Estas anotaciones morfológicas se refieren a colonias que se encuentran bien separadas e idealmente creciendo en cultivo puro. Sin embargo, el hecho real es que muy pocas veces se consigue éste y la

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interferencia de la flora acompañante es un obstáculo. El patógeno deberá ser el organismo predominante en la placa de aislamiento. Si esto no ocurre, y sobre las placas aparece todo un mosaico bacteriano, el intentar localizar el tipo de colonias correspondientes al patógeno es como buscar una aguja en un pajar. Nuestro mejor consejo es que se efectúen nuevas siembras. Cuando en las placas se observe la presencia de colonias sospechosas de pertenecer al patógeno, entremezcladas con sapráfitos, de tal forma que no se localicen colonias solitarias, conviene tomar unas cuantas colonias, diluirlas en agua estéril y efectuar una resiembra con objeto de garantizar la pureza de los aislamientos y comprobar la fidelidad de las anotaciones. Entre la flora acompañante que aparece con mayor frecuencia figura Erwinia herbicola. El aspecto inicial de sus colonias puede recordar al de algunos Pseudomonas, pero al crecer produce un exudado de aspecto mucoide con un pigmento amarillo o naranja no difusible que la asemeja a un Xanthomonas u otro patógeno. También se presentan a menudo saprófitos con colocaciones amarillas o rojizas (pigmentos carotenoideos) o con pigmentaciones verdes fluorescentes en medios deficientes en hierro que pueden corresponder a Pseudomonas patógenos o no patógenos. Como se ha dicho, el examen de las cajas orienta el diagnóstico pero además, algunas veces, es suficiente como tal. Supongamos, por ejemplo, que se han analizado unas plantas de tomate, las lecturas de los 3 primeros días han llevado a describir diferentes tipos de colonias, y al revisarlas nuevamente se observa la presencia de abundantes colonias amarillas puntiformes que surgen entre las estrías. Casi con toda certeza se puede diagnosticar Clavíbacter michiganensis subsp michiganensis., más si los síntomas observados sobre las muestras coinciden con los originados por este patógeno. Otro resultado que al observar las plantas puede obtenerse es que las anomalías observadas no se deben a un agente bacteriano. Para afirmar esto debe tenerse mucha seguridad en los análisis, siendo tal vez más prudente afirmar que no se han logrado aislar bacterias fitopatógenas. En ocasiones al estudiar las características de algunos aislamientos pueden indicarnos que se trata de una fitopatógena, por ejemplo, Pseudomonas syringae. Sobre esta bacteria, u otras que tienen una fase de vida epífita, se quiere llamar la atención por el hecho de que no es suficiente la simple localización de colonias aisladas para atribuirle la causa de una enfermedad. Insistimos en que el patógeno debe figurar entre los organismos predominantes en las placas de aislamiento. Es por tanto necesario, después de todo lo dicho, considerar en la lectura de las placas de análisis la concentración de colonias bacterianas de un supuesto patógeno para continuar con la identificación y centrar el diagnóstico. El aislamiento de la colonia deberá realizarse tocándola ligeramente con la punta de una aguja enmangada y sembrando una estría en un tubo con agar inclinado o en otra caja de Petri. La ventaja de utilizar placa es que ahorra manipulación de tubos, pudiendo una misma caja servir para varios aislamientos. Llamamos la atención sobre esta forma de actuar que, aunque no es realmente ortodoxa, puede resultar práctica, pero existe el peligro tanto de mezcla de aislamientos como de competencia de los mismos por el medio nutritivo. La forma más correcta de realizarlos y al mismo tiempo estudiar las características de las colonias, es coger las que se localizan solitarias, suspenderlas en agua estéril y resembrar. Ello va a permitir comprobar la pureza del cultivo, hecho imprescindible cuando se han usado medios selectivos, puesto que aunque en la placa se observen colonias perfectamente aisladas

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pueden contener entremezcladas células de otras bacterias cuyo desarrollo se ha inhibido, pero se mantienen viables. Por otra parte conviene señalar que la morfología de las colonias puede sufrir variaciones estables o inestables, y que los pigmentos se ponen de manifiesto en medios concretos según la edad de los cultivos y el estado nutricional, lo cual puede dificultar el encaje de esas colonias en un "patrón taxonómico" concreto. Selección de cultivos bacterianos: Dado que hoy en día la identificación bacteriana implica realizar una serie de test, más o menos fiables, pero largos y laboriosos en todo momento, resulta más práctico normalmente, iniciar los ensayos comprobando en primer lugar la patogenicidad de los aislamientos para saber si el organismo aislado es el causante de la enfermedad y, en caso afirmativo, proceder a su posterior identificación. Desde un punto de vista "teórico-real" los bioensayos deben efectuarse sobre la misma especie hospedante (e incluso cultivar) de la que se ha aislado el patógeno. Ello implica tener invernaderos, o cámaras climatizadas que permitan disponer de una amplia gama de plantas cuyo estado fenológico puede ser importante para algunas inoculaciones. Estas exigencias constituyen un factor limitante y, en general, sin solución, máxime si se tiene en cuenta la necesidad tan frecuente de emitir un diagnóstico de forma rápida. En la práctica sólo en casos muy específicos y concretos, un laboratorio de diagnóstico tiene planificadas y “listas para uso” las plantas hospedantes. El problema de la provisión de plantas se soluciona parcialmente efectuando cierto tipo de ensayos, que si bien no constituyen auténticos exámenes de patogenia, si proporcionan una ayuda inicial de gran valor en la selección previa de aislamientos. Entre los más difundidos figura el test de hipersensibilidad realizado frecuentemente sobre hojas de tabaco; la amplia utilización de esta prueba, rutinaria en los laboratorios, se debe a que la mayor parte de las bacterias fitopatógenas tiene la propiedad de inducir la reacción de hipersensibilidad mientras que los saprófitas no la tienen. El ensayo, tal como se realiza actualmente, es muy práctico con patógenos cuya gama de hospedantes es restringida, mientras que carece de valor significativo ante bacterias muy polífagas, por ejemplo Agrobacterium induce tumores o algunas Erwinias ssp. causantes de podredumbres blandas. Otro tipo de pruebas, también de amplio uso, consiste en hacer las inoculaciones sobre fragmentos de plantas. Se aplican no sólo para comprobar el poder patógeno de cultivos puros, sino también como medio de crecimiento más propicio o selectivo para el desarrollo de fitopatógenos que de sapráfitos; ésta última característica posibilita su empleo como fuente de aislamientos indirectos de los patógenos. Diagnóstico e Identificación: El objetivo fundamental de todo laboratorio de diagnóstico es si una muestra está o no enferma y cuál es la causa o causas de la enfermedad. Factores limitantes, como pueden ser el tiempo o los medios disponibles, hacen que la mayor parte de las veces los problemas haya que resolverlos emitiendo un diagnóstico presumible, por ejemplo, cuando dentro de una zona determinada se están presentando daños similares a otros estudiados previamente, basta con efectuar algunas pruebas para emitir con bastantes garantías un diagnóstico que permitirá la acción contra el agente causante. La confirmación del diagnóstico, para el cual se requiere el aislamiento, la comprobación del poder patógeno y la identificación bacteriana, se efectuará siempre que sea posible

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pero necesariamente cuando aparezca un problema ya sea en una nueva área o sobre una especie diferente. Un grado más avanzado de dificultad, que sobrepasa las posibilidades de un laboratorio normal, es la clasificación de nuevos patógenos. Estos capítulos de bacteriología están orientados exclusivamente hacia el diagnóstico e identificación de fitopatógenos que pueden aislarse en medios normales de cultivo, dejando a un lado, a pesar de su enorme importancia, otros que necesitan requisitos muy especiales para su aislamiento y cultivo, tal como es, y por mencionar alguno, el agente productor sobre las viñas de la enfermedad de PIERCE. Xylella fastidiosa, perteneciente a un nuevo género de bacterias de reciente descripción. Así pues, nuestras orientaciones van dirigidas al diagnóstico e identificación de las fitobacterias tradicionalmente enclavadas dentro de los géneros Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas, cuya identificación suele ser muy sencilla aunque, por supuesto, hay algunas excepciones. Las normas previas que se dan a continuación provienen en parte del "Bergey's Manual of Determinativo Bacteriology" y se basan en el estudio de ciertos caracteres fenotípicos fáciles de comprobar. Las bacterias presentan una serie de características que por su constancia, se consideran de valor taxonómico. Entre ellas figuran el Gram, el tipo de respiración aeróbica, anaeróbica, anaeróbicafacultativa, existencia de citocromo c-oxidasa, arginina dihidrolasa o catalasa. Existen otras propiedades, tales como la utilización o producción de ácidos a partir de azúcares, ácidos orgánicos o aminoácidos, a veces empleadas en la identificación, que pueden variar de un aislado a otro y estar en clara dependencia con las condiciones de trabajo. Cuando se establece una clasificación es fundamental que los caracteres elegidos no sólo sean constantes sino también que al estudiarlos se obtengan resultados claros. Sin embargo, a veces las dudas son inevitables. Como ejemplo, se admite la existencia de un primer criterio de división bacteriana en Gram (+) y Gram (-), pero ¿Qué hacer cuando el Gram es variable, o cuando aparecen aislamientos con la oxidasa incierta o débilmente positiva?. En primer lugar, hay que asegurarse que se trabaja con un cultivo puro y tener en cuenta que los resultados pueden depender, entre otros factores, de la cantidad de inóculo, de la temperatura y período de incubación, de la composición del medio o de la versatilidad de interpretación de resultados. Todo lo anterior pone de relieve la necesidad tanto de disponer de cepas de referencia como de métodos de diagnósticos tipificados que puedan aplicarse por igual en los laboratorios. Muchos métodos para el diagnóstico de enfermedades bacterianas se basan en técnicas de detección que no requieren el aislamiento del patógeno. Las siguientes son las normas básicas a seguir en una correcta identificación bacteriana: • • • Estar seguros de la pureza del cultivo. Trabajar de mayor a menor categoría (género, especie). Usar toda la información disponible para limitar el rango de los patógenos.

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Aplicar el sentido común a cada etapa. Usar el número mínimo de tests para hacer la identificación. Comparar los aislamientos con cepas de referencia.

Métodos Serológicos Otra manera de realizar el diagnóstico de bacterias fitopatógenas en una determinada muestra, es a través del uso de la Serología. Las técnicas serológicas permiten la detección e identificación de estos patógenos en menor tiempo que el usado por el método tradicional de aislamiento e identificación, a través de pruebas morfológicas, fisiológicas y bioquímicas (ya discutido) y en forma precisa, lo que hace que estas técnicas sean de uso frecuente en los laboratorios de diagnóstico. (La discusión de estas técnicas son tomadas del libro "Manual de laboratorio. Diagnóstico de hongos, bacterias y nematodos fitopatógenos. 1991). Características antigénicas de las bacterias: Las células bacterianas no son antígenos homogéneos sino que están compuestas por numerosos antígenos, a modo de mosaico, distribuidos en la pared celular, y en los flagelos. Por otro lado, los constituyentes de la pared celular varían según que la bacteria sea Gram(+) o Gram(-). Así, las bacterias Gram(+) pueden poseer dos tipos de constituyentes antigénicos: los debidos a la pared, de gran poder antigénico entre los que figuran algunas proteínas, polisacáridos y ácidos teicoicos. Los capsulares sólo se encuentran en aquellas bacterias provistas de ella, estando formados por polímeros de azúcares. En las bacterias Gram(-), los antígenos de la pared tienen como constituyente principal, un complejo polisacarídico cuya especificidad antigénica viene en función de la naturaleza y variabilidad de las cadenas de azúcares que lo componen, no de la pared lipídica. Estos antígenos somáticos de la bacterias Gram(-) se denominan antígenos-O, debido al tipo de enlace y la posición en las cadenas de los azúcares, siendo específicos de cada grupo de bacterias. Los antígenos flagelares son moléculas de proteínas fibrosas que constituyen los cilios de las bacterias flageladas y se les denomina antígenos-H, aunque los determinantes antigénicos responsables de su especificidad son desconocidos. En algunos casos existen antígenos capsulares, aunque a veces se tratan de estructuras externas de la pared, formadas por polisacáridos altamente polimerizados. Estas sutancias son inmunógenas y en general específicas de tipo. Test de aglutinación: Al poner un antígeno en presencia de sus anticuerpos específicos se produce la combinación entre ellos, dando lugar a la formación de un agregado, que a lo largo del proceso va haciéndose más voluminoso y se observa más claramente al flocular en la suspensión que lo contiene. En las soluciones acuosas, las bacterias se mantienen dispersas gracias a los grupos hidrófilos que poseen en su pared. La aglutinación se va a producir por medio de los anticuerpos específicos y sus determinantes antígenos. Al agregar un antisuero, los determinantes antigénicos de la pared bacteriana se bloquean por la fijación de los anticuerpos. Como éstos tienen dos sitios de combinación, pueden reaccionar con dos unidades bacterianas diferentes formando redes tridimencionales que dan lugar a agregados, los cuales reuniéndose por aproximación entre sí forman aglutinados más o menos

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voluminosos. Su tamaño y velocidad de formación están en función de la concentración sérica, del pH, de la temperatura, de la agitación y de la relación entre las cantidades de antígenos y anticuerpos puestos en contacto. Este test, por su sencillez, se utiliza frecuentemente para la diagnosis y detección rápida de muchas bacterias fitopatógenas. Para su ejecución no se necesita ni gran experiencia ni aparatos complicados, sino todo lo contrario. Puede efectuarse en portaobjetos o en tubo de ensayo. a. Aglutinación en portaobjetos: Podemos afirmar que este ensayo serológico es la prueba más sencilla de realizar de todas cuantas van a exponerse. Aunque el método fue puesto a punto por TIPOGRAF (1941) en la URSS para el diagnóstico directo de Conybacterium sepedonicum sobre plantas, no obstante no suele aplicarse actualmente a detecciones directas sobre material vegetal debido a la elevada concentración bacteriana necesaria para poder visualizar la reacción, por lo que tan solo se utiliza con cultivos de bacterias previamente aisladas. Una de sus múltiples aplicaciones en laboratorio la constituye su inestimable utilidad en la identificación de Erwinia amylovora cuyos aislados (al menos por el momento) son por un lado antigénicamente homogéneos y por el otro muy diferentes de los de las bacterias asociadas normalmente en infecciones mixtas con ella. El proceso de ejecución del test es el siguiente: • Extraer con un asa una parte de un cultivo y suspenderla uniformemente en agua fisiológica (0.85% CINA), o en tampón fosfato salino 0.05M pH 7,2, o en casos de necesidad simplemente agua destilada estéril. Colocar en un porta objetos una gota de la suspensión anterior, procurando que sea densa. En ocasiones esta suspensión se prepara directamente en el porta objetos, depositando en él una gota de tampón y emulsionando el contenido de una asa con la que se ha extraído parte de un cultivo. Depositar próxima a la gota anterior, otra de volumen similar, de antisuero a la disolución adecuada (normalmente comprendida entre 1110 y 1150) en agua fisiológica. Poner cuidadosamente en contacto ambas gotas para que vayan mezclándose. Para ello se toma el porta objetos con los dedos, balanceándolo muy suavemente hasta producir el contacto entre ambas (por tanto, de antígeno y anticuerpo) y dar lugar al comienzo de la reacción. Ésta se hace visible al cabo de un cierto período de tiempo mínimo de unos 3-5 minutos. Los casos difíciles o dudosos pueden resolverse con ayuda de una lupa, aunque siempre es conveniente hacerlo de este modo.

• •

El test debe plantearse con los siguientes ensayos:

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a. La cepa problema con el antisuero. b. La cepa problema y el suero fisiológico. c. Un testigo positivo homólogo del antisuero. El establecimiento de este sistema tiene por objeto la comprobación de si la bacteria en estudio presenta por sí misma capacidad de aglutinación directa con el suero fisiológico al tiempo de detectar una posible contaminación por descuido o error del operario. La prueba c debe efectuarse previamente para tratar de conocer la dilusión óptima del antisuero que debe emplearse, efectuando ensayos de dilución de agua fisiológica, a escalas de 112, 114, 118, 1116, 1132, 1164, etc., para una concentración del antígeno de 100 bactlml, observando el límite de dilusión que es visible la reacción. Entonces para trabajar se elige el número de dilusión anterior al límite encontrado antes (si por ejemplo se observa aglutinación hasta 1164, se adopta para trabajar 1132). b. Aglutinación en tubo: Este método es más sensible que el anterior, siendo su ejecución de la forma siguiente: • • • • • • • • • • Colocar en la gradilla de 10 a 12 tubos de aglutinación o Waserman. Depositar 1,8 ml en el primer tubo y 1 ml en los restantes, de agua fisiológica tamponada (solución salina 0,85%), diluida 10 veces en el momento de su empleo. Preparar la dilución adecuada del antisuero con agua fisiológica, tomando como referencia la dilución óptima, que deberá haberse efectuado previamente. Depositar con una pipeta 0,2 ml de la dilución del antisuero anterior, en el primer tubo, mezclando ambas mediante succión y descargas sucesivas del líquido con la pipeta, hasta producir una mezcla homogénea. Pipetear 1 ml de la mezcla anterior y depositarla en el segundo tubo, repitiendo la operación anterior hasta su homogeneización. Repetir la serie de pipetos y mezclas hasta el penúltimo tubo, tirando la parte correspondiente a éste y quedando el último como control (sin antisuero). Depositar en cada tubo 1 ml de suspensión bacteriana de 9° bact/ml en suero fisiológico. Mezclar bien los contenidos de los tubos para lograr una perfecta homogeneización. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante media hora. Observar la aparición de la aglutinación semitransparente o blanquecina a modo de humo blanco, siendo la última aquella en que se percibe en el interior de la mezcla depositada en el tubo.

La suspensión bacteriana anteriormente citada puede prepararse con células bacterianas, tanto vivas como muertas. Se ha demostrado que en algunos casos, tales como las bacterias de los géneros Pseudomonas y Xanthomonas, los antígenos termostables son más específicos que los termolábiles. Por ello muchas veces resulta aconsejable coagular los antígenos termolábiles, lo cual puede llevarse a cabo mediante ebullición en un baño de María de la suspensión bacteriana durante dos horas.

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Test de doble difusión de agar: Es un método de precipitación, entendiendo como tal el proceso de reacción entre antígenos y anticuerpos específicos, en que primeramente se produce una combinación entre ambos, formando agregados de alto peso molecular que mediante procesos físico-químicos (distribución de cargas eléctricas, etc.) dan lugar a macro-moléculas insolubles que precipitan. Este método es más sensible que los de aglutinación, teniendo la ventaja de que pueden estudiarse y compararse simultánea e independientemente varios antígenos y antisueros. Para ello se emplazan ambos separadamente en pocillos efectuados en una capa de gel de agarosa y al difundirse a través de sus poros y entrar en contacto entre sí dan lugar a una reacción de precipitación en forma de líneas visibles. La cantidad de cualquiera de los reactivos en un punto dado del precipitado, es función de dos factores principales: a. Su concentración inicial. Una vez emplazado el reactivo en el pocillo correspondiente, comienza su difusión en el gel en sentido radial, formándose a partir del centro un gradiente continuo pero de concentración decreciente. b. La velocidad de difusión en el medio. El más utilizado es el gel de agar. Siendo éste un polisacárido extraído de algas marinas. Es soluble en el agua a 95 °C y forma un gel cuando se enfría a 37 °C. Al gelificar, las moléculas forman poros cuyo tamaño varía inversamente a la concentración del agar. Una vez que los reactivos se difunden en el medio gelosado, se produce la reacción serológica de precipitación en aquellos puntos en que las concentraciones de antígeno y anticuerpo están en equilibrio. La banda de precipitación será tanto más marcada cuanto mayor sea la cantidad de antígenos y anticuerpos reaccionantes, siendo más nítida y precisa, sin alargarse exageradamente, cuando los reactantes estén en equilibrio. Teniendo en cuenta que la velocidad de difusión de los diferentes antígenos y anticuerpos en el medio gelificado es variable según su tamaño, si se investiga organismos compuestos por diversos antígenos, como en el caso de las bacterias, se formarán bandas de precipitación sucesivas de manera ordenada. Por lo tanto cada banda formada determinará una estructura antigénica específica, por lo que el serotipo de la bacteria en estudio estará representado por el número total de bandas que componen la reacción, o sea la suma de estructuras antigénicas que componen la bacteria. El test de doble difusión en agar fue descrito en 1946 y desarrollado por OUCHTER LONY (1958). La sencillez del método, al no requerir manipulaciones ni aparatos complicados, ha hecho que sea altamente utilizado para diagnosis de numerosos agentes patógenos. Su único inconveniente es que la cantidad de antisuero utilizada es mayor que en otros métodos. Para la correcta aplicación del método, debe tipificarse la concentración de antígeno en 109 células/ml con objeto que las comparaciones con antígenos frente a una concentración dada de antisuero sea uniforme. Algunos autores destruyen los componentes antigénicos no específicos, pasando las suspensiones bacterianas por autoclave a 121 °C durante dos horas.

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La realización del test se lleva acabo de la manera siguiente: • Se prepara una suspensión de agar purificado al 0,8 por 100 contenido de 0,85 por cien de CINA y 0,02 por cien de azida de sodio como conservante, en agua destilada, hasta total disolución del agar para lo cual debe hervir la solución. Si se utilizan cajas de Petri de 100 x 15 mm, se depositan en ellas con ayuda de una pipeta 15 ml de la solución aún caliente, dejando enfriar hasta la solidificación y cerrando a continuación la placa. Si se utilizan portaobjetos, éstos deben emplazarse sobre bastidores de plástico «exprofeso», bien equilibrados hasta conseguir una perfecta horizontalidad. A continuación con la ayuda de una pipeta Pasteur o similar se depositan gotas o pequeñas cantidades de solución caliente entre los bordes de los portas y el del bastidor, con el objeto de que al enfriarse gelifique y deje sellados ambos entre sí. Una vez solidificado el gel de unión se deposita encima de los portas de nuevo solución caliente, con ayuda de una pipeta hasta conseguir llenar el bastidor entero, con lo que se obtendrá tras solidificación del gel por enfriamiento una capa de 1 mm de espesor. Los bastidores pueden conservarse hasta su utilización en cajas de plástico húmedas a 4 °C. La formación de pocillos en el gel, puede efectuarse con una plantilla agujereada según un esquema previsto (número de pocillos) y con ayuda de una sacabocados del diámetro a utilizar deseado. Este esquema se utiliza generalmente para caja de Petri empleando las siguientes medidas: diámetro del pocillo 5 mm, distancia entre pocillos 10 mm. Si por el contrario se utilizan bastidores con portaobjetos, existe un aparato manual que efectúa el agujereado del gel de los portas asimismo según el esquema elegido. En este caso el diámetro del pocillo es de 2 mm y la distancia entre pocillos es de 6 mm. Una vez efectuados los cortes en el gel para conformar los pocillos, mediante una pipeta Pasteur acoplada a través de una goma a una bomba de vacío, se succionan las porciones circulares cortadas, quedando así listos para poder ser llenados con los reactantes. Esta operación de extracción conviene hacerla inmediatamente antes de proceder a su rellenado. El esquema normalmente utilizado es el del de seis agujeros periféricos equidistantes entre sí (situados en los vértices de un hexágono) y de otro central. No obstante pueden emplearse modelos de cuatro y ocho agujeros, según la complejidad y número de muestras a estudiar. En el pocillo central se deposita el antisuero que normalmente es de un volumen de 50 ul, a la distribución conveniente. En los periféricos se depositan los antígenos involucrados en el estudio: la suspensión problema y sus dilusiones, los testigos, etcétera, en el mismo volumen que el anterior.

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Cerrar las placas de Petri o bien colocar los bastidores en un chasis de tres alturas y depositarlo en una caja de plástico con un poco de agua en el fondo para obtener una atmósfera húmeda. Dejar reposar a temperatura ambiente unas horas. Observar las bandas de precipitación formadas.

Test de Aglutinación pasiva al Látex: La realización del test se lleva a cabo en placas de perplex grueso, recuperables, o bien en láminas finas de plástico, desechables, pero en ambos casos provistas de pocillos semiesféricos en los que se depositan los reactivos y se lleva a cabo la reacción. Diversos factores afectan al buen funcionamiento de la técnica. En primer lugar, la concentración del antisuero influye en la fijación de los anticuerpos o de las inmunoglobulinas, o las partículas del látex por lo que deberá determinarse su óptimo ya que éste es un factor considerado crítico. En la aplicación del método se obtienen mejores resultados mediante la utilización de inmunoglobulinas purificadas que con antisueros brutos, o simplemente purificados. No obstante hay que tener presente que no todas las preparaciones de IgG obtenidas por precipitación con sulfato de amonio, son igualmente efectivas para "sensibilización" de partículas de látex, debido principalmente al grado variable de contaminación con albúminas y globulinas, etc. Algunos autores observan que estos hechos no tienen lugar cuando la preparación de inmunoglobulinas se lleva a cabo mediante electroforesis o por fraccionamiento por el método de Cohn, encontrado que el test resulta más específico y sensitivo. Nuestra experiencia nos muestra que una suspensión de suero-látex bien hecha permite efectuar un gran número de pruebas serológicas con una sensibilidad adecuada, evitando reacciones no específicas. Este producto es, normalmente, bastante estable si se conserva a 4 °C, al menos durante unos meses. Laboratorios Sintomatología: Familiarizarse con la sintomatología producida por las bacterias fitopatógenas, compara diferentes métodos de aislamiento de bacterias fitopatógenas. 1. Seleccione al menos 2 muestras sospechosas de estar afectadas por bacterias fitopatógenas, describa la sintomatología, tratando de diferenciar síntomas jóvenes, de viejos. 2. Observación del flujo bacteriano: En el caso de manchas, marchitamientos o quemazones selecciones un pedazo de tejido foliar, córtelo asépticamente con su escalpelo, (mm.), y colóquelo en un portaobjetos, con una gotita de agua destilada y déjela por espacio de 1-3 minutos. Cubra la gota con el cubreobjetos y observe el lente de inmersión, (es necesario el uso de aceite), la aparición del flujo bacteriano. 3. Estarán a disposición del estudiante cajas de cultivos con los siguientes medios: YCA: 10 gr. de levadura, 5 gr. de CaCO3 en 1 000cc de agua destilada, con 16 gr. de agar bacteriológico. Colóquelo en la autoclave por 15 minutos. YDCA: El mismo medio anterior agregando 10 gr. de dextrosa.

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AN: Agar nutritivo. Extracto de carne 3 gr., peptona de carne 5 gr. y 15 gr. de agar bacteriológico en 1 000cc de agua destilada. Estas cajas serán utilizadas para realizar los aislamientos del material a su disposición, las metodologías a usar serán discutidas en el momento del laboratorio. Cultivo puro, preservación y mantenimiento: Para la obtención de cultivos puros, tres (3) diferentes le serán discutidos (Na = agar nutritivo, YCA = agar levadura, CaCO3 y YCDA = agar levadura dextrosa y CaCO3) la composición exacta de los mismos le fue dada en el laboratorio anterior. 1. De sus placas donde se realizó sus aislamientos iniciales, seleccione una colonia aislada sospechosa de ser patogénica (creció después de 24 horas en el medio, es la más frecuente) con su asa de platino, previamente flameada y enfriada, repita el procedimiento de estriado para nuevamente obtener colonias aisladas, realicélo en los tres diferentes medios, dos placas de cada medio, previamente anote color de la colonia, brillo, elevación y forma, luego de dos o tres días tome nuevamente una colonia para dar inicio a su cultivo puro. 2. De las segundas placas se da inicio al cultivo puro, se le suministra tubos con agar inclinado y diferentes medios (YCDA - YCA). Tubos con sólo agua destilada, tubos con glicerol. 3. Siembre su cultivo puro tomando las precauciones en sus diferentes tubos de agar inclinado, dos tubos por cada medio por aislamiento, déjelo crecer hasta que sea visible el crecimiento de la bacteria, dos o tres días, luego cúbralo con: a.- Aceite mineral, b.- glicerina; un tubo cubierto de cada una de éstas maneras. Los tubos con agua destilada serán tratados en dos formas; una dilución de la bacteria bastante túrbida (3 ml) se agrega a 4 ml de agua destilada estéril, se mezclará y se guardará. Un último procedimiento será con la bacteria disuelta en agua destilada. Cultivo de 48 horas (túrbido). Tome tres ml y colóquelos en un tubo, luego añada la misma cantidad de glicerol y guárdelo. Todos pueden ser guardados a 4 °C con excepción del tubo con glicerol que se colocará a temperaturas de congelación. El objetivo es comparar éstos 4 medios de guardar o preservar bacterias, la penúltima semana de clases, el material será tomado y sembrado para realizar las comparaciones respectivas. Tinción de Gram: Este tipo de tinción nos diferencia las bacterias en dos amplios grupos: Gram positiva y Gram negativa. Gram positiva: retiene la tinción primaria dando una apariencia púrpura a negro azulosa. Gram negativa: pierde la tinción primaria y toman un color rosado suave.

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Procedimiento: • • • • • • • • • En una lámina porta objetos limpia, coloca una gota de suspensión bacteriana (48 horas de crecimiento) y realice un frotis con su asa de platino, séquelo al aire (sin calentarlo), suavemente pase por la llama la parte opuesta del porta objetos, para fijar la bacteria al porta objetos. Llene el frotis preparado y fijado con la solución cristal violeta por un minuto. Lave en agua corriente el exceso (pocos segundos), drene el exceso de agua, y suavemente seque mediante toalla de papel. Llene el frotis (o cúbralo), con una solución de lodine por un minuto. Lave en agua corriente por pocos segundos, séquelo. Decolore con solvente (alcohol - etílico), por 30 segundos, seque (si el descolorizador es utilizado por mayor tiempo, la bacteria Gram (+) puede perder color). Lave con agua corriente por 2 segundos. Coloque la solución de safranina por 10 segundos. y- Lave rápidamente en agua corriente, seque y observe.

Tinción con rojo congo: Coloque una gota de rojo congo en una lámina portaobjetos, con su asa de platino, coloque la suspensión bacteriana (48 horas de crecimiento), y mézclela con rojo congo, haga un frotis y deje secar al aire, una vez seco el frotis agregue unas gotas de alcohol ácido (3 gotas) de tal manera que cubra bien el frotis, deje secar al aire. Agregue una gota de aceite de inmersión y observe al microscopio con aumento de 1 00 x (lente de inmersión). KOH al 3%: coloque en el portaobjetos una gota de KOH al 3%, tome de su preparado bacteriano (caja de cultivo, 48 horas de crecimiento) con su ansa de platino, una pequeña porción de bacteria y mézclela bien, tome un palillo o una aguja de disección, introdúzcala en la preparación y trate de suspenderla, si se forma una suspensión mucoide, que se suspende 0,95 cm del portaobjeto, se está en presencia de una bacteria Gram (-), si no se forma esto, se está en presencia de una bacteria Gram (+) Pruebas de Patogenicidad: Antes de realizar las pruebas bioquímicas o paralelamente a las mismas, debemos tener la seguridad de que estamos trabajando con un patógeno de plantas, para lo cual las pruebas de patogenicidad y el reaislamiento nuevamente de las colonias bacterianas es una necesidad. Antes de entrar en materia debemos recordar que las bacterias a diferencia de numerosos hongos no secretan sustancias que disuelven la cutícula de la planta, no emiten haustorios u otros. Las bacterias sólo pueden penetrar en forma pasiva, algunas lo hacen a través de aperturas naturales como estomas, hidátodos y lenticelas, otras a través de heridas o daños sufridos por la planta. Las bacterias no penetran la pared celular o crecen dentro de las células de la planta hospedante, ellas crecen en los espacios intercelulares o en los sistemas vasculares. Tipos de Inoculación: Para conocer si nuestra bacteria es patogénica, pueden realizarse diferentes tipos de inoculación, aspersión de la bacteria sospechosa es un método muy usado y efectivo, con aquellas enfermedades bacterianas que producen manchas, ya que por lo general éstas son bacterias que penetran por las aperturas naturales, como lo es el caso de la Xanthomonas y muchas

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Pseudomonas, pero es una metodología poco eficaz en el caso de bacterias que penetran por heridas y provocan pudriciones, aquí deberá emplearse cualquier metodología que involucro heridas, pinchado con la bacteria, inyección, heridas cortantes con material embebido en la bacteria, macerado con carborudum y la bacteria en suspensión y luego frotamiento de las hojas, en fin existen muchas posibilidades. En nuestro laboratorio combinaremos: aspersión y heridas a las hojas con alfileres, cubriendo de este modo todos los patógenos posibles. La planta a usar: Deben estar en estado de crecimiento, jóvenes, con buen follaje y deben eliminarse cualquiera que presente anomalías, síntomas de deficiencia, etc., deben ser regadas y abonadas regularmente. Preparación del inoculo: El inóculo debe provenir de cultivos puros con 24 - 48 horas de crecimiento, con una concentración 103 - 105 cél/ml para aspersión y de cerca de 106 cél/ml cuando es inyección, se disuelve en agua destilada, o en solución buffer fosfato con pH 7.0, debemos tener en cuenta que concentraciones muy elevadas de inóculo causan síntomas atípicos, por lo general necrosis seca alrededor del sitio de inyección, los síntomas típicos bacterianos son por lo general en su etapa inicial acuosos (water soaking), esos síntomas atípicos se presentan como una respuesta de defensa de la planta, y pueden confundir al investigador, Al principio nuestro interés es de que las plantas se enfermen, para conocer si nuestra bacteria es patogénica, pero luego nos interesa repetir exactamente los síntomas producidos en condiciones de campo. Post - Tratamiento: Mantendremos las plantas por un período de 24 - 48 horas en cámara húmeda (100%) después de la inoculación, para asegurar las mejores condiciones a la penetración de las bacterias. Aspersión: Existen numerosos aparatos que pueden ser utilizados, desde una bombita de barbero, hasta un atomizador de alta presión, en pruebas de campo asperjadoras cumplen un buen trabajo y es recomendable la inoculación en la tarde (6 pm) para darle a las plantas al menos 12 horas de mayor humedad, una inoculación en el campo en la mañana (8 am) seguida de unas 10 horas de sol continúa está condenada al fracaso. Observación de las plantas: Las plantas deben ser observadas diariamente por un tiempo de 14 días, en los cuales se comparan con los controles, plantas inoculadas solo con agua, o con un contaminante bacteriano. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA AGRIOS, G. 1978. Plant Pathology. 2 ed. Academic Press. New York. 703 p. JAUCH, C. 1985. Patología Vegetal. 3 de. El Ateneo. Buenos Aires. 320 p.

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Manual de Laboratorio Diagnóstico de Hongos, bacterias y nemátodos fitopatógenos. 1991. Ministerio de Agricultura, pesca y alimentación. Dirección general de Sanidad de la Producción Agraria. Madrid. 485 p. Manual para Patólogos Vegetales. 1985. Common Wealth Mycological Institute. England. 438 p. Kew Surrey

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