A1 - Vt1 Aplicaciones de Biosensores en La Industria Agroalimentaria

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Vctor Gonzlez Rumayor Esther Garca Iglesias Olga Ruiz Galn Lara Gago Cabezas
aplicaciones de biosensores en la industria agroalimentaria
informe de vigilancia tecnolgica
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aplicaciones d e b i o s e n s o re s en la industria a g ro a l i m e n t a r i a
www.madrimasd.org
CONFEDERACIN EMPRESARIAL DE MADRID - CEOE
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Vctor Gonzlez Rumayor Esther Garca Iglesias Olga Ruiz Galn Lara Gago Cabezas
informe de vigilancia tecnolgica
aplicaciones d e b i o s e n s o re s en la industria a g ro a l i m e n t a r i a
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Coleccin coordinada por:
Fundacin para el conocimiento madri+d CEIM
Este informe de Vigilancia Tecnolgica se ha realizado dentro del marco del Contrato Programa suscrito entre la Direccin General de Universidades e Investigacin de la Comunidad de Madrid y la Universidad Complutense de Madrid, con la colaboracin de Parque Cientfico de Madrid que gestiona el Crculo de Innovacin en Agroalimentacin, perteneciente al sistema de Promocin Regional de la Innovacin madri+d. Los autores agradecen los consejos y la correccin del manuscrito original a: Dr. Jos Manuel Pingarrn Carrazn
Catedrtico de Qumica Analtica (UCM)
Dra. Elena Domnguez Caas

Catedrtica de Qumica Analtica (UAH)
Dr. Fernando Martn Gordillo

Director de InterAXN
As como la colaboracin de la Dra. Encarnacin Lorenzo Abad (Catedrtica de Qumica Analtica. UAM) Todos los derechos estn reservados. Se autoriza la reproduccin total o parcial de este infome con fines educacionales, divulgativos y no comerciales citando la fuente. La reproduccin para otros fines est expresamente prohibida sin el permiso de los propietarios del copyright.
De los textos: Los autores. De la coleccin vt y de la presente edicin:
CEIM Direccin General de Universidades e Investigacin

Diseo: estudio de diseo fj martnez Ilustraciones: Pilar Snchez Jorreto y Jorge Espejo Ruiz Impresin: Elec Industria Grfica Depsito Legal: M-2213-2005 Fecha: Enero 2005
5 9 13
PRESENTACIN CAPTULO 1
Resumen ejecutivo
CAPTULO 2
Introduccin
2.1 2.2
Clasificacin de los biosensores (PG. 16) Caractersticas de los biosensores (PG. 17)
19
CAPTULO 3
Tecnologas de los biosensores

3.1 3.2 3.3
Tipo de interaccin (PG. 20) Tcnicas de inmovilizacin (PG. 30) Sistema de transduccin (PG. 31)
41
CAPTULO 4
Aplicaciones de los biosensores en agroalimentacin

4.1 4.2 4.3 4.4
Seguridad alimentaria (PG. 43) Calidad alimentaria (PG. 52) Control de procesos (PG. 55) Otras aplicaciones (PG. 57)
nd ic e
59
CAPTULO 5
Retos y tendencias en tecnologas de biosensores

5.1. 5.2 5.3 5.4 5.5
Miniaturizacin (PG. 61) Regeneracin (PG. 62) Multi-anlisis (PG. 63) Molculas biomimticas (PG. 64) Nuevas tcnicas de inmovilizacin
(PG. 65)
69 77 87 93
CAPTULO 6
Aspectos de mercado
CAPTULO 7
Casos prcticos
CAPTULO 8
Resumen y conclusiones
CAPTULO 9
Anexos
Anexo 1 Anexo 2 Anexo 3
Patentes (PG. 94) Grupos de Investigacin (PG. 96) Proyectos de Investigacin (PG. 104)
113 118 119
CAPTULO 10
Referencias Lista de abreviaturas Glosario
PRESENTACIN
La Vigilancia Tecnolgica incluye una serie de procedimientos, no siempre sencillos de establecer, que tienen por objeto definir mediante el anlisis de informacin estratgica, el escenario tecnolgico en el que han de competir las empresas (y por agregacin, los sectores) en el futuro ms prximo, pudiendo con ello adelantarse a los cambios y mantenerse en una posicin competitiva en el mercado globalizado.
en la industria agroalimentaria
Es en estos aspectos en los que las Organizaciones Empresariales cobran una especial relevancia, en tanto que tienen la capacidad de definir las necesidades de informacin de empresas y sectores y establecer los objetivos de anlisis con los expertos, de forma que la informacin aportada cumpla con las expectativas empresariales. El anlisis de Vigilancia Tecnolgica, por su propia naturaleza, ha de llevarse a cabo desde muy diversos puntos de vista, englobados en el ms amplio concepto de la inteligencia competitiva: tecnolgicos, de proteccin de la propiedad intelectual e industrial, legislativo, de sostenibilidad, de mercado...., lo que requiere la participacin de expertos en cada una de estas reas, expertos no siempre accesibles a las empresas o a las asociaciones al trabajar en diferentes instituciones tanto de la Comunidad de Madrid como del resto de Espaa. El Sistema Regional de Innovacin madri+d, del que CEIM forma parte y que est coordinado y financiado por la Direccin General de Universidades e Investigacin tiene una especial vocacin de prestar servicios de valor aadido, entre ellos el de Vigilancia Tecnolgica, a las empresas y a las asociaciones empresariales, utilizando en red los
vt aplicaciones de biosensores
importantes recursos cientficos y tecnolgicos de la Comunidad de Madrid y entre los que se encuentran la coordinacin de expertos en los campos de conocimiento que se integran en la Vigilancia Tecnolgica La capacidad de las organizaciones empresariales para definir las necesidades e informacin tecnolgica de sectores y empresas, y la del Sistema madri+d para satisfacerlas ha llevado a definir esta nueva Coleccin de Informes de Vigilancia Tecnolgica, que se inicia con un estudio sobre la aplicacin de los biosensores a la industria agroalimentaria, tecnologa ampliamente utilizada en otros sectores tecnolgicamente avanzados como el farmacutico o el de medio ambiente, pero todava con escasa penetracin en el sector agroalimentario, estratgico en la Comunidad de Madrid. En el desarrollo de la Coleccin se prev una estrecha cooperacin entre los expertos en Vigilancia Tecnolgica y las empresas y asociaciones empresariales para definir los campos de anlisis de mayor inters estratgico, por lo que esperamos que esta Coleccin que ahora se inicia sea til para los sectores empresariales y para fortalecer los puentes de colaboracin entre la universidad y los centros de investigacin y el sector empresarial, tan necesaria para mantener la competitividad de la Comunidad de Madrid.
Gerardo Daz Ferrn Presidente de CEIM
PRESENTACIN
CAPTULO 1
Resumen ejecutivo
La industria productora de alimentos y bebidas en la Unin Europea (an antes de la ampliacin) est valorada en casi 600.000 millones de euros, un 15% de la produccin total, ocupando a un total de 2,6 millones de empleados y siendo el segundo sector industrial ms importante. La comparacin con el resto del mundo indica que la UE es el mayor productor de productos alimenticios y bebidas. Por otra parte el sector agrcola tiene una produccin anual de 220.000 millones de euros y ocupa a 7,5 millones de personas. Dentro de este entorno Espaa ocupa un lugar destacado por detrs de Francia, Alemania y Reino Unido. (1) La industria agroalimentaria espaola ha alcanzado un elevado grado de madurez y modernizacin adaptndose a los continuos cambios del entorno y a los hbitos de consumo. De esta forma ha llegado a convertirse en el primer sector industrial del pas y en un componente altamente estratgico de la industria espaola. En el ao 2000 existan en el pas un total de 33.342 industrias agroalimentarias lo que supone un 14% del total de empresas industriales, ocupando a 381.000 empleados (14% de los trabajadores de la industria), con unas ventas de 55.704 millones de euros (16% del total). (2) La innovacin y el desarrollo de la industria agroalimentaria pasan de forma genrica por dos ejes fundamentales: la seguridad y la calidad de los alimentos. La cada vez mayor complejidad de la cadena alimentaria exige, por otra parte, el desarrollo de eficaces sistemas de trazabilidad que aseguren la solidez de todos los eslabones. El Libro Blanco sobre Seguridad Alimentaria recoge esta necesidad enunciando que los consumidores deberan poder acceder a una amplia gama de productos seguros y de elevada calidad procedentes de todos los estados miembros. (3) Tanto el VI Programa Marco de la UE a travs de su Prioridad temtica de Calidad y Seguridad de los alimentos, como el Plan Nacional de Ciencia y Tecnologa 2004-2007 a travs de sus programas nacionales de Biotecnologa y Recursos y Tecnologas Agroalimentarias, recogen la necesidad de desarrollar e implantar sistemas de control encaminados a aumentar la seguridad y la calidad de los alimentos y a mejorar los sistemas de trazabilidad. En ambos casos se define la prioridad de desarrollar mtodos moleculares de deteccin, anlisis y diagnstico que sean rpidos, de alta sensibilidad y que permitan rastreos automatizados para un amplio espectro de agentes que amenazan la inocuidad de los alimentos. Por su parte, el borrador del IV PRICIT de la Comunidad de Madrid recoge esta misma preocupacin mediante la definicin de lneas de investigacin prioritarias de similares caractersticas en las reas de Biotecnologa y Tecnologas Agroalimentarias. (4) La tecnologa de biosensores, o quiz ms correcto, las tecnologas de biosensores han experimentado un notable avance en los ltimos aos, debido fundamentalmente al desarrollo de dispositivos aplicados al rea de biomedicina, que en el ao 1996 representaba el 92% (90% slo para deteccin de glucosa en sangre) del total del
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mercado. Estas tecnologas en avanzado estado de madurez han ido transfirindose paulatinamente de forma horizontal a otros sectores como el medioambiental, y de forma ms incipiente al agroalimentario. En el momento actual los biosensores suponen potentes herramientas de anlisis con numerosas aplicaciones a la industria agroalimentaria, apoyndose en los instrumentos de la biotecnologa y en los resultados de la investigacin postgenmica. Las caractersticas ms destacables de estos dispositivos que los convierten en opciones altamente atractivas para competir en el mercado agroalimentario con otras tecnologas son: su especificidad, su alta sensibilidad, su corto tiempo de anlisis, su capacidad de inclusin en sistemas integrados, su facilidad de automatizacin, su capacidad de trabajar en tiempo real, su versatilidad que permite el diseo de dispositivos a la carta, y su bajo coste, entre otras. A lo largo del informe se describen las caractersticas tcnicas de los diferentes dispositivos disponibles en el mercado o de inminente aparicin, analizando las ventajas e inconvenientes de cada dispositivo en las diferentes aplicaciones. Se describen tres grandes reas de aplicacin: seguridad alimentaria, calidad alimentaria y control de procesos. Se analizan, adems los retos y las tendencias de las tecnologas de biosensores y sus implicaciones y posibles aplicaciones a la industria agroalimentaria. Por otra parte se pretende evaluar el potencial cientfico-tecnolgico a travs del mapa de los grupos de investigacin de la Comunidad de Madrid y del anlisis de los proyectos de investigacin europeos del V Programa Marco y del Plan Nacional de Ciencia y Tecnologa 2000-2003, as como de las patentes ms relevantes. Como resultado de este anlisis se infiere que la Comunidad de Madrid presenta un enorme potencial cientfico e investigador en el rea de biosensores, con grupos de investigacin enormemente competitivos que ya se encuentran trabajando en el sector agroalimentario. Por ltimo se analizan los motivos del desfase existente entre el alto grado de desarrollo cientfico y tecnolgico, y la todava escasa penetracin de estos dispositivos en la industria agroalimentaria. Estas barreras no son de carcter tecnolgico y responden, en trminos generales, a las caractersticas estructurales del propio sector y a factores del entorno. Este informe pretende, en fin, acercar a la industria agroalimentaria los ltimos avances cientficos y desarrollos tecnolgicos en materia de biosensores, con el objetivo de facilitar su incorporacin a los procesos productivos e involucrar a la propia industria en el diseo y desarrollo de nuevas aplicaciones.
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CAPTULO 1 Resumen ejecutivo
CAPTULO 2
Introduccin
Un biosensor se define como un dispositivo compacto de anlisis que incorpora un elemento de reconocimiento biolgico (cido nucleico, enzima, anticuerpo, receptor, tejido, clula) o biomimtico (PIMs, aptmeros, PNAs) asociado a un sistema de transduccin que permite procesar la seal producida por la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito.
El principio de deteccin de un biosensor se basa en la interaccin especfica entre el compuesto o microorganismo de inters y el elemento de reconocimiento. Como resultado de esta unin se produce la variacin de una o varias propiedades fsico-qumicas (pH, transferencia de electrones, de calor, cambio de potencial, de masa, variacin de las propiedades pticas, etc) que detecta el transductor. Este sistema transforma la respuesta del elemento de reconocimiento en una seal electrnica indicativa de la presencia del analito sometido a estudio o proporcional a su concentracin en la muestra. (5) El trmino biosensor aparece en la literatura cientfica a finales de los aos 70, aunque el concepto bsico e incluso la comercializacin comenz antes. El primer biosensor fue un analizador de glucosa desarrollado por Clark y Lyons en 1962 y comercializado a partir de 1975 por Yellow Springs Instrument Company. Este biosensor se denomin enzyme electrode y consista en una enzima glucosa oxidasa acoplada a un electrodo para oxgeno. La enzima oxida la glucosa y como consecuencia se produce un descenso proporcional de la concentracin de oxgeno en la muestra, que es detectado por el electrodo. En los aos siguientes se desarrollaron electrodos enzimticos para distintas sustancias de inters clnico mediante la unin de enzimas apropiadas a sensores electroqumicos. El trmino biosensor comenz a utilizarse a partir de 1977 cuando se desarroll el primer dispositivo utilizando microorganismos vivos inmovilizados en la superficie de un electrodo sensible a amonio. Este dispositivo se utilizaba para detectar el aminocido arginina y sus creadores lo denominaron sensor bio-selectivo. Posteriormente para acortar, se denomin biosensor y este trmino ha permanecido desde entonces para designar la unin entre un material biolgico y un transductor fsico. A partir de ese momento el diseo y las aplicaciones de los biosensores en distintos campos de la qumica analtica ha continuado creciendo. El desarrollo de los biosensores desde entonces ha estado centrado principalmente en el campo del diagnstico clnico (con un gran xito de los biosensores para glucosa) y
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existe un inters ms reciente en los campos medioambiental, qumico, farmacutico y militar. En el campo agroalimentario, que es del que nos ocuparemos en este informe, su inters se centra en el anlisis de la composicin de los alimentos, en la seguridad alimentaria (deteccin de compuestos contaminantes, alrgenos, antinutrientes, toxinas y microorganismos patgenos) y en el control de procesos on line. El nmero de publicaciones cientficas, revisiones y patentes sobre biosensores desarrollados en los ltimos aos es muy elevado, lo que refleja el gran inters que despierta este tema en la comunidad cientfica. A pesar de este inters, la salida de estos dispositivos del laboratorio al mercado agroalimentario ha sido lenta (5), salvo algunas excepciones, debido a una serie de obstculos relacionados principalmente con las caractersticas del propio mercado (legislacin, inercia metodolgica, capacidad de absorcin, etc). El desarrollo de las diferentes tecnologas implicadas en el diseo y construccin de biosensores ha permitido en los ltimos aos solventar las dificultades tcnicas que inicialmente presentaban estos dispositivos para su aplicacin en la industria agroalimentaria. La diversidad de dispositivos ensayados en la actualidad, con diferentes combinaciones entre los distintos elementos que los componen, permite un diseo a la carta de los biosensores que cubre, desde el punto de vista tcnico, la prctica totalidad de las necesidades.
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CAPTULO 2 Intrtoduccin
FIGURA 1. Funcionamiento general de biosensores. En una muestra compleja, el elemento de reconocimiento biolgico es capaz de discriminar entre los distintos componentes de la misma e interaccionar con el compuesto a analizar. Una vez producida la interaccin se dispara una seal que es conducida por el transductor. La seal as transmitida es convenientemente registrada y almacenada para su tratamiento posterior.
Elemento de reconocimiento
Analito
Otros componentes de la muestra
2.1
Clasificacin de Biosensores
Como indica la siguiente tabla estos dispositivos pueden clasificarse en funcin de: el tipo de interaccin que se establece entre el elemento de reconocimiento y el analito; el mtodo utilizado para detectar dicha interaccin; la naturaleza del elemento de reconocimiento; o del sistema de transduccin.
TABLA 1. Criterios de clasificacin de los biosensores
Tipo de interaccin Biocataltica. Bioafinidad. Elemento de reconocimiento Enzima. Orgnulo, tejido o clula completa. Receptor biolgico. Anticuerpo. cidos nucleicos. PIM, PNA, aptmero.
Deteccin de la interaccin Directa. Indirecta. Sistema de transduccin Electroqumico. ptico. Piezoelctrico. Termomtrico. Nanomecnico.
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Existen mltiples elementos de reconocimiento y sistemas de transduccin. Tericamente estos componentes admiten diversas combinaciones. En la prctica, la eleccin del material biolgico/biomimtico depende de las caractersticas del compuesto a analizar. Por ejemplo, cuando se trata de detectar una sustancia alrgena se utilizan anticuerpos. La eleccin del transductor est condicionada por el tipo de elemento de reconocimiento elegido, ya que ste determina cul ser la variacin en las propiedades fsico-qumicas que ocurra como consecuencia de la interaccin.
2.2
Caractersticas de Biosensores
En las mltiples aplicaciones de los biosensores dentro de la industria agroalimentaria es deseable que estos dispositivos cuenten con las siguientes caractersticas: Alta sensibilidad para el anlisis de ciertos analitos -como por ejemplo, muchos compuestos xenobiticos- con efectos txicos sobre la salud humana y animal incluso a concentraciones de partes por billn (mg/l). Existen unidades capaces de detectar cantidades inferiores a los lmites exigidos por la ley en el caso de residuos de plaguicidas. (5) Alta selectividad para que el dispositivo interaccione exclusivamente con el compuesto de inters y no con otros de propiedades similares. Se consigue mediante elementos de reconocimiento muy especficos. A pesar de ello, se conocen algunas excepciones de biosensores que sufren interferencias con sustancias de la misma familia que el analito o bien con componentes del alimento. Alta fiabilidad. Los sistemas de transduccin se disean de manera que no puedan ser alterados (o lo sean mnimamente) por la muestra y no tengan problemas de ruidos. Tiempo de vida largo que no obligue al empleo del dispositivo tras un corto perodo desde su fabricacin ni a sustituciones frecuentes del mismo si est integrado en la lnea de produccin de una industria. La estabilidad qumica, fsica y mecnica del elemento de reconocimiento condiciona su duracin. Los componentes biolgicos por su propia naturaleza cuentan con una vida media limitada pero las nuevas alternativas basadas en molculas biomimticas no presentan este inconveniente. Bajo coste de produccin. En general, estos sistemas pueden fabricarse a escala industrial, lo cual redundara en un ms que considerable abaratamiento de los costes de produccin. A pesar de ello, la disponibilidad limitada de algunas enzimas y la existencia de fases crticas en su construccin (procesos de inmovilizacin) dificultan, en algunos casos, la fabricacin de biosensores en masa. Tiempo de anlisis corto que posibilite una actuacin rpida, por ejemplo, la retirada de materias primas o productos contaminados o deteriorados antes de su uso o venta o la intervencin para corregir algn parmetro en un proceso industrial. Muchos biosensores consumen pocos minutos en cuantificar el compuesto de inters y no precisan un perodo de espera largo hasta el siguiente anlisis.
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CAPTULO 2 Intrtoduccin
Pretratamiento de la muestra innecesario lo que supone un ahorro de tiempo, materiales y reactivos. Aunque en la mayora de las ocasiones esto es as, en ciertas determinaciones son imprescindibles las etapas de concentracin y purificacin. stas permiten eliminar interferencias y asegurar la presencia de una cantidad suficiente del analito en el pequeo volumen utilizado (deteccin de microorganismos patgenos). Manejo sencillo. Esta tecnologa no requiere personal cualificado. Capaces de realizar anlisis en tiempo real. Esta caracterstica es especialmente interesante en el control de procesos, ya que permite controlar los parmetros deseados de forma inmediata y automtica.
Porttiles para que sea posible realizar anlisis in situ. Automatizables. Prescindir del control manual de estas unidades facilita su integracin dentro de los sistemas que monitorizan los procesos industriales. Miniaturizables. Gracias a los desarrollos en microelectrnica y nanotecnologa se han logrado reducir las dimensiones de estos dispositivos. As pueden ensamblarse varios de ellos en un mismo sistema que realiza varias tareas a la vez y son aplicables a ensayos donde el tamao fsico del dispositivo, el volumen de la muestra o la localizacin de la medida son factores limitantes. Pocos requerimientos operativos y de almacenamiento que faciliten su empleo y no supongan un coste adicional. Los biosensores que incorporan molculas biomimticas suelen presentar estas caractersticas. En el resto de dispositivos, los componentes biolgicos pueden necesitar condiciones controladas (pH, temperatura) para su uso y conservacin debido a su baja estabilidad. Con capacidad multi-anlisis. Ciertos biosensores llevan a cabo la determinacin de diferentes analitos de forma simultnea. Existe una amplia variedad de biosensores distintos y no todos poseen cada una de las caractersticas citadas anteriormente. La combinacin de varias de ellas podra situar a muchos de estos dispositivos en una posicin ventajosa frente a las tcnicas de anlisis convencionales (cromatografa, espectrometra, etc). Adems, permiten que sean aplicables a la monitorizacin en tiempo real de procesos industriales. (6) (7)
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CAPTULO 3
Tecnologas de Biosensores
3.1
Tipo de Interaccin
3.1.1 Sensores Biocatalticos

Son los biosensores mejor conocidos y los ms aplicados. Se basan en la utilizacin de biocatalizadores, que son elementos que favorecen que ocurra una reaccin qumica en la cual a partir de uno o varios sustratos se forman uno o varios productos conocidos sin consumo del biocatalizador, que se regenera y puede ser utilizado de nuevo. Estos biocatalizadores pueden ser sistemas que contienen enzimas o sistemas multienzimticos aislados, orgnulos celulares, clulas completas o tejidos animales o vegetales en los que estos sistemas se encuentran en su medio natural (7). Pueden utilizarse para detectar la presencia de alguno de los sustratos que participan en la reaccin, mediante la deteccin de la desaparicin de algn cosustrato conocido distinto de aquel que se quiere detectar o bien por la aparicin de algn producto conocido. Existen sustancias txicas como insecticidas o herbicidas que inhiben la actividad de determinados sistemas enzimticos de manera selectiva, de modo que estos sistemas se utilizan para detectar su presencia. Si en presencia de los sustratos adecuados no se produce la aparicin de los productos correspondientes o sta ocurre en menor extensin de la esperada, significa que en la muestra existe una sustancia txica que inhibe la reaccin que favorece el biocatalizador. A continuacin se describen los elementos de reconocimiento de tipo biocataltico. Estos elementos de reconocimiento pueden acoplarse a distintos tipos de transductores como electroqumicos, pticos, termomtricos y acsticos.
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3.1.1.1 Enzimas
Las enzimas son protenas que catalizan reacciones qumicas en los seres vivos. En una reaccin catalizada por una enzima se produce una unin del sustrato en una regin concreta de la enzima denominada centro activo, que comprende un sitio de unin y un sitio cataltico. Una vez formados los productos la enzima se recupera pudiendo comenzar un nuevo ciclo de reaccin. En ocasiones puede ser necesaria la presencia de cofactores para que la enzima pueda regenerarse y estar activa de nuevo. La actividad enzimtica est controlada normalmente por el pH, la fuerza inica, la temperatura y la presencia de cofactores. La estabilidad de las enzimas es un factor limitante para el tiempo de vida de un biosensor de tipo enzimtico y se utilizan distintas tcnicas para aumentarla, como estabilizacin qumica y/o inmovilizacin.
En algunas ocasiones se utilizan cascadas multienzimticas, en las que la enzima que acta como elemento de reconocimiento no acta directamente sobre el analito, sino sobre algn producto derivado del mismo. Este sistema es muy utilizado en el caso de algunos azcares en los que se utilizan enzimas que actan sobre los productos de la hidrlisis de los mismos. Entre las enzimas disponibles comercialmente las ms utilizadas suelen ser las xidoreductasas. Son enzimas muy estables que catalizan fenmenos de oxidacin o reduccin utilizando oxgeno o cofactores. (7) Las enzimas pueden acoplarse a transductores de los tipos potenciomtrico, amperomtrico, optoelctrico, calorimtrico o piezoelctrico, y bsicamente todas funcionan por inmovilizacin de la enzima en el propio transductor. (7) Existen enzimas que no se pueden utilizar aisladas debido a que no son suficientemente estables o a que su purificacin es difcil o demasiado cara. En estas circunstancias pueden utilizarse orgnulos celulares, clulas completas o tejidos que contienen las enzimas en una forma natural en un medio ms estable. 21 VENTAJAS DE LAS ENZIMAS COMO ELEMENTO DE RECONOCIMIENTO
Las ventajas que presentan las enzimas para su utilizacin en biosensores son: Elevada selectividad. Respuesta rpida. Elevada variedad de enzimas disponibles. (8) Autorregenerables. Algunas resultan econmicas. Simplicidad de construccin de los dispositivos.
CAPTULO 3 Tecnologas de Biosensores
3.1.1.2 Clulas Completas

Pueden ser clulas bacterianas, fngicas, protozoos o clulas procedentes de organismos superiores y pueden ser viables o no viables. (7) En este caso en lugar de purificar las enzimas se utiliza como elemento biolgico una clula completa, que posee en su interior mltiples sistemas multienzimticos en su medio natural. Se pueden utilizar clulas modificadas genticamente que expresen enzimas determinadas que no se expresen normalmente o que posean una actividad mayor. Las clulas viables pueden metabolizar diversos compuestos orgnicos dando lugar a la aparicin de distintos productos como amonio, dixido de carbono o cidos que pueden
ser monitorizados mediante distintos transductores. Se pueden utilizar para detectar la presencia de compuestos relacionados con el crecimiento como vitaminas, azcares, cidos orgnicos o compuestos nitrogenados, o bien para detectar compuestos que inhiben la respiracin microbiana como contaminantes ambientales o sustancias txicas. (9) La mayor limitacin a la hora de utilizar clulas completas es la difusin de sustratos y productos a travs de la membrana celular, que da como resultado una respuesta ms lenta comparada con los sensores basados en enzimas. (9) Esta limitacin se puede paliar mediante la permeabilizacin de la membrana por medio de mtodos fsicos (congelacin y descongelacin), qumicos (detergentes) o enzimticos (lisozima, papana). Mediante estos tratamientos se forman poros en las membranas que permiten la difusin de molculas de pequeo tamao, reteniendo la mayor parte de los compuestos macromoleculares, como es el caso de las enzimas, dentro de la clula. Como consecuencia de estos tratamientos la clula deja de ser viable, pero puede servir como una fuente econmica de enzimas intracelulares. Se pueden utilizar para aplicaciones que no requieren regeneracin celular de cofactores o respiracin metablica, como es el caso de glucosa oxidasa, -galactosidasa, aminocido oxidasas, invertasas, etc. (9) Otra limitacin de las clulas completas, en comparacin con enzimas purificadas, es que tienen una menor especificidad debido a reacciones catalizadas por otras enzimas presentes en la clula. Una posible solucin para minimizar estas reacciones indeseables es permeabilizar la membrana de modo que los cofactores salgan al exterior de la clula. (9) Las clulas se pueden inmovilizar en membranas de acetato o celulosa, o atraparse en una matriz, como un gel de agar. (6)
22
3.1.1.3 Orgnulos Subcelulares

En ocasiones en lugar de utilizar clulas completas o sistemas multienzimticos aislados, pueden utilizarse orgnulos subcelulares, que contienen determinados sistemas enzimticos completos, pero no poseen todos aquellos que presenta una clula completa, como es el caso de cloroplastos completos, tilacoides o mitocondrias. (9) Mitocondrias y cloroplastos son orgnulos de doble membrana que poseen sistemas enzimticos relacionados con la obtencin de energa en la membrana interior. Determinados agentes txicos como plaguicidas, metales pesados o detergentes actan sobre estos sistemas enzimticos inhibindolos, de modo que estos orgnulos o sus
membranas internas pueden utilizarse como biosensores para detectar este tipo de compuestos. (9)
3.1.1.4 Tejidos
Existen determinados tejidos vegetales que debido a su funcin fisiolgica en el organismo son una fuente de determinadas enzimas o sistemas enzimticos. Pueden utilizarse distintos tejidos como hojas, races, frutas o semillas, en rodajas o bien en forma de homogeneizados. Suelen ir asociados a transductores electroqumicos. (10) Algunos ejemplos que aparecen en la literatura cientfica son la utilizacin de rodajas de patata (ricas en la enzima polifenol oxidasa) junto con electrodos de oxgeno para la determinacin de mono y polifenoles (9), o de homogeneizados del hongo Agaricus bisporus para la determinacin de alcohol. (11) La utilizacin de orgnulos, clulas completas o tejidos vegetales en biosensores posee varias ventajas e inconvenientes comparada con la utilizacin de enzimas o sistemas enzimticos aislados. 23
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE TEJIDOS COMO ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO

Ventajas Bajo coste. Evitan procesos de extraccin y purificacin de enzimas. No requieren la adicin de cofactores para la regeneracin enzimtica. Simplicidad de construccin. Elevada estabilidad. Vida til larga. Elevada actividad.
Inconvenientes Baja sensibilidad. Respuesta lenta. Limitada selectividad.
3.1.2 Sensores de Bioafinidad

Los sensores de bioafinidad se basan en la interaccin del analito de inters con el elemento de reconocimiento, sin que exista transformacin cataltica, sino que se produce una reaccin de equilibrio en la que se forma un complejo analito-receptor. (7)
Para medir la interaccin, ya que no existe consumo de sustratos ni generacin de productos, se suele utilizar un marcaje del receptor o bien de un elemento que compita con el analito por la unin al receptor, con una enzima que da una reaccin biocataltica complementaria que es la que se detecta por el sistema de transduccin. El inconveniente que plantea este tipo de sistema es que se requieren pasos posteriores de lavado y separacin del exceso de molculas marcadas y la adicin de sustratos para que ocurra la reaccin que cataliza la enzima que se usa como marcaje. (7) Puede utilizarse tambin un sistema de deteccin directa de la interaccin entre el receptor y el analito basndose en los cambios que se producen en la masa de la superficie, o bien por los cambios en las propiedades de la luz que se producen como consecuencia de esta unin.
Este tipo de interacciones presenta en ocasiones un rango de operacin de concentracin estrecho, debido a que se puede producir una saturacin del receptor y a menudo no permiten una monitorizacin continua de la concentracin del analito. El elemento de reconocimiento debe estar en contacto directo con la muestra y no se puede incorporar una membrana exterior para separar el elemento receptor de la matriz de la muestra, de modo que algunos de estos biosensores tienen dificultades para operar en matrices biolgicas complejas. Se pueden utilizar para la deteccin de material gentico de microorganismos, para detectar la presencia de patgenos o pesticidas o de cualquier tipo de sustancias que puedan causar una respuesta inmune (y por tanto permitir el desarrollo de anticuerpos).
24 Existen distintos tipos de receptores de bioafinidad como anticuerpos, lectinas, receptores, clulas completas, cidos nucleicos, PIMs, aptmeros y PNAs.
3.1.2.1 Anticuerpos
Un anticuerpo es una protena que se une de manera selectiva a una molcula complementaria denominada antgeno, que en este caso corresponde al analito. La mayor parte de los biosensores de bioafinidad se basan en reacciones de unin de antgenos a anticuerpos especficos. La deteccin de cada antgeno requiere la produccin de un anticuerpo particular, su aislamiento y en ocasiones su purificacin. Pueden utilizarse anticuerpos monoclonales o policlonales. Los anticuerpos policlonales son poblaciones complejas de anticuerpos formadas por distintos tipos de anticuerpos que reconocen diferentes regiones del antgeno, mientras que los monoclonales son molculas idnticas y poseen la misma especificidad. Los anticuerpos policlonales poseen mayor sensibilidad y menor
especificidad que los monoclonales, de modo que en funcin de qu caracterstica se quiera potenciar se elegirn unos u otros. La deteccin del complejo antgeno-anticuerpo se puede hacer directamente, aunque para aumentar la sensibilidad se suelen acoplar enzimas para el marcaje de los anticuerpos o los antgenos. (7) La especificidad y afinidad de la interaccin antgeno-anticuerpo determinan la selectividad y la sensibilidad del inmunosensor as como la posibilidad de regeneracin. En la prctica para alcanzar una sensibilidad adecuada se necesita que el complejo tenga una afinidad alta, siendo difcil su disociacin, por lo que suelen ser sistemas de un solo uso. No obstante, el anticuerpo puede regenerarse por disociacin de los complejos mediante la aplicacin de distintos agentes que cambian las condiciones del medio y favorecen esta disociacin, aunque estas condiciones suelen daar la estructura del anticuerpo. (8) Por ltimo, es necesario minimizar las uniones no especficas, para garantizar la especificidad de la deteccin del analito. 25
3.1.2.2 Receptores
En las membranas celulares existen distintos receptores moleculares y protenas de unin que pueden aislarse e inmovilizarse en diferentes superficies y utilizarse como elementos de reconocimiento asociados a diversos transductores.
Existen protenas transportadoras que forman canales que pueden acoplarse a membranas lipdicas sintetizadas de manera artificial. La unin del analito a estos receptores produce la formacin de canales a travs de los que se genera un flujo de iones que se puede monitorizar mediante distintos tipos de transductores como los electroqumicos, por lo que normalmente este tipo de receptores no necesitan que haya un marcaje enzimtico. Pueden utilizarse para determinar compuestos txicos que ejercen su accin en los organismos mediante la unin a dianas especficas como el caso de los ganglisidos que se utilizan como receptores para detectar la toxina colrica (17).
3.1.2.3 Clulas Completas

En las clulas existen distintos receptores moleculares de membrana que ante la unin de su ligando correspondiente disparan respuestas fisiolgicas amplificadas, como la apertura de canales inicos, la activacin de sistemas mensajeros
secundarios y la activacin de enzimas, que pueden ser monitorizados por distintos transductores. Determinados compuestos txicos ejercen su accin bloqueando los sistemas de seales asociados a estos receptores debido a que se unen a ellos de manera especfica e impiden la unin del ligando correspondiente, por lo que pueden usarse para detectar la presencia de estos compuestos. Por ejemplo las toxinas paralizantes de origen marino ejercen su accin toxica bloqueando canales de sodio, que son muy abundantes en las clulas que forman la membrana de la vejiga de rana, de modo que puede utilizarse este tejido para la fabricacin de biosensores. (13) Este tipo de receptores suelen tener afinidad por compuestos relacionados estructuralmente, lo cual resulta interesante para la deteccin multianalito. Pueden utilizarse clulas que expresen los receptores de manera natural o bien se pueden modificar genticamente para que expresen los receptores que interesan.
3.1.2.4 Lectinas
Las lectinas son un grupo de protenas que se unen de manera selectiva y reversible a distintos sacridos, como los oligosacridos que se encuentran en las paredes celulares bacterianas. Son molculas de reconocimiento fcilmente disponibles y econmicas que pueden asociarse a distintos transductores como transductores piezoelctricos o de resonancia de plasmones superficiales.
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3.1.2.5 cidos Nucleicos

Los biosensores para el anlisis de ADN se basan en el proceso de hibridacin, que es la unin de una cadena de ADN con su cadena complementaria. Estos biosensores, tambin conocidos como gene chips se usan para el reconocimiento y cuantificacin de ADNs diana en muestras de inters. La hibridacin puede hacerse en disolucin o en soportes slidos y una vez que se ha realizado se utilizan marcajes especficos que se unen a las secuencia hibridadas, como marcajes fluorescentes o enzimticos. Pueden acoplarse sistemas de transduccin pticos, gravimtricos o electroqumicos. (14) Algunos de estos chips son lo suficientemente sensibles como para eliminar la necesidad de amplificacin mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Este tipo de elementos de reconocimiento pueden utilizarse para la deteccin de organismos modificados genticamente y microorganismos patgenos.
3.1.2.6 Polmeros de Impresin Molecular

Los polmeros de impresin molecular o PIMs son matrices sintetizadas artificialmente que presentan, en teora, la capacidad de reconocer e interaccionar de forma especfica con determinados compuestos. Es decir, se trata de materiales biomimticos que reproducen de un modo ms bsico el mecanismo de reconocimiento de los sistemas biolgicos (hormona-receptor, enzima-sustrato, antgeno-anticuerpo). Idealmente, ste es el comportamiento que cabra esperar; sin embargo, en la prctica no sucede as debido a la existencia de interacciones de distinta naturaleza. Estos polmeros con memoria selectiva cuentan con una serie de caractersticas muy interesantes para las tecnologas de los biosensores. Su gran potencial como sustitutos de las estructuras de origen biolgico se ha materializado en el desarrollo de los primeros dispositivos que incorporan PIMs como elementos de reconocimiento, por ejemplo, para la deteccin de plaguicidas, frmacos o toxinas marinas. En el proceso de obtencin de los PIMs participan: El analito de inters que acta como molde o plantilla. Los monmeros funcionales que interaccionan con el analito y para cuya eleccin debe considerarse la naturaleza qumica del mismo (cida, bsica, ion metlico) y los monmeros de entrecruzamiento que contribuyen a estabilizar la estructura del polmero.
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Otros compuestos: iniciadores de la polimerizacin, disolventes para la fase de sntesis, disolventes para la extraccin del analito,... Los principales mecanismos de preparacin de los PIMs se dividen en covalentes y no covalentes. En el primer caso, las uniones que se establecen entre el analito o molcula molde y los monmeros funcionales son de carcter covalente. En cambio, en la ruta de sntesis no covalente las interacciones son de tipo enlace de hidrgeno, enlace de Van der Waals, interacciones electrostticas,... A partir de estas uniones los monmeros funcionales se organizan en torno al analito, polimerizan y junto con las unidades de entrecruzamiento generan una red tridimensional. Por ltimo, la molcula molde se extrae de esta matriz para dejar libres los puntos de reconocimiento mediante diversas tcnicas (reaccin de hidrlisis para la ruptura de enlaces covalentes o extraccin con disolventes en la va de preparacin no covalente). (15)
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS PIMs COMO ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO

Ventajas Sensibilidad y selectividad elevadas. Posibilidad de desarrollar PIMs destinados a muy diversos analitos incluyendo especies para las que an no se ha encontrado un elemento de reconocimiento biolgico. Especificidad predecible tericamente aunque, en la prctica, la existencia de interacciones de carcter no especfico hace difcil su determinacin. Produccin con un bajo coste a gran escala. Tiempo de vida largo: estabilidad qumica, trmica y mecnica altas. (16) Inconvenientes Tecnologa en desarrollo en el mbito de los biosensores. En general, las constantes de afinidad son bajas, es decir, que la tendencia del analito y del PIM a unirse es pequea. Esto implica mayores tiempos de anlisis. Requiere altas concentraciones de molcula molde. El procedimento de sntesis de los PIMs conlleva mltiples etapas y resulta laborioso. Adems hay prdidas de material til y se obtienen redes con una distribucin poco homognea de los puntos de unin. Dificultad para operar en medios acuosos porque no se produce el reconocimiento del analito. (17)
3.1.2.7 Aptmeros
Un aptmero es una secuencia de oligonucleticos (ADN o ARN) de cadena sencilla sintetizada artificialmente, capaz de reconocer diversas molculas diana con una afinidad y especificidad elevadas. 28 Estas molculas biomimticas se asemejan a los anticuerpos. Se pliegan en el espacio y adquieren una conformacin con determinadas regiones a las que puede unirse el analito. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS APTMEROS COMO ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO
Ventajas Mayor estabilidad en comparacin con los elementos biolgicos. Inmovilizacin sencilla sobre las superficies. Produccin a gran escala con un coste bajo. Inconvenientes Constantes de afinidad pequeas.
3.1.2.8 cidos Nucleicos Peptdicos

Los cidos nucleicos peptdicos o PNAs (en sus siglas inglesas) son otro tipo de molculas sintticas que mimetizan al ADN-ARN. De hecho, su estructura es muy similar
a la de estos cidos. Estn formados por un esqueleto de monmeros (N-2-aminoetilglicina) unidos por enlaces peptdicos con bases nitrogenadas pricas y pirimidnicas. A diferencia de los cidos nucleicos, los PNAs no contienen pentosas ni grupos fosfato. La principal ventaja de estas molculas biomimticas frente a sus anlogos naturales es su gran afinidad para establecer enlaces con cadenas de ADN. La falta de repulsin electrosttica entre ellas hace que dichos enlaces sean ms fuertes que los existentes entre dos hebras de ADN. Este elemento de reconocimiento se utiliza en la deteccin de microorganismos patgenos junto a transductores pticos de tipo SPR. (18) La tabla 2 recoge las principales ventajas e inconvenientes de los elementos de reconocimiento ms utilizados en biosensores, es decir, enzimas en el caso de los biosensores de tipo biocataltico, y anticuerpos en el caso de los biosensores de bioafinidad.
TABLA 2. Ventajas e inconvenientes de enzimas y anticuerpos como elementos de reconocimiento en biosensores ENZIMAS Ventajas Elevada sensibilidad. Respuesta rpida. Autorregenerables. Permiten monitorizacin continua. No requieren pasos de lavado. Gran variedad de enzimas disponibles. Permiten detectar txicos desconocidos que inhiben enzimas. Permiten amplificar seales. Diseo sencillo. Fcil construccin. Bajo coste. Manejo sencillo. Inconvenientes Sensibilidad frente a condiciones ambientales (pH, temperatura o fuerza inica). En ocasiones requieren presencia de cofactores. Pueden ser inhibidos por sustancias de la muestra. Tiempo de vida limitado.
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ANTICUERPOS Ventajas Elevadas sensibilidad y especificidad. Estabilidad qumica. Afinidad variable. Respuesta rpida. Bajo coste. Inconvenientes Difcil regeneracin. Requieren contacto directo con la muestra. En ocasiones requieren marcaje. No amplifican la seal. No existe consumo del analito por lo que se saturan (rango de operacin de concentracin estrecho). No permiten detectar sustancias desconocidas.
3.2
Tcnicas de Inmovilizacin
Una etapa clave en la construccin de un biosensor es la inmovilizacin del elemento de reconocimiento sobre una membrana o matriz, que a su vez se fija a la superficie del transductor. Este material de base puede actuar nicamente como soporte del componente biolgico o participar adems en la transmisin de la seal al sistema de transduccin (por ejemplo, mediante la inclusin de mediadores para las reacciones redox). Entre las tcnicas empleadas las ms comunes son la adsorcin fsica, el atrapamiento, el entrecruzamiento o reticulado (cross-linking) y la formacin de enlaces covalentes. La siguiente tabla resume las principales caractersticas de cada uno de ellos. La eleccin de uno u otro procedimiento depende de la naturaleza del elemento biolgico, el tipo de transductor, las propiedades fsico-qumicas del analito y las condiciones de trabajo del biosensor. (7)
TABLA 3.- Ventajas e incovenientes de las tcnicas de inmovilizacin ms comunes en la fabricacin de biosensores. (7) (9)
Tcnica de inmovilizacin Descripcin Matriz Ventajas Inconvenientes
Adsorcin fsica
Unin del ER* a la matriz mediante interacciones inicas, puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals. Retencin fsica del ER en las cavidades interiores de la matriz.
Celulosa. Gel de slice. Colgeno. Hidroxiapatita. Acetato.
Sencilla. Bajo coste. Matriz regenerable. Sin modificaciones en ER.
Unin dbil: prdida de ER por condiciones externas. Control estricto del proceso.
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Atrapamiento Geles: agar, nylon, almidn, poliacrilamida. Matrices electrdicas compositas rgidas: grafito-tefln o grafito-resina epoxi. Reactivos: Glutaraldehdo Hexametilen-diisocianato, 2,4dinitro-benceno. Sencilla. Bajo coste. Se necesita poca cantidad de ER. Sin modificaciones en ER. Proximidad entre ER y el transductor. Coste moderado. Estable en condiciones extremas. Mnima prdida de ER. Manipulacin sencilla. Estable en condiciones extremas. Unin dbil. Control estricto de la polimerizacin de la matriz. No regenerable.
Entrecruzamiento
Uniones irreversibles de los ER entre s mediante reactivos funcionales.
Tratamiento con sustancias qumicas txicas. No regenerable.
Enlaces covalentes Uniones covalentes del ER con grupos qumicos activados de la matriz o directamente del transductor.
Alteracin del ER (centro activo en enzimas). Inadecuado para ERs muy sensibles (pH, temperatura) No regenerable. Tratamiento con sustancias qumicas txicas. Coste elevado.
* ER: elemento de reconocimiento.
3.3
Sistema de Transduccin
El sistema de transduccin o transductor es el elemento que convierte las variaciones de las propiedades fsicas o qumicas que se producen por la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito en una seal que puede ser amplificada, almacenada y registrada. La seal generada por el transductor en algunos casos no puede ser interpretada directamente y es necesario la utilizacin de un software para su procesamiento. Existen varios tipos de transductores: electroqumicos, pticos, piezoelctricos (msicos, gravimtricos, acsticos), termomtricos y nanomecnicos. Dependiendo de la naturaleza de la interaccin entre el elemento de reconocimiento y la especie de inters se puede utilizar un tipo de transductor u otro. (20)
3.3.1 Transductor Electroqumico

Los transductores electroqumicos transforman la seal que se produce por la interaccin entre el sistema de reconocimiento y el analito a detectar en una seal elctrica. Proporcionan informacin analtica cuantitativa o semicuantitativa especfica. El elemento de reconocimiento biolgico y el elemento de transduccin deben estar en contacto. 31
FIGURA 3. Sensor electroqumico amperomtrico. La interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito provoca la conversin electroqumica de una especie redox que genera una corriente elctrica.
Se diferencian cuatro tipos de biosensores electroqumicos que son conductimtricos, potenciomtricos, amperomtricos e impedimtricos en funcin de si detectan cambios en la conductividad, en el potencial, en una corriente generada o en la impedancia.
En general se utilizan junto con elementos de reconocimiento biocatalticos ya que las reacciones enzimticas generan aparicin de sustancias electroactivas, cambios en el pH o en el potencial, etc.
TABLA 4. Tipos de transductores electroqumicos. (5) (6) (7) (21)
Transductor electroqumico
Tipo de medida
Ventajas
Inconvenientes
Conductmetro
Variacin de conductividad del medio. Diferencia de potencial elctrico. Simplicidad de operacin. Menor sensibilidad Pequeo tamao. que amperomtricos. Unin inespecfica a otros iones presentes en la muestra. Para muestras con gran cantidad de analito. Pequeos y robustos. Sensibles. Rpidos. Econmicos. Fcil para ensayos de campo. Pueden tener baja selectividad.
Potenciomtrico
Amperomtrico
Corriente generada por la reduccin u oxidacin de especies electroactivas.
Impedimtrico
Incremento de conductancia.
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Existe un tipo de sensores de reciente desarrollo consistente en una combinacin entre los sistemas de transduccin ptico y electroqumico denominados light-addressable potentiometric sensor (LAPS) (6). Estos sensores permiten detectar cambios de pH en las disoluciones, lo que se puede aplicar en la monitorizacin de algunas reacciones enzimticas o alteraciones celulares que producen variaciones en el pH del medio. Un LAPS es un sensor qumico cuya estructura consta de un electrolito, un aislante cuya superficie se encuentra en contacto con la muestra que debe ser una disolucin acuosa, y un semiconductor de silicio. El aislante se encuentra cargado en funcin del pH de la disolucin acuosa que baa el chip. Cuando se aplica una diferencia de potencial a esta estructura y se ilumina la parte posterior mediante un diodo, se produce una fotocorriente que depende del voltaje aplicado y de la carga de la superficie de la capa aislante. Si se produce un cambio en el pH del medio, el voltaje aplicado debe ser ajustado para que la fotocorriente permanezca constante. Este cambio de voltaje es proporcional al cambio de pH que se ha producido en el medio.
La fotocorriente slo se genera en zonas discretas, donde el sensor es iluminado por el diodo, de modo que podran medirse cambios locales con mltiples diodos lo que permitira la deteccin simultnea de mltiples analitos usando un solo sensor. Existe un LAPS disponible comercialmente que se denomina Threshold Immunoassay System y sirve para detectar bacterias y esporas. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS TRANSDUCTORES ELECTROQUMICOS
Ventajas Econmicos, posibilidad de produccin masiva. Fcil miniaturizacin. Respuesta rpida. Alta sensibilidad. Posibilidad de automatizacin. Aplicaciones en elevada variedad de muestras.
Inconvenientes Es necesaria la utilizacin de electrodos de referencia (excepto en los conductimtricos).
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3.3.2 Transductor ptico

Los transductores pticos se basan en la medicin de las variaciones que se producen en las propiedades de la luz como consecuencia de la interaccin fsica o qumica entre el analito a detectar y el elemento biolgico de reconocimiento del biosensor. Las bases fsicas de este tipo de sensores son los cambios que ocurren en absorcin, fluorescencia, luminiscencia, dispersin o ndice de refraccin, cuando la luz se refleja en las superficies de reconocimiento. El sistema bsico de medida consiste en una fuente de luz, el elemento sensor (donde se encontraran las molculas receptoras) y el detector. Se diferencian mtodos de deteccin directa, sin necesidad de marcaje y deteccin indirecta, en la que es necesario utilizar marcaje. (5) Este tipo de transductores pueden acoplarse a elementos de reconocimiento biocatalticos o de bioafinidad. Los transductores que tienen propiedades pticas son muy variados en funcin de las propiedades, incluyendo sensores de fibra ptica, sensores de resonancia de plasmones y sensores de onda evanescente.
3.3.2.1 Sensor de Fibra ptica

Tambin conocido como optodo u optrodo, consiste en una fibra ptica en uno de cuyos extremos se inmoviliza el elemento de reconocimiento, que puede ser de tipo
biocatalco o de bioafinidad y en el otro el elemento de deteccin (figura 4). Es necesaria la utilizacin de marcadores que pueden ser indicadores pticamente activos como colorantes sensibles al pH, a la concentracin de oxgeno o al perxido de hidrgeno, molculas fluorescentes y, en menor medida, molculas bio o quimioluminiscentes. Como consecuencia de la interaccin entre el analito y el elemento de reconocimiento se produce un cambio detectable en el marcador que se propaga por la fibra ptica hacia el detector. (7)
FIGURA 4.- Sensor de fibra ptica
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Existe otro tipo de transductores pticos que se basa en las interacciones que ocurren en la interfase entre una superficie en la que se encuentra el elemento de reconocimiento y la disolucin en la que se encuentra el analito. La superficie suele ser un prisma de cristal recubierto con una capa de oro o plata. Cuando esta interfase se ilumina con un rayo de luz, se producen cambios en el ngulo de resonancia. Se diferencian transductores de resonancia de plasmones superficiales y de resonancia de espejos.
3.3.2.2 Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR).

Los plasmones son oscilaciones colectivas de los electrones de conduccin de un metal. La resonancia de plasmones superficiales es un fenmeno ptico que ocurre cuando una luz polarizada se dirige desde una capa de mayor ndice de refraccin (un prisma) hacia una de menor ndice de refraccin, que en este caso es una capa metlica, de oro o de plata, que se sita entre el prisma y la muestra. La luz que incide en la interfase entre el metal y el prisma provoca la excitacin de un plasmn superficial para un determinado ngulo de incidencia de dicha luz, llamado ngulo de resonancia. El ngulo de resonancia depende fuertemente del ndice de refraccin del medio colindante a la lmina metlica, por lo que las variaciones que se produzcan en el mismo van a ser detectadas como cambios del ngulo de resonancia y este cambio es proporcional a la concentracin. La unin de los analitos al elemento de reconocimiento supone un cambio de ndice de refraccin sobre la superficie del metal y, como consecuencia, un desplazamiento del ngulo de resonancia. Esto permite
realizar medidas directas en tiempo real, sin marcaje, as como el anlisis de muestras complejas sin purificacin previa. (8) Puede utilizarse tambin con marcaje con molculas fluorescentes. Esto presenta como ventaja una mejora en la sensibilidad relativa por la reflexin total interna de fluorescencia. La instrumentacin que requiere este tipo de anlisis es un sensor, un detector de SPR, software para el control y tratamiento de datos y un sistema para introducir los reactivos y analitos en la superficie del sensor.
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FIGURA 5.- Biosensor de resonancia de plasmones superficiales. El ngulo de luz incidente que excita a los plasmones de superficie vara en funcin de la concentracin de analito que interacciona con el elemento de reconocimiento.
3.3.2.3 Resonancia de Espejos

Es una variacin de la SPR en la cual se utilizan filtros polarizados para bloquear la luz reflejada internamente. Un espejo de resonancia consiste en una capa de silicio de bajo ndice de refraccin tapizado con un material de alto ndice de refraccin. Esta estructura se utiliza en lugar de la capa de metal que se usa en la SPR. La luz que entra en la capa de silicio con un ngulo de incidencia (ngulo de resonancia), va hacia la capa con elevado ndice de refraccin y sufre una serie de reflexiones que producen un campo evanescente, que penetra en la muestra. Cambios en el ndice de refraccin en la superficie debidos a la interaccin entre el analito y el elemento de reconocimiento
producen cambios en el ngulo de resonancia que se pueden detectar y relacionar con la concentracin de analito. Las reflexiones que se producen incrementan la sensibilidad del mtodo con respecto a la SPR pudiendo llegar a ser 10 veces ms sensible. (8)
3.3.2.4 Onda Evanescente (Ew)

Se basa en un fenmeno conocido como reflexin interna total de fluorescencia, que consiste en la absorcin y emisin de fotones. En este sensor una radiacin que viaja a travs de una gua de ondas por reflexin interna total crea un campo electromagntico denominado campo evanescente, que puede penetrar una determinada distancia desde la superficie dependiendo del ngulo de incidencia en la interfase y la longitud de onda de la radiacin de excitacin. Cualquier interaccin molecular que se produzca en este campo (como la unin de un analito a un receptor inmovilizado en la superficie de la gua de ondas) produce cambios en las caractersticas de la luz que se propaga por la gua de ondas que pueden medirse y relacionarse con la concentracin de analito. Es necesario utilizar marcaje con molculas con propiedades fluorescentes. Permite una deteccin directa, rpida y selectiva del analito. (6) Existe otro tipo de transductores basados en la onda evanescente que son los interfermetros Mach-Zender. En estos sensores la propagacin de la radiacin se divide en dos ramas, una de las cuales contiene el elemento de reconocimiento y la otra acta como referencia. Estas ramas tras recorrer una cierta distancia vuelven a unirse. La interaccin entre el analito y el elemento de reconocimiento produce cambios en el campo evanescente que dependern de la concentracin de analito en el medio. (22) 36
TABLA 5. Caractersticas de los distintos transductores pticos
Transductor Ventajas Inconvenientes
Optrodos (Fibra ptica)
Flexibilidad. Bajo coste. Anlisis in situ remoto. Anlisis en tiempo real. Fcil miniaturizacin. Fciles de usar. Deteccin directa. Deteccin en tiempo real. Elevada sensibilidad. Muestras sin purificar.
Requiere marcaje. Seal proporcional a la cantidad de analito. Vida limitada del componente biolgico.
(SPR) Resonancia de plasmones superficiales (SPR) Resonancia Mayor sensibilidad de espejos que SPR. Onda evanescente (EW) Detecin directa, rpida y selectiva del analito.
Sensibles a temperatura. Ineficaz para diluidos (requiere preenriquecimiento). Ineficaz para pequeo tamao. Elevado coste. (21) Elevado coste. (21)
Requiere marcaje.
3.3.3 Transductor Piezoelctrico

Los sistemas de transduccin piezoelctricos, msicos, gravimtricos o acsticos miden cambios directos de masa inducidos por la formacin del complejo antgeno-anticuerpo. Los materiales que se utilizan para el diseo de este tipo de biosensores son materiales piezoelctricos, que son aquellos que entran en resonancia por la aplicacin de un campo elctrico alterno externo. Estos cristales se recubren con el elemento de reconocimiento que suele ser de bioafinidad (anticuerpos, lectinas, etc) y se ponen en contacto con la muestra que contiene el analito que se desea detectar (14). La frecuencia de oscilacin viene determinada por la masa del cristal, que vara cuando se produce la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito y da lugar a una variacin en la frecuencia de oscilacin.
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FIGURA 6. Biosensor piezoelctrico. Como consecuencia de la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito se produce un cambio en la frecuencia de resonancia del cristal.
Se diferencian dos tipos principales: Bulk acoustic wave (BW), tambin denominados quartz crystal microbalance (QCM) o thickness slear mode. La resonancia ocurre en toda la masa del cristal. Surface acustic wave (SAW). Ondas acsticas de superficie. La resonancia ocurre slo en la superficie del cristal.
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS BIOSENSORES PIEZOELCTRICOS.

Ventajas (21) Deteccin directa (sin marcaje) en tiempo real de la reaccin de unin. Anlisis on-line. Permite varios formatos de inmunoensayo. Fciles de usar. Bajo coste. (5) Inconvenientes (21) (14) Falta de selectividad. Tiempos de incubacin relativamente largos. Problemas con la regeneracin de la superficie del cristal. Nmero de pasos de lavado y secado elevado. Puede haber dificultades para recubrir los cristales al inmovilizar el elemento de reconocimiento. Es necesaria la calibracin de cada cristal. (5) Interferencias producidas cuando se usa en medio lquido.
3.3.4 Transductor Termomtrico

Los transductores termomtricos se basan en la deteccin del calor generado en las reacciones enzimticas exotrmicas, que se puede relacionar con la concentracin de analito. Estos cambios de temperatura normalmente se determinan por medio de termistores a la entrada y a la salida del dispositivo en el que se encuentran inmovilizadas las enzimas.
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Presentan como inconveniente que pueden existir prdidas de calor por irradiacin, conduccin o conveccin.
FIGURA 7. Biosensor termomtrico. Como consecuencia de la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el aalito se produce una reaccin exotrmica que es proporcional a la concentracin de analito.
3.3.5 Transductor Nanomecnico

En los transductores nanomecnicos el elemento de reconocimiento biolgico se inmoviliza sobre la superficie de una micropalanca de silicio, que se sumerge en una muestra lquida. Generalmente se utilizan anticuerpos. La interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito produce un cambio diferencial en la tensin superficial del lquido y la micropalanca sufre una respuesta de tipo nanomecnico que consiste en un cambio de la deflexin y/o de la frecuencia de resonancia. (23) La deteccin de la respuesta nanomecnica puede hacerse de modo dinmico o de modo esttico. En el modo esttico, la magnitud medida es la deflexin de la micropalanca. Las molculas receptoras se inmovilizan slo en uno de los lados de la micropalanca. Cuando se introducen en la disolucin las molculas del analito, stas se enlazan sobre la superficie funcionalizada, producindose un cambio de la tensin superficial de este lado con respecto al otro lado de la micropalanca, dando lugar a un curvamiento de la micropalanca y una deflexin del orden del nanometro. Sin embargo, la deflexin de la micropalanca es muy sensible a cambios de temperatura debido al efecto bimetlico. En el modo dinmico se mide la frecuencia de resonancia, que depende tanto del cambio de tensin superficial como del cambio de masa. La frecuencia de resonancia es independiente de los cambios de temperatura. Trabajos recientes han mostrado que esta tcnica puede detectar errores de hibridacin de una sola base en oligonucletidos y pequeos contenidos de protenas antignicas con gran sensibilidad (24). Actualmente estos dispositivos se estn desarrollando para detectar mutaciones y polimorfismos en genes humanos as como para la deteccin de contaminantes en aguas con alta sensibilidad.
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FIGURA 8. Biosensor nanomecnico. El aumento de masa producto de la interaccin entre el analito y el elemento de reconocimiento provoca un curvamiento de la micropalanca.
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CAPTULO 4
Aplicaciones de Biosensores en Agroalimentacin
Como muestra la tabla 6 las aplicaciones actuales de los biosensores en el mbito agroalimentario se orientan hacia las siguientes reas principales: la seguridad alimentaria, la calidad alimentaria y el control de procesos industriales.
TABLA 6. Principales reas de aplicacin de las tecnologas de biosensores dentro del campo agroalimentario Seguridad alimentaria Compuesto xenobiticos Aditivos. Frmacos. Plaguicidas y fertilizantes. Otros contaminantes (dioxinas, PCBs, HAPs, metales pesados) Biotoxinas Toxinas bacterianas. Micotoxinas. Toxinas marinas. Microorganismos patgenos Virus. Bacterias. Protozoos. Control de procesos Azcares (fermentacin y pasteurizacin). Alcoholes (fermentacin alcohlica). Aminocidos (fermentacin). cido lctico (elaboracin de quesos). Calidad alimentaria Composicin del alimento Azcares. Aminocidos. Alcoholes. cidos orgnicos. Colesterol. Vida til Polifenoles y cidos grasos (enranciamiento). Azcares y cidos orgnicos (madurez). Aminas bigenas (ndice de frescura). Compuestos aromticos Alina (ajo y cebolla).
Otras aplicaciones OMGs. Ciclo reproductivo animal.
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4.1
Seguridad Alimentaria
El concepto de seguridad alimentaria implica garantizar la produccin y comercializacin de alimentos que no supongan un riesgo potencial para la salud del consumidor. En este campo los biosensores se utilizan para detectar: Compuestos xenobiticos, es decir, sustancias externas al producto alimenticio que no han sintetizado los seres vivos (aditivos, frmacos, plaguicidas,...). Ciertos componentes del alimento (alrgenos y antinutrientes). Toxinas de diversos orgenes (toxinas bacterianas, micotoxinas y toxinas marinas). Microorganismos patgenos que afectan al hombre, al ganado y a los cultivos.
4.1.1 Aditivos Alimentarios

La cantidad y tipo de aditivos alimentarios incorporados a un producto se encuentran estrechamente regulados por la legislacin comunitaria. Su deteccin y cuantificacin son importantes para evitar posibles usos fraudulentos o malas prcticas de fabricacin. Adems, estos compuestos pueden provocar problemas de intolerancias, alergias u otras reacciones adversas a determinados grupos de la poblacin.
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CAPTULO 4 Aplicaciones de Biosensores en Agroalimentacin
De momento, son pocos los ejemplos de biosensores aplicados a este campo. Se han identificado dispositivos para el anlisis de edulcorantes artificiales, aspartamo y sorbitol, y de conservantes, cido benzico y sulfitos. En el primer caso se trata de sustancias con efecto laxante cuando se ingieren en grandes cantidades. Al mismo tiempo, el aspartamo contiene fenilalanina un aminocido que los enfermos fenilcetonricos son incapaces de metabolizar y acumulan en el organismo. Como muestra la tabla 7 generalmente se emplean biosensores enzimticos en la determinacin de aditivos alimentarios. En algunos casos se han observado reacciones de interferencia que disminuyen la eficacia de estos dispositivos. Por ejemplo, ciertos biosensores utilizados para detectar sorbitol interaccionan tambin con otro edulcorante artificial, el xilitol. En algunos dispositivos destinados a la determinacin del cido benzico tambin surgen problemas de este tipo por la presencia de otros antioxidantes (BHA y propil galato).
TABLA 7. Ejemplos de biosensores utilizados en el anlisis de aditivos alimentarios

Tipo de interaccin Sistema de reconocimiento (una o varias clases de enzimas)
Analito
Sistema de transduccin
Aspartamo (25)
Biocataltica Biocataltica Biocataltica Biocataltica
Carboxil esterasa y alcohol oxidasa Caboxipeptidasa y L-aspartasa Peptidasa y aspartato aminotransferasa y glutamo oxidasa -Quimotripsina y alcohol y oxidasa Sorbitol deshidrogenasa y NAD Tirosinasa Sulfito oxidasa
Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico
Sorbitol (26)
Biocataltica
cido benzico (27) Biocataltica

Sulfitos (7)
Biocataltica
4.1.2 Frmacos
El uso de frmacos para el tratamiento de animales, tanto con fines teraputicos como con fines de promocin del crecimiento est muy extendido en ganadera. Como consecuencia de este uso, pueden aparecer residuos en los alimentos de origen animal, de ah el inters en su deteccin, tanto en los animales vivos, como en las canales o en los productos derivados de los mismos (leche, huevos, miel, etc.). Los mtodos tradicionales de cribado de muestras para detectar estos frmacos en ocasiones no tienen suficiente sensibilidad, y los mtodos ms actuales como cromatografa y espectrometra de masas requieren personal cualificado. (5) Los biosensores desarrollados para la deteccin de este tipo de compuestos son principalmente biosensores de bioafinidad, combinados con transductores pticos de tipo SRP. En la tabla 8 se recogen algunos de los biosensores de resonancia de plasmones superficiales desarrollados en los ltimos aos para la deteccin de antibiticos y promotores del crecimiento.
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TABLA 8. Ejemplos de biosensores utilizados en el anlisis de frmacos

Analito Tejido Referencias
Levamisol Sulfonamidas Penicilina G Nicarbacina Aminoglucosidos Cloranfenicol Sulphametacina Residuos de -agonistas
Hgado y leche Suero de pollo Leche Hgado y huevos Leche desnatada Leche Orina Hgado
Crooks, et al (28) Haasnoot, et al (29) Gustavsson, et al (30) McCarney, et al (31) Haasnoot, et al (32) Gaudin, et al (33) Akkoyun et al (34) Traynor, et al (35)
4.1.3 Residuos de Plaguicidas y Fertilizantes

La presencia de residuos de plaguicidas y fertilizantes en productos destinados al consumo humano es indeseable porque muchos de ellos cuentan con una toxicidad elevada. Algunos plaguicidas tienen la capacidad de acumularse en el tejido graso animal mientras que los nitratos, nitritos y fosfatos procedentes del empleo abusivo de fertilizantes contaminan el medio, fundamentalmente, los acuferos subterrneos. La tabla 9 recoge los principales biosensores utilizados en la deteccin de este tipo de compuestos en alimentos y agua. Entre ellos los ms extendidos son los biosensores enzimticos, dentro de los cuales se diferencian: Dispositivos basados en la inhibicin de la actividad enzimtica. Aqu se encuentran los biosensores que incorporan enzimas como colinesterasas (acetil y/o butirilcolinesterasas), tirosinasas o fosfatasas alcalinas. Unidades en las que se catalizan reacciones que afectan al analito de inters. ste es el caso de los biosensores que incluyen hidrolasas, reductasas,... Con respecto a los herbicidas (fenilureas, triazinas) -que actan inhibiendo la fotosntesis- se han diseado biosensores con receptores (de membrana de tilacoides y cloroplastos, fotosistemas, centros de reaccin) o clulas completas (algas unicelulares, bacterias prpuras) que participan o realizan este proceso. Aqu se emplean, sobre todo, transductores amperomtricos y pticos. (6) 45
4.1.4 Otros Contaminantes

Este epgrafe engloba un conjunto heterogneo de sustancias potencialmente txicas para el hombre con un alto impacto sobre el medioambiente. Se trata de residuos contaminantes presentes en el agua y el suelo que pueden alcanzar la cadena alimentaria de manera accidental. Se dividen en: Compuestos orgnicos, subproductos originados en diversos procesos industriales (dioxinas), usados como agentes dielctricos o fluidos hidrulicos (bifenilos policlorados o PCBs) o generados en la combustin de carbn, petrleo o madera (hidrocarburos aromticos policclicos o HAPs). Tambin se incluyen el benceno, tolueno y xileno (denominados BETX) y derivados fenlicos (tabla 9). Metales pesados (arsnico, cadmio, mercurio, plomo,...) (tabla 10). Aunque no se destinan al anlisis en matrices alimentarias, se han diseado numerosos dispositivos para determinar los niveles de estos contaminantes en muestras del medio ambiente. Se utilizan inmunosensores, biosensores enzimticos y biosensores con
clulas completas en la deteccin de los compuestos orgnicos descritos (6) (39), mientras que para los metales pesados son mayoritarios los biosensores que incorporan microorganismos modificados genticamente y enzimas (ureasa, colinesterasas, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina, ascorbato oxidasa, peroxidasa,...) (40). En ambos casos los sistemas de transduccin destacados son los electroqumicos y los pticos.
TABLA 9. Biosensores utilizados en la deteccin de plaguicidas, fertilizantes y otros contaminantes. (5) (6) (7) (36)
Analito Tipo de interaccin Elemento de reconocimiento Sistema de transduccin
Plaguicidas Paration
Biocataltica Biocataltica Biocataltica Biocataltica Bioafinidad Bioafinidad Bioafinidad Bioafinidad
Paration hidrolasa Acetilcolinesterasa Tirosinasa Fosfatasa alcalina Anticuerpo Anticuerpo Anticuerpo PIMs
Amperomtrico Fibra ptica Amperomtrico ptico Nanomecnico LAPS Amperomtrico Electroqumico
Propoxur y carbaril (37) Diazinn y diclorvs Paraoxn DDT (24) Terbutilazina (38) Atrazina Atrazina y 2, 4-D Fertilizantes Nitrato Nitrito Fosfato
Biocataltica Biocataltica Biocataltica
Nitrato reductasa Nitrito reductasa
Amperomtrico ptico
Polifenol oxidasa y fosfatasa alcalina Amperomtrico Fosforilasa A, fosfoglucomutasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
46
Contaminantes orgnicos Precursos de dioxinas* (41) Bioafinidad PCBs HAPs BETX Compuestos fenlicos** Metales pesados Cobre y mercurio Cobre Cadmio y plomo Biocataltica Biocataltica Biocataltica Spirulina subsalsa Saccharomyces cerevisiae recombinante Staphylococcus aureus o Bacillus subtilis recombinantes Colinesterasas Ureasa Glucosa oxidasa Amperomtrico Amperomtrico ptico Electroqumico ptico Amperomtrico Bioafinidad Bioafinidad Biocataltica Biocataltica Anticuerpo Anticuerpo Anticuerpo E. coli recombinante Tirosinasa SPR Electroqumico Fibra ptica Electroqumico ptico Amperomtrico
Arsnico, cadmio y bismuto Biocataltica Cadmio, cobre, cromo, niquel, zinc Cobre y mercurio Biocataltica Biocataltica
* 2,4-diclorofenol. ** Fenol, catecol, p-cresol, p-clorofenol, dopamina, p-metoxifenol y 1,4-benzoquinona.
4.1.5 Componentes del Alimento

Los factores antinutricionales y los alrgenos son compuestos presentes de forma natural en el alimento que pueden ocasionar trastornos en el organismo. Los primeros dificultan o impiden la absorcin y metabolizacin de distintos nutrientes produciendo un dficit de los mismos. En cambio, los alrgenos desencadenan una respuesta inmune en personas hipersensibles. En la tabla 10 se recogen algunos ejemplos de biosensores aplicados a este campo.
TABLA 10. Biosensores utilizados en la deteccin de antinutrientes, y alrgenos.
Tipo de interaccin Sistema de reconocimiento Sistema de transduccin
Analito
Antinutrientes Oxalato (espinacas, t, fresas) Amigdalina (almendras amargas) Glucoalcaloides Alrgenos Del cacahuete De la avellana Gluten Bioafinidad Bioafinidad Bioafinidad Anticuerpo Anticuerpo Anticuerpo Aptmero SPR SPR Electroqumico ptico Piezoelctrico Biocataltica Biocataltica Biocataltica Oxalato oxidasa -blucosidasa y otras Colinesterasas Amperomtrico Amperomtrico Potenciomtrico Potenciomtrico
47
4.1.6 Biotoxinas
En los alimentos pueden aparecer toxinas que pueden relacionarse con cuadros de intoxicacin alimentaria. Estas toxinas pueden proceder del crecimiento de bacterias, de hongos (micotoxinas) o por contaminacin de productos de origen marino (ficotoxinas). Al igual que ocurre con los patgenos de alimentos es necesario un conocimiento rpido de su presencia en los alimentos con el fin de conseguir una proteccin del consumidor adecuada. La mayor parte de estas toxinas son compuestos de naturaleza proteica y su anlisis suele ser complejo, ya que su deteccin y caracterizacin suele implicar procesos de extraccin y purificacin que requieren tiempos relativamente largos e incluso ensayos en animales, como el ensayo de ratn. Los biosensores podran ser una alternativa ya que no es necesaria la purificacin de los compuestos.
Pueden utilizarse biosensores basados en reacciones de bioafinidad, mediante sntesis de anticuerpos especficos contra estas toxinas o bien en reacciones biocatalticas, ya que muchas de estas toxinas son inhibidores enzimticos. Los biosensores aplicados a la deteccin de biotoxinas se recogen en la tabla 11.
TABLA 11. Biosensores utilizados en la deteccin de biotoxinas
Elemento de reconocimiento Sistema de transduccin
Origen
Toxina
Referencia
Bacteriano
Enterotoxina A estafiloccica Enterotoxina B
Anticuerpos Anticuerpos
Onda evanescente SPR Fibra ptica Piezoelctrico Fibra ptica
Rasooly, et al (45) Slavk, et al. (46) King, et al. (47) Lin, et al. (48) (6)
Toxina A de Clostridium botulinum Toxina colrica
Anticuerpos
Anticuerpos Receptores (gangliosidos)
QCM Onda evanescente QCM SPR
Spangler, et al. (49) Rowe-Taitt, et al. (12) Spangler, et al. (49) Gaag, et al. (50)
Enterotoxina Anticuerpos termolbil de E. coli Fngico Micotoxinas de Anticuerpos Fusarium y Aspergillus (zearalenona, DON fuminisina B1 y aflatoxin B1) Fumonisina Aflatoxinas Anticuerpos Anticuerpos
48
SPR
Mullett, et al. (51)
Biosensor fluorimtrico Velasco-Garca (5) de inmunoafinidad Fibra ptica Mello, et al. (7) Electroqumico QCM Electroqumico Cheun, et al. (13) Tang, et al. (52) Kreuzer, et al. (53)
Marino
Toxinas paralizantes Canales de sodio (PSP) cido okadoico Anticuerpos
cido okadoico, Anticuerpos brevetoxina, cido domoico y tetrodotoxina
4.1.7 Microorganismos Patgenos

El aumento en los ltimos aos de toxiinfecciones producidas por bacterias patgenas ha incrementado la necesidad de mtodos de deteccin ms rpidos, sensibles y especficos. En la actualidad se utilizan mtodos basados en anticuerpos y en ADN, que han permitido acortar el tiempo de anlisis pero no una deteccin en tiempo real. (21) Frente a estos mtodos de anlisis, los biosensores tienen el potencial de que permiten la deteccin en tiempo real, pero presentan como inconveniente que, en caso de un nmero bajo de microorganismos, es necesario hacer un pre-enriquecimiento o una concentracin de la muestra, con el consiguiente aumento del tiempo de anlisis. Los biosensores que existen para detectar microorganismos patgenos en alimentos (tabla 12) son principalmente de tipo inmunolgico combinados con transductores piezoelctricos, pticos, bioluminiscentes o de impedancia, que permiten una deteccin directa sin marcaje de la interaccin antgeno-anticuerpo. (5) (54) Existen tambin biosensores que permiten una deteccin indirecta de los microorganismos, entre los que se incluye deteccin mediante marcaje con fluorescencia, deteccin de metabolitos microbianos y deteccin electroqumica. Un grupo de biosensores muy importantes en la deteccin de microorganismos patgenos son los biosensores basados en ADN. Asimismo, es posible la aplicacin de estos dispositivos en sanidad animal para determinar la presencia de microorganismos patgenos en sangre. Por ejemplo, pueden detectarse varias cepas de Salmonella en pollos infectados gracias a un biosensor de SPR. (55) Aunque no se trata de un patgeno de origen alimentario en sentido estricto, existe un gran inters en la deteccin de Bacillus anthracis (tanto sus esporas como la toxina que produce esta bacteria) debido a la posibilidad de ataques bioterroristas como los envos de cartas con esporas de ntrax que se produjeron a partir del 11 de septiembre de 2001. La deteccin de este agente mediante biosensores permitira actuaciones rpidas. Un ejemplo de biosensores que permite detectar este microorganismo es el sensor denominado cellular analysis and notification of antigen risks and yields (CANARY en sus siglas en ingls). El elemento de reconocimiento son linfocitos B modificados genticamente para expresar una protena bioluminiscente sensible al calcio y anticuerpos de membrana especficos para el patgeno de inters. Cuando se produce la unin entre el patgeno y los anticuerpos de membrana se elevan los niveles intracelulares de calcio y la protena bioluminiscente emite luz que puede ser cuantificada. (56) 49
4.1.8 Otros Agentes Patgenos

Adems de las bacterias patgenas las tecnologas de los biosensores se aplican a otros agentes infecciosos entre los que se incluyen los virus que afectan a cultivos y ganado as como ciertos parsitos entricos (protozoos) transmitidos por las aguas de riego contaminadas. En la tabla 13 se muestran algunos de ellos. Se experimenta con inmunosensores para la deteccin de virus tan importantes como el de la peste porcina africana (57) o el de la fiebre aftosa (58) en suero u otros fluidos (saliva, orina, leche). Estos sistemas de anlisis permiten identificar de forma rpida y econmica los animales infectados asintomticos; gracias a ello, se evita la propagacin de la enfermedad al resto del rebao. Tambin se investiga su utilizacin para algunos virus que afectan a las plantas. (59) En cuanto al anlisis de parsitos entricos los datos encontrados se limitan a muestras de agua aunque las infecciones que causan estos protozoos pueden originarse a partir del consumo de productos vegetales o animales infectados crudos o poco cocinados.
TABLA 12. Biosensores utilizados en la deteccin de microorganismos patgenos. (5) (6) (8) (14) (21)
Sistema de transduccin Elemento de reconocimiento
Microorganismo
Electroqumico Light-addresable potentiometric sensor (LAPS) Impedimtrico Piezoelctrico tipo QCM
Anticuerpos Anticuerpos
S. typhimurium, E. coli 0157:H7 Campylobacter, S. aureus S. typhimurium, E. coli 0157:H7 B. subtilis, Y. Pestis, Neisseria meningitidis, Brucella melitensis Salmonella, Proteus vulgaris
50
Anticuerpos, receptores protena A
Vibrio cholerae, S. enteritidis, S. typhimurium, Listeria monocytogenes, Candida albicans, Campylobacter, E. coli, Shigella dysenteriae, Yersinia pestis, Proteus, Serratia, Klebsiella E. coli, Legionella, Salmonella E. coli 0157:H7 E. coli 0157:H7, Salmonella enteritidis, Listerio monocytogenes, B. subtilis S. aureus Mycobacterium avium, M. paratuberculosis, Salmonella, Listeria
Piezoelctrico tipo SAW Nanoelectromecnico SPR Resonancia de espejos Bioluminiscencia FIA (Fluorescent immunoassays) Interferometra ptica Fibra ptica
Anticuerpos Anticuerpos Anticuerpos Anticuerpos
Anticuerpos Anticuerpos Anticuerpos
S. typhimuriu, Yersinia, V cholerae, E. coli Salmonella typhimurium E. coli 0157:H7, S. aureus
TABLA 13. Biosensores utilizados para la deteccin de virus y protozoos

Agente patgeno Tipo de interaccin Elemento de reconocimiento Sistema de transduccin
Virus Virus de la peste porcina africana Virus de la fiebre aftosa Virus de la diarrea viral bovina Virus del mosaico del tabaco Protozoos Cryptosporidium (60) Cryptosporidium y Giardia Bioafinidad Bioafinidad Oligonucletido Anticuerpo Electroqumico Piezoelctrico Onda evanescente Bioafinidad Bioafinidad Bioafinidad Bioafinidad Anticuerpo Anticuerpo Anticuerpo Anticuerpo Piezoelctrico Piezoelctrico ptico SPR
51
4.2
Calidad Alimentaria
La calidad alimentaria se puede entender como aquellos factores que diferencian los productos de acuerdo con sus caractersticas organolpticas, de composicin o con sus propiedades funcionales. El anlisis de la composicin de los alimentos permite caracterizarlos y comprobar si contienen las cantidades que se requiere de los distintos componentes, tanto para aquellos que se encuentran de manera natural en los alimentos como para otros compuestos que se aaden para su enriquecimiento, como es el caso de algunas vitaminas o minerales. A continuacin se muestra la tabla 14 en la que se recogen los distintos biosensores desarrollados para evaluar la composicin de los alimentos incluyendo aquellos que se utilizan para evaluar la presencia y contenido de componentes normales del alimento (contenido en etanol, glucosa, almidn) y de otros que se aaden como vitaminas, aminocidos, etc.
TABLA 14. Biosensores aplicados a la evaluacin de la calidad de los alimentos
Analito
Matriz
Glucosa
Mosto, vino, zumo, bebidas refrescantes, miel, leche y yogur Zumo, miel, leche, gelatina y edulcorantes artificiales Leche Sidra y vino Leche Harina de trigo Leche y zumo de frutas Salsa de soja y condimentos Leche y pasta Vino, sidra y zumos Cerveza, vino y otras bebidas alcohlicas Vino
Glucosa oxidasa Fructosa deshidrogenasa -galactosidasa Transaminasa y lactato deshidrogenasa Fructosa deshidrogenasa y -galactosidasa
Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico
52
Fructosa Lactosa Lactato Lactulosa Almidn L-aminoacidos L-glutamato L-lisina L-malato Etanol Glicerol
-amilasa y amiloglucosidasa Amperomtrico y glucosa oxidasa Aminocido oxidasa Glutamato oxidasa Lisina oxidasa Malato deshidrogenasa y otras Alcohol oxidasa Glicerofosfato oxidasa y glicerolquinasa Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico
TABLA 14. Biosensores aplicados a la evaluacin de la calidad de los alimentos (cont.)

Analito
Matriz
Catecol Colesterol cido ctrico cido flico Biotina y folatos Lecitina
Cerveza Mantequilla, manteca y huevo
Polifenol oxidasa Colesterol oxidasa y peroxidasa
Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico SPR SPR Electroqumico
Zumo y bebidas para deportistas Citrato liasa Alimentos fortificados Frmulas infantiles y leche Yema de huevo y harina y aceite de soja Anticuerpos Anticuerpos Fosfolipasa D y colina oxidasa
La evaluacin de la composicin permite tambin conocer la frescura de algunos productos, como carnes, pescados, frutas y verduras. Durante el almacenamiento de los productos se sintetizan distintos compuestos que dan sabores y aromas anormales, como los compuestos que se producen por la degradacin de las grasas o las aminas que aparecen durante el deterioro del pescado y la carne, que en ocasiones pueden ser perjudiciales para la salud y se pueden utilizar como ndices de frescura. El ndice de frescura se relaciona con la calidad sanitaria del alimento, ya que los alimentos sirven como medio de crecimiento para distintos microorganismos, que pueden ocasionar toxiinfecciones alimentarias o desarrollar toxinas. Por tanto, un ndice de frescura bajo indica una mayor probabilidad de crecimiento microbiano y una menor seguridad del alimento.
53
En el caso de frutas se puede analizar el contenido de algunos cidos orgnicos y azcares que son indicadores de la madurez de las mismas. Existen otros compuestos que dan lugar a la aparicin de sabores y aromas desagradables como es el caso del 2,4,6-tricloroanisol en los vinos (62), que es un compuesto de origen microbiano relacionado con los corchos que tapan las botellas y cuya presencia causa grandes prdidas en la industria vitivincola. En otros casos, se pueden detectar indicadores del proceso al que ha sido sometido el alimento, como es el caso de la lactulosa, que es un disacrido que se forma en el tratamiento trmico de la leche y permite diferenciar entre leche sometida a una tratamiento UHT y leche esterilizada en el envase. A continuacin se muestra una tabla en la que se recogen los distintos biosensores desarrollados para evaluar la frescura y la vida til de los alimentos.
TABLA 15. Biosensores utilizados en la evaluacin de la vida til (62) (7)

Analito
Matriz
Evaluacin del enranciamiento Polifenoles cidos grasos de cadena corta ndice de frescura Orinitina y aminas Gambas Ornitina carbamil transferasa, nuclesido fosforilasa y xantina oxidasa Diamina oxidasa Amina oxidasa y peroxidas Amina oxidasa Xantina oxidasa Diamina oxidasa Poliamina oxidasa Xantina oxidasa Enzimtico Amperomtrico Amperomtrico Aceite de oliva Leche y derivados Tirosinasa Lipasa Amperomtrico Electroqumico
Aminas Aminas bigenas Histamina Hipoxantina Aminas
Pescado Pescado Pescado Pescado Frutas y verduras Carne
Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico
cido lctico Evaluacin de la madurez Glucosa
Carne
Frutas Frutas Frutas
Glucosa oxidasa Invertasa, mutarotasa y glucosa oxidasa Isoctrico deshidogenasa
Electroqumico Electroqumico Potenciomtrico
54
Sacarosa Isocitrato Evaluacin del deterioro
2,4,6-tricloroanisol Vino
Anticuerpos
Electroqumico
4.3
Control de Procesos
Los sistemas de monitorizacin continua de un proceso industrial permiten detectar en tiempo real los posibles errores de la cadena de produccin para subsanarlos de manera inmediata. Hasta el momento se han utilizado en el control de parmetros como el pH, la temperatura, la presin, etc. Gracias a las tecnologas de biosensores ahora tambin pueden determinarse y cuantificarse on line diversos compuestos de gran importancia como (tabla 16): Azcares: fuentes de carbono y factores limitantes del crecimiento de las levaduras que participan en los procesos fermentativos (glucosa). Concentraciones bajas de los mismos disminuyen la productividad del biorreactor. Otro ejemplo es la aparicin de lactulosa que indica un tratamiento trmico excesivo de la leche durante la pasteurizacin. (43) Alcoholes: productos finales de la fermentacin alcohlica (cerveza, vino). Con respecto al etanol las reacciones enzimticas se inhiben cuando su cantidad supera el 14%. Por otra parte, la proporcin de glicerol debe mantenerse en 1:10 respecto al alcohol total si no hay alteraciones indeseables durante el proceso. (64) Otras molculas: aminocidos (lisina) obtenidos por fermentacin y empleados como suplementos en piensos animales, cido lctico para controlar la acidez y formacin de la corteza de quesos.
55
TABLA 16. Compuestos monitorizados en tiempo real mediante las tecnologas de los biosensores. (7)
Tipo de interaccin Elemento de reconocimiento Sistema de transduccin
Analito
Azcares Glucosa Lactosa Lactulosa Alcoholes Etanol Glicerol Otros L-lisina cido lctico Biocataltica Biocataltica Lisina oxidasa Lactato oxidasa Amperomtrico Amperomtrico Biocataltica Biocataltica Alcohol deshidrogenasa Gluconobacter oxydans Gliceroquinasa y glicerol-3-P-oxidasa Amperomtrico Amperomtrico Biocataltica Biocataltica Biocataltica Glucosa oxidasa -Galactosidasa y glucosa oxidasa -Galactosidasa y fructosa deshidrogenasa Amperomtrico
La utilizacin de biosensores para la monitorizacin en tiempo real de los analitos citados supone menores prdidas econmicas para el fabricante. Adems, estos dispositivos pueden integrarse en el sistema APPCC (Anlisis de Peligros y Puntos de Control Crticos) y verificar que el proceso se ha realizado correctamente. A pesar de todo, esta tecnologa ve limitado su uso en el control de procesos por varios motivos. El corto tiempo de vida de los sensores enzimticos, la necesidad de calibrarlos con frecuencia, la falta de una respuesta fiable a diferentes concentraciones o con condiciones variables en el medio son algunos de ellos. (65)
56
4.4
Otras Aplicaciones
4.4.1 Organismos Modificados Genticamente

La legislacin que regula los organismos modificados genticamente (OMGs) vara de un pas a otro. En concreto, en Europa es obligatorio el etiquetado de ciertos productos que contengan OMGs o derivados de stos. Un OMG se define como un organismo vivo en cuyo genoma se ha introducido material gentico exgeno que codifica para determinadas protenas. Dichas protenas le confieren nuevas caractersticas de inters agronmico como, por ejemplo, tolerancia a herbicidas, resistencia a virus, insectos,... El ADN introducido incorpora determinadas secuencias -regin promotora y regin de terminacin- que regulan la expresin de los genes forneos. Basndose en ello se han diseado biosensores de cidos nucleicos complementarios a estas regiones y, por tanto, capaces de hibridar con ellas, una vez que el material gentico de la muestra ha sido aislado y amplificado por PCR. 57 Los biosensores ms comunes en la deteccin de OMGs combinan ADN con transductores piezoelctricos (QCM) y pticos (SPR). (66) (67)
4.4.2 Ciclo Reproductivo Animal

La tcnica de inseminacin artificial tan frecuente en produccin animal requiere de un conocimiento preciso de los perodos de celo de las hembras. Hasta ahora esta etapa del ciclo reproductivo se predeca bien por observacin del ganado bien a partir de ensayos ELISA. Esta ltima opcin cuenta con una elevada especificidad (98%) pero consume mucho tiempo y necesita personal cualificado, que normalmente no se encuentra en una granja. Las tecnologas de biosensores permiten monitorizar en tiempo real la cantidad de progesterona en leche fresca. Segn la concentracin de esta hormona sexual no slo puede determinarse el celo sino tambin si estn preadas o hay problemas de fertilidad en las hembras. Los dispositivos empleados en este caso son inmunosensores con sistemas de transduccin amperomtricos y pticos. Adems, la incorporacin de estas unidades de anlisis en el manejo animal abarata considerablemente los costes. (5)
CAPTULO 5
Retos y tendencias en Tecnologas de Biosensores
A pesar de la gran cantidad de investigaciones sobre tecnologas de biosensores en agroalimentacin los productos comercializados son escasos. Con el fin de optimizar los prototipos experimentales existentes se trabaja para corregir sus limitaciones tcnicas. En el apartado 2.2 de este informe se detallan las principales caractersticas que cabra esperar de los mismos como potenciales sustitutos parciales de las tcnicas de anlisis convencionales. Segn el tipo de biosensor (la naturaleza del elemento de reconocimiento y el sistema de transduccin elegido) y la aplicacin a la que se destine los requisitos que debe cumplir el dispositivo varan. As, en algunos casos puede interesar especialmente una mejora de la selectividad y sensibilidad del sensor mientras que en otros se trate del tiempo de respuesta o la capacidad de regeneracin de la superficie de interaccin.
Un nmero importante de lneas de investigacin en tecnologas de biosensores aborda los siguientes aspectos (6) (7): Miniaturizacin de estos dispositivos hasta una escala de micro y nanometros. Diseo de biosensores reutilizables de manera que un mismo sistema pueda llevar a cabo varios anlisis sin prdida de sensibilidad. Desarrollo de unidades con capacidad para detectar diversos analitos simultneamente. Estudio de nuevos elementos de reconocimiento que mimeticen las molculas biolgicas con un tiempo de vida y una estabilidad mayores. Avances en los procedimientos de inmovilizacin que eviten o minimicen las alteraciones del elemento de reconocimiento durante este proceso. Aparte de estos desarrollos, otras reas de estudio se centran en ampliar los conocimientos sobre los fenmenos implicados en las reacciones qumicas entre el elemento de reconocimiento y el analito. Como resultado se ha logrado mejorar la transmisin de la seal producida por la interaccin analito-enzima. Para ello se han sintetizado artificialmente molculas que actan como mediadores en dichas reacciones y que son ms eficaces y estables que sus anlogos naturales. Tambin se investigan el empleo de materiales novedosos (polmeros conductores) para la construccin de biosensores y nuevas tcnicas de fabricacin (fotolitografa, etching, screen-printing). (18)
60
5.1
Miniaturizacin
A la reduccin de las dimensiones de los biosensores han contribuido los procedimientos de microfabricacin, la nanotecnologa y la microelectrnica as como los constantes avances en el campo de los dispositivos microfludicos o lab-on-achip. Estos chips incorporan funciones que los biosensores no abordan. Por ejemplo, los lab-on-a-chip no slo llevan a cabo el anlisis sino tambin la preparacin de la muestra. (68) Gracias a su menor tamao se ha incrementado el nmero de posibles aplicaciones de los biosensores, especialmente, entre aquellas en las que el espacio fsico, el volumen de muestra o la localizacin del anlisis son limitados. Adems, estructuras de dimensiones reducidas pueden integrarse en sistemas ms complejos que lleven a cabo diversas tareas a la vez (sistemas multisensores). Tambin permiten disponer de dispositivos analticos porttiles para ensayos in situ. Muchos de estos dispositivos de pequeas dimensiones se componen de un elemento de reconocimiento biocataltico combinado con un microtransductor (transistores de efecto de campo ion selectivos o ISFET, microelectrodos de oxgeno y perxido de hidrgeno, electrodos de fibra de carbono,...). (7) 61
CAPTULO 5 Retos y tendencias en Tecnologas de Biosensores
5.2
Regeneracin
Otra caracterstica deseable en un biosensor es la regeneracin sin prdida de sensibilidad de la superficie donde sucede la interaccin con el compuesto de inters. Para ello es necesario que haya elementos de reconocimiento libres donde puedan unirse las nuevas molculas de analito tras la primera determinacin. Esto permite realizar varios anlisis consecutivos. Hay ejemplos de este tipo de dispositivos en el campo del control de procesos, en concreto, en la monitorizacin de metanol y etanol en bebidas alcohlicas.
Se han diseado sensores amperomtricos cuyos electrodos se regeneran con un simple pulido de su superficie. Entre las matrices utilizadas para el atrapamiento del elemento de reconocimiento se encuentran las matrices electrdicas compsitas rgidas de grafito-tefln y de grafito-resina epoxi. Su construccin resulta bastante sencilla ya que las enzimas y los mediadores de las reacciones se introducen en la matriz que compone el electrodo. Una vez finalizado el primer ensayo, la superficie del mismo se pule quedando disponibles los puntos de interaccin del elemento de reconocimiento para el siguiente anlisis. (69)
62
5.3
Multi-Anlisis
Es interesante contar con unidades que detecten simultneamente varios analitos puesto que su empleo supone un ahorro econmico y de tiempo considerables. Esta alternativa se aplica en el control de distintos azcares y alcoholes en procesos fermentativos y en la determinacin de diversos plaguicidas en muestras de agua y suelo. En este ltimo caso, se han desarrollado sensores biocatalticos para detectar organofosforados y carbamatos. Se trata de dispositivos multienzimticos que operan con varias acetilcolinesterasas obtenidas de microorganismos modificados genticamente. Cada una de ellas muestra una afinidad diferente hacia los analitos estudiados y tienen capacidad para discriminar entre compuestos de la misma naturaleza qumica. (70) Otros desarrollos similares aptos para realizar ensayos multianalito son los biochips o microarrays de ADN. Se trata de dispositivos que incluyen diversos fragmentos de material gentico inmovilizados sobre un soporte slido que puede estar asociado a un sistema de transduccin, en cuyo caso se tratara de un biosensor, o no. Estos dispositivos permiten detectar varios analitos (plaguicidas, microorganismos, OMGs,...) a la vez segn las secuencias de ADN seleccionadas. (68)
63
5.4
Molculas Biomimticas
La incorporacin de componentes biolgicos en un biosensor implica un control de las condiciones ambientales durante la fabricacin, uso y almacenamiento del dispositivo. An as no resulta sencillo alcanzar el mximo rendimiento del sistema. En general, se trata de elementos con una vida til corta, que pueden sufrir alteraciones en las etapas de aislamiento e inmovilizacin o en medios cambiantes (por ejemplo, durante la monitorizacin de un proceso industrial). Adems, en algunos casos no se han detectado molculas en la naturaleza capaces de interaccionar especficamente con determinados txicos o bien su obtencin resulta demasiado costosa.
Frente a estos componentes biolgicos se encuentran las molculas biomimticas, sintetizadas de forma artificial y con una estabilidad qumica y mecnica superior. En teora, estos elementos pueden disearse para cualquier tipo de analito. Presentan una sensibilidad y selectividad elevadas y pueden producirse a gran escala con un coste bajo. Entre las molculas biomimticas utilizadas en las tecnologas de biosensores destacan los PIMs, los PNAs y los aptmeros, descritos en el punto 3.1.2 de este informe.
64
5.5
Nuevas Tcnicas de Inmovilizacin
Dentro de las fases de fabricacin de un biosensor una de las ms problemticas es la inmovilizacin del elemento de reconocimiento. Los procedimientos utilizados hasta ahora afectan en mayor o menor grado a la estabilidad y capacidad analtica del biosensor. Con el objetivo de minimizar estos inconvenientes se investigan mecanismos alternativos de inmovilizacin. Tecnologas como la sol-gel, las pelculas polimerizadas por plasma, las monocapas autoensambladas, las membranas de bicapas lipdicas y las partculas magnticas bacterianas comienzan a emplearse en el campo de los biosensores. En el proceso sol-gel se parte de un precursor (sales inorgnicas de metales o compuestos organometlicos) que se somete a reacciones de hidrlisis y polimerizacin hasta que da lugar a una suspensin coloidal o sol (partculas con un dimetro de nm inmersas en una fase lquida). Dicha suspensin se deposita sobre la superficie a recubrir mediante diversos mtodos (pulverizacin, centrifugado,...) donde las partculas condensan en una nueva fase (gel) formando una capa muy fina. Posteriormente, se procede a la densificacin de la pelcula mediante un tratamiento trmico suave que da lugar a una matriz slida porosa.
65
Una disolucin de los elementos de reconocimiento correspondientes (enzimas, anticuerpos) se aade durante la transicin de sol a gel. Como resultado estos componentes biolgicos quedan retenidos en las cavidades de la matriz. La tecnologa sol-gel se ha utilizado, por ejemplo, en la fabricacin de un biosensor amperomtrico que detecta compuestos fenlicos a travs de la enzima tirosinasa inmovilizada en una matriz de derivados de titanio. (71)
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIN SOL-GEL

Ventajas Es un procedimiento que se lleva a cabo a temperaturas prximas a la ambiente lo que reduce el riesgo de alteraciones trmicas en los componentes biolgicos. Hasta ahora, nicamente los recubrimientos de polmeros orgnicos eran compatibles con la fabricacin a baja temperatura. Da lugar a matrices muy homogneas y de alta pureza. Pueden obtenerse pelculas de pequeo grosor (40-2000 nm). El analito difunde sin dificultad en el interior de la matriz y accede fcilmente al elemento de reconocimiento. Inconvenientes
Algunos de los compuestos qumicos implicados en la formacin de la pelcula pueden desnaturalizar los elementos de reconocimiento. La matriz puede sufrir problemas de contraccin y fracturas que daen la estructura y la capacidad de respuesta del transductor.
La polimerizacin asistida por plasma consiste en generar un gas altamente ionizado -denominado plasma- mediante una descarga electromagntica a baja temperatura y en condiciones de vaco. En este estado el gas es muy reactivo y su energa desencadena la polimerizacin de monmeros gaseosos en lminas de pequeo espesor (nm). Gracias al plasma esta pelcula slida (plasma polymerized film o PPF) se deposita fcilmente sobre la superficie de cualquier material sin que ste se altere. Las caractersticas del recubrimiento obtenido dependen del monmero seleccionado y sus grupos funcionales con los que interaccionan los elementos de reconocimiento. Esta tecnologa se aplica en la fijacin de anticuerpos en transductores de tipo QCM y SPR. (18)
66
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA POLIMERIZACIN ASISTIDA POR PLASMA

Ventajas Puede controlarse el espesor de la pelcula formada y obtenerse recubrimientos de menos de 50 nm de grosor. Las PPFs presentan una adhesin fuerte al material base. Son lminas homogneas, no porosas y estables qumica y mecnicamente. Este procedimiento es aplicable a numerosos monmeros orgnicos y materiales base (metales, cristales,...). Por tanto, aumentan los grupos funcionales disponibles para la unin de los elementos de reconocimiento. Es compatible con la produccin a gran escala y los procesos de miniaturizacin. Inconvenientes Es un proceso costoso y el control de fabricacin resulta bastante complejo. El biosensor obtenido mediante esta tcnica tiene una baja repetibilidad porque resulta complicado obtener dos PPFs con idnticos grupos funcionales y entrecruzamientos.
Las monocapas autoensambladas (self-assemble monolayers o SAMs) se forman a partir de la organizacin espontnea de molculas con ciertos grupos funcionales, principalmente grupos tiol, sobre la superficie de un metal. Estos grupos tiol se fijan al sustrato que se desea cubrir a travs de un mecanismo de adsorcin qumica y el resto de la molcula establece uniones electrostticas, estricas, de Van der Waals,... con sus vecinas. Las monocapas moleculares obtenidas se ponen en contacto con una disolucin que contenga los componentes biolgicos a inmovilizar. La interaccin de los elementos de reconocimiento con las molculas autoensambladas se produce a travs de grupos funcionales -distintos de los que las unen al metal- que se han activado previamente con diversos compuestos qumicos. En esta tcnica se utilizan con bastante frecuencia alcanotioles como componentes de la monocapa adsorbidos en pelculas de oro. Por ejemplo, se ha desarrollado un inmunosensor piezoelctrico para la deteccin de E.coli con estas caractersticas. (72) Actualmente se investigan otras opciones como cidos carboxlicos y difosfatos que podran presentar propiedades de adsorcin frente a los metales interesantes. 67 VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LAS MONOCAPAS AUTOENSAMBLADAS
Ventajas Son capas con una estabilidad elevada. Permiten controlar la distribucin espacial del elemento de reconocimiento sobre la superficie del transductor. Los componentes biolgicos pueden situarse muy prximos al sistema de transduccin; esto sucede cuando se seleccionan, por ejemplo, alcanotioles de cadena corta. Su obtencin es sencilla; basta con baar la superficie del transductor con una disolucin que contenga las molculas que generarn la monocapa. Inconvenientes Se trata de una tecnologa en desarrollo sobre la que se desconocen algunos aspectos como qu parmetros influyen en cada una de las etapas de preparacin de la monocapa. Resulta bastante complicado depositar la misma cantidad de elementos de reconocimiento en cada transductor; esto supone que los biosensores comerciales no seran totalmente homogneos.
El empleo de membranas de bicapas lipdicas (bilayer lipid membranes o BLMs) en la construccin de biosensores no es algo reciente. Sin embargo, los problemas de estabilidad mecnica y conductividad inica de este mtodo de inmovilizacin han limitado su uso en este campo. Recientemente se investigan estructuras alternativas basadas en las BLMs que no presentan estos inconvenientes. Para mejorar la estabilidad se han diseado membranas
unidas directamente a un soporte slido (solid supported bilayer lipid membranes o sBLMs). Cuentan con una SAM de alcanotioles y/o tiolpidos adsorbida sobre la superficie del transductor ms una monocapa lipdica que interacciona con ella. Con respecto a la baja conductividad inica se trabaja con molculas voluminosas que se fijan al soporte, por un extremo, y a la bicapa lipdica mediante enlaces covalentes, por el otro. Esta disposicin (tethered bilayer lipid membranes o t-BLMs) crea un pequeo espacio entre la superficie slida y la membrana que sirve de reservorio acuoso. Gracias a l, la corriente de iones generada por la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito puede alcanzar con facilidad el sistema de transduccin. (73)
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LAS MEMBRANAS DE BICAPAS LIPDICAS

Ventajas Permiten inmovilizar de manera sencilla los elementos de reconocimiento biolgicos, especialmente enzimas y receptores de membrana as como otros intermediarios relacionados con ellos (canales inicos, protenas asociadas, etc). Proporcionan un entorno ptimo para los componentes biolgicos que reduce el riesgo de desnaturalizacin y prdida de actividad. En general, la generacin de seales elctricas y su transduccin puede medirse fcilmente en sistemas que incorporan BLMs. Inconvenientes Las BLMs tradicionales presentan baja estabilidad mecnica. Suelen presentar menor fluidez que las bicapas lipdicas naturales.
68
Por ltimo, las partculas magnticas bacterianas (bacterial magnetic particles o BMPs) son partculas minerales de greigita o magnetita, de pequeo tamao (50-100 nm), que estn recubiertas por una membrana citoplasmtica. Estos corpsculos son sintetizados de forma natural por algunos microorganismos. Sobre la membrana de las BMPs pueden inmovilizarse distintos elementos de reconocimiento (enzimas, anticuerpos, cidos nucleicos). Para ello existen dos posibilidades: La inmovilizacin directa mediante reacciones qumicas que generan entrecruzamientos entre el elemento biolgico y la bicapa lipdica de la BMP. La transformacin de una bacteria para que sintetice estas partculas y exprese en su membrana el elemento de reconocimiento de inters. Actualmente se utilizan para fijar anticuerpos en inmunoensayos para alrgenos alimentarios y discriminacin de especies de inters comercial (atn). En un futuro prximo esta tecnologa podra aplicarse a la fabricacin de biosensores. (18)
CAPTULO 6
Aspectos de Mercado
Estudios recientes cifran el mercado mundial de biosensores a finales de 2003 en 7.300 millones de dlares y se espera que en los aos venideros tenga una tasa de crecimiento del 10.4%, alcanzando para 2007 los 10.800 millones de dlares (75). Las demandas de este mercado provienen de cuatro sectores bien diferentes: el biosanitario-farmacetico, el medioambiental, el agroalimentario y el militar. Estas demandas sectoriales generan desarrollos tecnolgicos especficos que presentan una rpida transferencia horizontal entre sectores. Sin embargo, esta tecnologa, si bien se encuentra perfectamente implantada en el sector biosanitario (detectores de glucosa, biosensores de diagnstico, etc), todava no ha penetrado de forma incisiva en otros sectores como el agroalimentario o el medioambiental.
7300 M $
70
Mercado mundial de biosensores. Las tecnologas desarrolladas para satisfacer las necesidades de cada uno de los mercados en los cuatro sectores de implantacin, son rpidamente transferidas de forma horizontal de un sector a otro. El resultado es un mercado global en continua expansin cifrado en la actualidad en 7300 millones de dlares.
No obstante, como se ha visto ampliamente en los apartados anteriores, las diversas tecnologas implicadas en biosensores han permitido disponer ya de dispositivos de muy diversas caractersticas con aplicaciones en la prctica totalidad de la cadena alimentaria, algunos en fase de laboratorio, otros en fase de desarrollo, y una creciente minora en fase de comercializacin. Las razones de este desfase entre tecnologa disponible y realidades en el mercado no responden, en trminos generales, a limitaciones de la propia tecnologa, si bien algunos de estos aspectos son todava manifiestamente mejorables, y las recientes investigaciones apuntan en este sentido, como se especifica en el apartado 5. Los motivos se encuentran en factores inherentes al propio sector y en factores ambientales.
Entre los primeros, cabe destacar en primer lugar la inercia metodolgica del sector, especialmente caracterstica en el caso de transferencia horizontal de tecnologas de un sector a otro. Las tcnicas analticas convencionales satisfacen hasta el momento la prctica totalidad de las necesidades del sector, en ocasiones con equipamientos enormemente sofisticados y caros, cuya amortizacin queda justificada en trminos de aumento de la seguridad alimentaria y de los procesos productivos. En estos casos la inercia metodolgica se agrava especialmente, sobre todo si consideramos que los biosensores, si bien pueden ser multianlisis, no son tecnologas de carcter generalista que permitan el anlisis de amplios espectros de compuestos como ocurre en el caso de cromatografas, espectrometras de masas, etc. Pese a todo ello, es de esperar una creciente penetracin en el mercado de estos dispositivos como elementos de discriminacin previa, sobre todo en aquellos casos en los que la trazabilidad del alimento lo demanda, ya sea por motivos legales o por motivos de seguridad de los distintos eslabones de la cadena alimentaria. 71 Este fenmeno redunda en un uso extendido de la tecnologa, con un abaratamiento de los costes de produccin, que a medio plazo resulta en la ampliacin de su uso en los protocolos analticos de rutina. El fenmeno es similar al que ocurriera para el caso de los biosensores de glucosa aplicados a salud humana, en los que la generalizacin del uso como mecanismo de autocontrol en pacientes diabticos, extendi su aplicacin a los protocolos analticos hospitalarios y de atencin primaria en pases como Japn.
CAPTULO 6 Aspectos de Mercado
Se espera, por tanto, que la actual demanda del mercado vaya aumentando progresivamente, de forma que se incremente la todava deficiente capacidad de absorcin del sector agroalimentario de esta tecnologa. Ello redundara en un abaratamiento de costes, de forma similar a como ya ocurriera con los biosensores diseados para diagnstico clnico, en los que el precio de venta al pblico puede llegar a ser incluso inferior al euro (glucosa). Por otro lado, como se puede apreciar en la tabla 17, la mayora de las empresas que desarrollan y comercializan biosensores aplicados a la industria agroalimentaria, no provienen del campo de la instrumentacin analtica especfica de este sector. En general, se trata de empresas dedicadas a la biotecnologa, con fuerte implantacin en el sector biosanitario y/o medioambiental. Por tanto, su capacidad de penetracin en los canales de distribucin especficos del sector agroalimentario es todava dbil, y su experiencia en la comercializacin escasa. No obstante, algunas grandes empresas dedicadas al control de la seguridad y calidad alimentaria, van incorporando de forma progresiva la tecnologa de biosensores a su
oferta tecnolgica, como alternativa para la satisfaccin de demandas especficas del sector. Los factores que denominamos ambientales son de tipo normativo. Hacen referencia a aquellos casos en los que la legislacin especifica los protocolos a seguir para el anlisis de determinados compuestos con referencia explcita al equipamiento que se ha de utilizar (por ejemplo el RD 604/2003 referente a los mtodos de anlisis de dioxinas y PCBs). Este hecho dificulta la implementacin de estas tecnologas en la industria, que ve como, pese a ser potentes instrumentos de anlisis , no estn recogidos en la legislacin. Esta situacin va cambiando despacio, y algunas nuevas normativas slo recogen la exactitud, la precisin y el lmite de deteccin que debe reunir el mtodo analtico sin especificar la instrumentacin. Este es el caso del RD 140/2003 sobre criterios sanitarios de la calidad del agua de consumo humano. Por otra parte, la legislacin actual no es, en general, especialmente exigente en cuanto a la periodicidad de los controles que la industria debe realizar para detectar agentes que amenacen la inocuidad de los alimentos. Sin embargo, las cada vez mayores exigencias en cuanto a seguridad alimentaria hacen prever que se har cada vez ms necesaria una mayor frecuencia en los controles higinico-sanitarios de los sistemas productivos, y que por tanto la demanda de este tipo de dispositivos ir aumentando progresivamente. A continuacin se describen algunas de las empresas que hemos elegido como ms representativas cuya actividad se centra en la fabricacin y/o comercializacin de biosensores especialmente diseados para la industria agroalimentaria. El resto de las empresas y sus productos con su correspondiente aplicacin se reflejan en la tabla 17.
72
AFFINITY SENSORS
Affinity Sensors es una empresa del Reino Unido que comenz a investigar en 1987, en colaboracin con GEC-Marconi y el Instituto de Biotecnologa de la Universidad de Cambridge, en la resonancia de espejos, obteniendo como resultado de esta colaboracin una nueva tecnologa denominada IAsys. IAsys permite un anlisis de las interacciones biomoleculares en tiempo real sin marcaje para la determinacin de perfiles cinticos, reconocimiento molecular y determinacin de concentracin de analitos.
BIACORE AB
Biacore es una empresa sueca lder en la deteccin y monitorizacin de uniones biomoleculares mediante la tecnologa de Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR) con aproximadamente un 90% del mercado mundial. Biacore desarrolla, manufactura y comercializa sistemas bioanalticos que proporcionan datos cuantitativos de interacciones de unin entre molculas en tiempo real. Ofrecen sistemas, reactivos y know-how para las aplicaciones de esta tecnologa en distintos campos entre los que se incluye la industria alimentaria. Sus aplicaciones en la industria alimentaria se centran en el control de calidad, donde han desarrollado anlisis de vitaminas hidrosolubles, y en la seguridad alimentaria, donde poseen sistemas para detectar residuos qumicos y veterinarios, as como micotoxinas. Entre sus proyectos para futuros desarrollos se incluyen la deteccin de alrgenos, protenas modificadas genticamente, priones, patgenos y residuos de biocidas. La tecnologa desarrollada por Biacore permite la determinacin cualitativa y cuantitativa de distintos analitos y proporciona resultados rpidos con elevada productividad, costes bajos y elevada sensibilidad; ya que permite el anlisis de gran cantidad de productos automticamente, con una preparacin de la muestra mnima y un tiempo de anlisis corto.
73
RESEARCH INTERNATIONAL
Es una empresa estadounidense que desarrolla, manufactura y comercializa sensores con distintas aplicaciones, entre las que se encuentra la deteccin de toxinas y microorganismos con inters en la seguridad alimentaria como bacterias patgenas, virus y esporas de distintos mohos. Comercializan distintos productos con diferentes formatos, pero en general son biosensores de bioafinidad con anticuerpos como elementos de reconocimiento y transductores de tipo ptico.
TEXAS INSTRUMENTS
Texas Instruments es una empresa norteamericana lder en el mercado de sensores de presin para automocin y mercados industriales. Tiene patentado y comercializa un producto denominado Spreeta, basado en la resonancia de plasmones superficiales, que permite la determinacin en tiempo real de
distintos compuestos, entre los que se encuentran analitos de inters en la industria alimentaria.
CHEMEL AB
Chemel AB es una empresa sueca fundada en 1996 como una spin-off del European Institute of Science, que posee un 7% del accionariado. Sus principales actividades incluyen el desarrollo, manufactura y comercializacin del biosensor SIRE, basado en la tecnologa patentada SIRE (Sensors based on Injection of the Recognition Element), cuyos derechos adquirieron en 1997 del European Institute of Science.
74
Poseen un acuerdo de distribucin y colaboracin con Diffchamb Inc, que es una empresa suministradora de productos para el anlisis de alimentos. La empresa Chemel AB se encuentra en la actualidad desarrollando mtodos y software que permita la utilizacin de este biosensor para monitorizacin de procesos como fermentaciones.
TABLA 17. Empresas que comercializan biosensores aplicados a la industria agroalimentaria.
Empresa
Pas
Direccin - URL Productos Analito
Abtech Scientific www.affinity-sensors.com www.ambri.com www.appliedbiosystems.com Schaffhauserstrasse 580 8052 Zrich www.biacore.com www.biofutura.com www.biomerieux.com www.biosd.com www.biosensores.com www.biotrace.com www.chemel.com www.iva.usue.ru www.motorola.com www.dkktoa.net www.ibis-spr.nl www.inventus-biotec.com ESensor SPR-20 IBIS iSPR AscoSens cido ascrbico SIRE Politox Uni-lite Bev-Trace OptiSense Technology Vitek Bactometer PerBacco 2000 y 2002 BiacoreQ BIOS-1 Contaminantes Vitaminas hidrosolubles, residuos qumicos y veterinarios, micotoxinas. 8500 Affinity Chip Analyzer AMBRI Biosensor IASys plus e IASys Auto+Advantage S. aureus, Toxina colrica
USA
www.abtechsci.com
ToxSen
Array multi-element clulas completas. Screening de agua on site
Affinity Sensors
Reino Unido
Ambri Limited
Australia
Patgenos como Salmonella y Enterococcus
Applied Biosystems
USA
Artificial Sensing Instruments
Suiza
Biacore AB
Suecia
BioFutura Srl
Italia
Glucosa, fructosa, cido mlico y lctico (fermentacin) Microorganismos Microorganismos Microorganismos y sustancias txicas Sustancias txicas Microorganismos Glucosa, sacarosa, etanol, metanol y lactato Metales pesados Microorganismos y OMGs
Biomerieux
Francia
Biosensor Systems Desing
USA
Biosensores S.L.
Espaa
Biotrace
USA
Chemel AB
Suecia
IVA Co Ltd
Rusia
Motorola (1)
Denki Kagaku Keiki
Japn
IBIS Technologies BV
Inventus Bio Tec
Alemania
(1) Antes Clinical Micro sensor.
75
TABLA 17. Empresas que comercializan biosensores aplicados a la industria agroalimentaria (cont.).
76
Empresa
Pas
Direccin - URL Productos Analito
Jandratek (2) The Manor Manor Royal Crawley West Sussex RH10 2PY UK 3400 Horizon Drive, King of Prussia PA 19406 www.microsens.ch www.moleculardevices.com www.nle-lab.co.jp www.q-sense.com www.reichertai.com www.resrchintl.com Analyte 2000 FAST 6000 Raptor Spreeta ABD 3000 Biosensor Assay System YSI 2700 SELECT Biochemical Analyzer CANARY Reichert SR 7000 SPR-670M,SPR-MACS NANOSENSOR Threshold System MAES-2402 Cloro Microorganismos Detex Malthus 2000 Microorganismos
Alemania
www.jandratek.de
Plasmonic
Malthus Instruments, Ltd
Reino Unido
Molecular Circuitry Inc.
USA
E. coli 0157 Salmonella, Listeria, Campylobacter
Microsens
Suiza
Molecular Devices
Nippon Laser Electronics
Japn
Q-Sense AB
Suecia
Reichert Analytical Instruments
USA
Research International
USA
Protenas, virus, bacterias y esporas Toxinas,virus,bacterias,esporas y hongos Seis analitos simultneamente Alrgenos de cacahuete, antibiticos Etanol, metanol, glucosa, sacarosa, lactosa, L-aas, glutamato, cido ascrbico y oxalato Glucosa, sacarosa, lactosa, L-lactato, galactosa, L-glutamato, etanol H2O2, almidn, glutamina, colina Microorganismos patgenos
Texas Instruments Inc. www.ti.com http://intel.ucc.ie/sensors/universal www.ysi.com www.innovativebiosensors.com www.xantec.com
USA
Universal Sensors
USA
Yellow Springs Instruments Co
USA
Innovative Biosensors, Inc
USA
XanTec Bioanalytics GBR
Alemania
(2) Antes Biotul AG.
CAPTULO 7
Casos prcticos de I+D
A continuacin se detallan tres casos prcticos de grupos de investigacin de la Comunidad Autnoma de Madrid, que se encuentran desarrollando en la actualidad investigaciones en biosensores aplicados a diferentes aspectos de la industria agroalimentaria. La informacin contenida en las fichas es el resultado de la cumplimentacin de un cuestionario por los propios investigadores. En ellas se reflejan los recursos humanos destinados a la investigacin, as como el nivel de experiencia del equipo a travs de las lneas y los proyectos de investigacin ms recientes en que ha desarrollado su trabajo el grupo. Se pretende tambin reflejar la cartera tecnolgica del grupo a travs de las patentes y de la oferta de servicios a empresas. Por ltimo, mediante la relacin de las lneas futuras de inters y de la percepcin sobre las tendencias, se pretende explorar el futuro inmediato de la investigacin en biosensores aplicados a la agroalimentacin.
Institucin
Universidad Complutense de Madrid

Departamento de Qumica Analtica www.ucm.es/info/analitic
Director Jos Manuel Pingarrn Carrazn pingarro@quim.ucm.es
78
1. GRUPO DE INVESTIGACIN
Personal rea de experiencia Formacin
1 Catedrtico 5 Profesores titulares 1 Profesor titular interino 1 Ayudante Doctor 3 Becarios postdoctorales 8 Becarios predoctorales
Deteccin y determinacin de componentes, aditivos y contaminantes en alimentos. Por ejemplo cido lctico en yogures y vinos o colesterol en materias grasas. Determinacin de antibiticos en alimentos de Qumicos origen animal y derivados. Por ejemplo sulfadrogas en leche de vaca. Monitorizacin de patgenos en alimentos.
2. PRINCIPALES LNEAS DE INVESTIGACIN DEL GRUPO

Diseo de biosensores electroqumicos para la deteccin de especies orgnicas de inters ambiental y toxicolgico y de parmetros qumicos en alimentos. Biosensores basados en monocapas autoensambladas y biosensores de ADN. Desarrollo de biosensores electroqumicos para la determinacin de patgenos en alimentos. Empleo de microelectrodos como sensores electroqumicos. Desarrollo de polmeros de impresin molecular como sistemas de preconcentracin y como sistemas sensores para el anlisis de residuos en alimentos. Deteccin electroqumica en electroforesis capilar.
3. PROYECTOS DE INVESTIGACIN FINANCIADOS Y COSTE

Proyecto de investigacin Organismo Coste
79
Diseo y desarrollo de biosensores basados en Ministerio de Ciencia y monocapas autoensambladas y de sensores biomimticos basados en polmeros formados por Tecnologa. Programa Nacional de Biotecnologa. impresin molecular. Proyecto BIO2000-0928. Diseo de nuevos biosensores para la deteccin rpida de microorganismos patgenos y de organismos modificados genticamente en alimentos. Proyecto BQU2003-00365. Evaluation/validation of novel biosensors in real environmental and food samples. QLK3-200001311. Desarrollo de biosensores amperomtricos basados en monocapas autoensambladas para la determinacin de lactulosa y perxido de hidrgeno en leche.
133.666
Ministerio de Ciencia y Tecnologa. Plan Nacional de I+D+I 2000-2003.
CAPTULO 7 Casos prcticos de I+D
182.900
European Comisin.
27.600
Danone/UCM.
6.010
4. PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES

Biosensor amperomtrico compsito para la determinacin de colesterol en alimentos. Nmero de patente: ES2167258 - WO02/12550.
5. TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIN DE BIOSENSORES APLICADOS A LA AGROALIMENTACIN

Control de calidad de productos agroalimentarios para el consumo humano. Control de los procesos de obtencin de los productos agroalimentarios.
6. OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS

Biosensores para la determinacin de perxido de hidrgeno. Biosensores de glucosa y fructosa en mostos y vinos.
Biosensores para la determinacin de cido lctico en yogures y vinos. Biosensores para la monitorizacin de compuestos fenlicos y aminas aromticas en aguas. Determinacin de colesterol en muestras de alimentos (mantequilla, huevos, etc.). Determinacin de aminocidos en alimentos, distinguiendo la forma L- de la D-. Determinacin de etanol y metanol en bebidas alcohlicas. Determinacin de cido benzico en alimentos (refrescos de cola, mayonesa, etc.). Determinacin de propil galato en alimentos (aceite de oliva, caldo deshidratado, etc.).
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7. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIN

La principal limitacin es disponer de objetivos relacionados con problemas analticos reales para desarrollar mtodos analticos especficos que resuelvan problemas de control de calidad y de control del procesado del alimento empleando biosensores electroqumicos.
Institucin
Universidad Autnoma de Madrid

Departamento de Qumica Analtica y Anlisis Instrumental www.uam.es/departamentos/ciencias/quimanalitica/default.html
Directora M Encarnacin Lorenzo Abad encarnacion.lorenzo@uam.es
1 Catedrtico de universidad 2 Titulares de universidad 1 Contratado doctor 1 Ayudante de universidad 3 Becarios predoctorales
Electroanlisis de compuestos orgnicos, en particular frmacos y pesticidas. Desarrollo de biosensores para la determinacin de analitos de inters medioambiental, agroalimentario y clnico. Biosensores para pesticidas, xido ntrico, alcoholes, aldehidos, fructosa, lactato, glutamato, entre otros.
Qumicos Bilogos
81

Desarrollo de sensores y biosensores electroqumicos. Sntesis y caracterizacin de intercaladores de ADN. Anlisis de superficies modificadas con material biolgico.

Desarrollo de electrodos modificados (enzimticos y no enzimticos) para la electrooxidacin cataltica de NAD(P)H y su utilizacin en biosensores y en reactores CICYT (Plan Nacional de I+D) enzimticos con reciclado de cofactores. Electrodos modificados: nuevas estrategias para su utilizacin en qumica analtica. Desarrollo de nuevos electrodos modificados y su aplicacin en qumica analtica: electrodos con superficies de monocapas autoensambladas y sol-gel. Preparacin de immunosensores y electrodos de enzima. Electroanalysis with surface modified ultramicroelectrodes. Biosensores enzimticos para la determinacin de pesticidas organofosforados y carbamatos. Aplicacin de biosensores enzimticos de NADH al control de biorreactores diseados para la utilizacin de deshidrogenasas en procesos de sntesis estereoespecfica. DGICYT (Plan Nacional de I+D)
DGICYT (Plan Nacional de I+D) DGICYT (Ayuda a grupos precompetitivos)
6.010
NATO
CAM
21.035
CICYT (Plan Nacional de I+D). Proyecto coordinado
82
Sensores amperomtricos para la determinacin de xidos de nitrgeno en sistemas biolgicos. Aplicacin CAM en anlisis medioambiental. Estrategias electroanalticas para la determinacin de xidos de nitrgeno: aplicacin en anlisis medioambiental. Desarrollo de biosensores para el reconocimiento de secuencias de DNA. Inmovilizacin orientada de enzimas sobre superficies metlicas: Desarrollo de biosensores. Designed interfacial assembly of redox active enzymes and recognition layers for biosensor applications. Sntesis y caracterizacin de intercaladores multifuncionales de ADN: aplicacin al desarrollo de biosensores.
CAM DGDESEIC (Plan Nacional)
30.050
78.131
DGI (Plan Nacional) National Science Foundation (NSF) USA
92.615
DGI (Plan Nacional)
69.000

Desarrollo de biosensores robustos que permitan medidas en continuo y determinacin de varios analitos simultneamente.

Puesta a punto de mtodos de anlisis selectivos, sensibles y rpidos basados en la utilizacin de biosensores para analitos, de inters agroalimentario, clnico y mediambiental.
6. LNEAS FUTURAS DE INTERS

Nuevas estrategias de inmovilizacin de material biolgico que originen biosuperficies activas y estables. Miniaturizacin de los biosensores y acoplamiento a sistemas microfludicos.
83
7. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIN

Falta de financiacin para personal cualificado que realice el trabajo de investigacin.
Institucin
Universidad de Alcal de Henares

Departamento de Qumica Analtica e Ingeniera Qumica www2.uah.es/dep_qaiq
Directora Elena Domnguez Caas elena.dominguez@uah.es
1 Catedrtica de Universidad 1 Contrato Ramn y Cajal Desarrollo de (bio)sensores 1 Titular de Universidad 1 Tcnico de laboratorio Grupo multidisciplinar por su propia formacin y trayectoria y a travs de las diversas colaboraciones que posee.

Qumica de superficies: modificacin e inmovilizacin controlada de (bio)receptores sobre superficies transductoras. 84 Qumica sinttica. Diseo de mediadores redox para la comunicacin electroqumica entre elementos biolgicos de reconocimiento molecular y superficies transductoras. Desarrollo de sensores catalticos y de afinidad para la resolucin de problemas analticios en tiempo real y con bajo coste en el mbito agroalimentario, medioambiental.

Nuevas tecnologas para el control eficaz de residuos de antibiticos y corticoesteroides en productos agroalimentarios (ARGOS).
Ministerio de Ciencia y Tecnologa. AGL2002-04635-C04-02
100.000
4. PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES

Biosensor para la medida de fructosa, manera de prepararlo y su aplicacin al anlisis de fructosa en productos alimenticios. Josefina Parellada, Elena Domnguez y Vctor M. Fernndez. Espaa: ES2091714. Universidad de Alcal y Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. Mtodo de construccin de electrodos de pasta de carbono. Elena Domnguez, Arntzazu Narvez, Josefina Parellada, y Ioanis Katakis. Espaa, Alemania, Suecia, Reino Unido y Francia: EP0757246 ES2103197. Universidad de Alcal y Universitat Rovira i Virgili-Servei de Tecnologa Qumica. Procedimiento de modificacin nucleoflica de protenas y su aplicacin a la inmovilizacin de las mismas. Elena Domnguez, Guillaume Surez, Arntzazu Narvez. Solicitada en 2004.

Instrumentacin porttil y de bajo coste capaz de discriminar concentraciones admisibles de plaguicidas y en general de compuestos sometidos a legislacin alimentaria o indicativos de calidad y seguridad.
85

Asesoramiento y desarrollo de metodologa analtica.
7. LNEAS FUTURAS DE INTERS

Nuevos elementos de biorreconocimiento molecular. Integracin. Procesamiento de seales.
8. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIN:

Escasa tradicin en innovacin y tranferencia de tecnologa. Inercia y reticencia en nuevas tecnologas analticas. Escalado a nivel de produccin industrial.
CAPTULO 8
Resumen y conclusiones
En agroalimentacin los biosensores se aplican en multitud de reas, algunas de las cuales despiertan un gran inters en nuestros das como sucede con la seguridad y la calidad alimentarias. Estos dispositivos analticos pueden detectar y cuantificar microorganismos y compuestos que afectan a la salud humana y animal y a la composicin y propiedades organolpticas del alimento. Asimismo, permiten la monitorizacin en tiempo real de diversos procesos industriales. En este informe se recogen numerosos ejemplos sobre estos aspectos. En trminos generales, se trata de dispositivos de anlisis que combinan de forma eficaz la especificidad y selectividad que ofrecen las reacciones biolgicas con el altsimo poder de procesamiento de los ltimos desarrollos de la moderna electrnica. Presentan una serie de caractersticas enormemente ventajosas si se comparan, todas ellas combinadas, con las tcnicas de anlisis convencionales (cromatografa, espectrometra, ELISA). Entre estas caractersticas destacan: Selectividad elevada. Son capaces de discriminar compuestos de estructuras qumicas muy similares. Sensibilidad elevada. Detectan sustancias txicas a concentraciones inferiores a los lmites mximos fijados por la ley. Manejo sencillo. No requieren personal cualificado. Automatizables. 88 Miniaturizables. No se necesita llevar a cabo un pretratamiento de la muestra para trabajar con ella. Multianlisis. Detectan varios analitos de forma simultnea. Reutilizables para determinaciones consecutivas gracias a las superficies de interaccin regenerables. Porttiles. Permiten realizar anlisis in situ. Corto tiempo de anlisis. En algunas ocasiones se permite incluso el anlisis en tiempo real. Fabricacin a gran escala con un coste bajo. Si se tienen en cuenta estas caractersticas y la alarma social y los efectos econmicos negativos que desencadenan las alertas alimentarias, cabe esperar que las tecnologas
de biosensores introduzcan cambios importantes en el anlisis de compuestos de inters alimentario. De hecho, el Observatorio de Prospectiva Tecnolgica Industrial (OPTI) estimaba en un estudio realizado en los aos 1999-2000 que el impacto de estos dispositivos sobre el desarrollo industrial sera del 59,15% (control de procesos y productos) para el perodo 1999-2004. (74) Debe considerarse que existen diferentes tipos de biosensores segn los elementos de reconocimiento y los transductores seleccionados, cada uno con unas ventajas y unas limitaciones tcnicas especficas. Y segn las aplicaciones a las que se destinen, los requisitos que se exigen a estos dispositivos son distintos. Por tanto, su viabilidad como sistemas analticos frente a los procedimientos habituales y su posibilidades comerciales varan en cada situacin. La eleccin del dispositivo a utilizar en cada caso depende de tres factores: La naturaleza del analito. Este factor determina la eleccin de un sistema de reconocimiento que garantice la especificidad y sensibilidad necesarias. Las condiciones de uso. Suelen determinar no slo el elemento de reconocimiento sino tambin el sistema de transduccin de seal. Hace referencia a cuestiones como la medida en continuo frente a los dispositivos de un solo uso, a la necesidad de integracin en sistemas de control de procesos y la consiguiente medida en tiempo real, a la necesidad de miniaturizacin, a la necesidad de portabilidad para medidas de campo, etc. Los requerimientos legales. El dispositivo debe cumplir los requisitos recogidos en los reglamentos, disposiciones y regulaciones que especifica la ley en cada caso. En la actualidad existen dos retos tecnolgicos que surgen de la concepcin inicial de los propios biosensores, as como del grado de desarrollo de alguna de las tecnologas implicadas en el proceso y/o su combinacin en el dispositivo final: La propia naturaleza del biosensor limita, en ocasiones, su tiempo de vida til. Los elementos de reconocimiento biolgicos tienen una duracin corta y son sensibles a las variaciones externas. Asimismo, precisan unas condiciones ambientales controladas durante su uso y almacenamiento y su inmovilizacin en la superficie del transductor puede ser problemtica. En cuanto a los sistemas de transduccin las dificultades radican mayoritariamente en el diseo de circuitos de dimensiones reducidas y en el conocimiento de los fenmenos que ocurren a escala de micro y nanmetros junto a la falta de materiales y procesos de fabricacin que cubran ciertas necesidades operativas (mnima interaccin con la muestra, eliminacin de ruidos).
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CAPTULO 8 Resumen y conclusiones
Estos dos retos, definen a su vez dos tendencias en la I+D que pretenden evitar que estas limitaciones tcnicas comprometan el gran potencial de las tecnologas de biosensores en el campo agroalimentario, abriendo el campo de aplicacin de estos dispositivos a la satisfaccin de demandas tradicionales que an no han sido cubiertas. En primer lugar, se pretende optimizar los prototipos desarrollados mediante la miniaturizacin de sus circuitos. Esto permite ensamblar varios biosensores en un mismo chip y disponer de dispositivos porttiles. Tambin se construyen dispositivos con superficies regenerables que llevan a cabo anlisis consecutivos o con capacidad para detectar distintos compuestos de forma simultnea. Igualmente, se trabaja en la bsqueda de nuevos materiales y tcnicas de fabricacin destinados a los sistemas de transduccin.
Otras investigaciones se centran en el estudio de elementos de reconocimiento biomimticos (PIMs, aptmeros y PNAs) que presentan una estabilidad y tiempo de vida superiores a los de los componentes biolgicos. Por otra parte, y de forma complementaria, existen numerosas lneas de investigacin que se ocupan del desarrollo y aplicacin de novedosos procedimientos de inmovilizacin (tcnicas de sol-gel, PPFs, SAMs, BLMs y BMPs). Estas dos tendencias en la investigacin deben ser a su vez complementadas por mayores esfuerzos en los procesos de fabricacin de los dispositivos a gran escala, de forma que se mejore sustancialmente su robustez. Las aplicaciones de biosensores a la industria agroalimentaria abarcan la prctica totalidad de la cadena alimentaria, desde la produccin primaria hasta la distribucin final al consumidor, pasando por los procesos de transformacin, tanto desde el punto de vista de la calidad como de la seguridad alimentaria. Por otra parte la capacidad de procesamiento y tratamiento de la informacin permite su fcil incorporacin a sistemas de informacin integrados. Por todo ello los biosensores suponen herramientas analticas muy verstiles con un enorme potencial de aplicacin a la trazabilidad alimentaria. En este sentido cabe destacar la importancia de la utilizacin de estos dispositivos no slo en los mecanismos de control del proceso productivo, sino tambin en el producto final (envases inteligentes, etc), de suerte que el propio consumidor perciba la utilidad de estas herramientas como un valor aadido del producto, que garantiza la seguridad y calidad del alimento que consume. El mercado de biosensores en la industria agroalimentaria es un mercado en contnua expansin, con una penetracin en el sector todava incipiente, debido fundamentalmente a la inmadurez de los canales de distribucin y a la inercia metodolgica del propio sector. No obstante, se espera que en un futuro inmediato estas condiciones cambien. A medida que los propios canales de distribucin vayan siendo ms giles y el uso de estos dispositivos se vaya extendiendo, se generarn
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nuevas demandas en el sector, tanto para satisfacer sus propias necesidades como para atender a las demandas especficas del consumidor final. Por ltimo, se ha de tener en cuenta que los biosensores no suponen una tecnologa de sustitucin de las tecnologas analticas convencionales, sino que representan alternativas interesantes para demandas concretas. Frente al carcter generalista de tecnologas convencionales como la espectrometra de masas o las distintas cromatografas, con equipos costosos que permiten analizar amplios espectros de compuestos, los biosensores son especficamente diseados para la deteccin y/o cuantificacin de uno o unos pocos analitos, como respuesta a problemas concretos. Esta concrecin del propsito del biosensor permite el diseo de dispositivos a la carta, combinando las diferentes tecnologas implicadas en los elementos de reconocimiento, los sistemas de inmovilizacin y los sistemas de transduccin de seal. Es precisamente esta capacidad de diseo a medida, la que hace deseable y necesaria un implicacin de la industria agroalimentaria, como usuaria final de la tecnologa, en el desarrollo de estos dispositivos.
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CAPTULO 8 Resumen y conclusiones
CAPTULO 9
Anexos
Anexo 1
Patentes
A continuacin se reflejan las patentes ms relevantes de biosensores aplicados a la industria agroalimentaria solicitadas con posterioridad a 2000.
N. de patente US6718077 Ttulo Method and device for the detection of microorganisms by fiber optics Solicitante (Pas) Fundaao Oswaldo Cruz- Friocruz; Universidade Federal do Rio de Janeiro (Brasil) Ao
2004 2004
WO04/025268 EP1398634
Optical biosensors and methods of use thereof Carnegie Mellon University (USA) Biosensor Chemical sensor and use thereof Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities Nitrate sensor Biosensor containing glucose dehydrogenase Matsushita Electric Industrial Co. Ltd (Japn)
Hewlett Packard Development Co. (USA) 2004 Chemel AB (Suecia) Trustees of Tufts College (USA) 2004 2003 2003 2003
US6706160 US6667159 US2003/0232322* US6656702 WO03/093820 EP1356280 US6638752 WO03/069301 WO03/062786 WO03/056345 US6589798
Biomolecule diagnostic devices and method Kimberly-Clark Worldwide Inc. (USA) 2003 for producing biomolecule diagnostic devices Tissue-based water quality biosensors for detecting chemical warfare agents Biodetectors targeted to specific ligands UT Battelle LLC (USA) Xenogen Corp. (USA) 2003 2003 2003 2003 2003 2003 2003 2003 2003 2003 2003 2003
Conductimetric biosensor device, method and Michigan State University (USA) system Biosensor for small molecule analytes Electrochemical biosensors Regenesis (USA) I-Sens Inc. (Corea del Sur)
Method and system for analyte determination Biacore AB (Suecia) Penicillin biosensor Portable biosensor apparatus with controlled Pritest Inc. (USA) flow Enzyme biosensor Biosensor and method for quantitating biochemical substrate using the same Biosensor for detection of toxic substances Optical biosensor with enhanced activity retention for detection of halogenated organic compounds Amperometric biosensor in thick film technology Biosensor Sensor and method for detecting an air borne or exogenously introduced analyte Metabolic biosensor and uses thereof Analytic sensor apparatus and method Biosensor Nucleic acid biosensor diagnostics Process for detection and determination of toxic agents and related biosensor Hoffmann La Roche (Suiza); Roche Diagnostics GmbH ( Alemania) Matsushita Electric Industrial Co. Ltd. (Japn) R.B. Silvert (USA) Colorado State University Research Foundation (USA) A. Adlassnig; J. Schuster (Austria) Duke University (USA) Corning Inc. (USA)
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US2003/0119174* WO03/031562 EP1302545 US6547954 WO03/027680 WO03/025627
WO03/014378 US6521446 US6514402 US2003/0008340* US6503701 US6503381 US6503771 EP1258533
2003 2003 2003 2003
Biosensor Systems Design Inc. (USA) 2003 TheraSense Inc. (USA) UJ Krull; PA Piunno; RH Hudson; A.H Uddin (USA) Tecnav SNC di Marco Antonio Stracuzzi EC. (Italia) 2003 2003 2002
N. de patente US6436651 US6432723 US6387614 WO02/31504 US2002/0028445*
Ttulo Optical diffraction biosensor Biosensors utilizing ligand induced conformation changes
Solicitante (Pas)
Ao
Kimberly-Clark Worldwide Inc. (USA) 2002 Clinical Micro Sensors Inc. (USA) 2002 2002
Methods for using redox liposome biosensors The Regents of the University of California (USA) An analyte detection system Method and device for detecting the toxic and mutagenic effect of chemicals and mixtures of substances Electromagnetic sensor Composite amperometric biosensor for determining cholesterol in foodstuffs Electrochemical biosensors and process for their preparation Sensor for analyte detection
Biosensor Systems Design Inc. (USA) 2002 2002
US6342347 WO02/12550 US6340597 US6322963 WO01/81921 EP1134585 US6254830 JP2001174432 WO01/25472 WO01/14878 WO01/06248 WO01/02827 US6171238 WO00/57166 WO00/46393 US6096497 WO00/43552 WO00/42433 WO00/36416
Biosensor Systems Design Inc.(USA) 2002 Universidad Complutense de Madrid 2002 (Espaa) Saicom Srl. (Italia) 2002
Biosensor Systems Design Inc. (USA) 2001
Use of ink-jet printing to produce diffraction Kimberly-Clark Worldwide Inc. (USA) 2001 based biosensors Biosensor and method for the monitoring of herbicides Magnetic focusing immunosensor for the detection of pathogens Biosensor Biosensor and its use to indicate the status of a product Method and kit for detecting betalactamcontaining compounds Biosensors for monitoring air conditioning and refrigeration processes Biosensor Portable hand-held device with a biosensor Method of determing substrate, and biosensor PH-sensitive amperometric biosensor Electrostatic enzyme biosensor Multifunctional and multispectral biosensor devices and methods of use Method and biosensor for detecting antigen Patterned deposition of antibody binding proteins for optical diffraction-based biosensors Analytic sensor apparatus and method Biosensor for detection of nitrate or nitrite ions and methods of detection of nitrate or/and nitrate ions Biosensor Method for assaying L-phenylalanine and Lphenylalanine sensor High throughput surface plasmon resonance analysis system Consiglio Nazionale Ricerche (Italia) The Board Governors for Higher Education (USA) 2001 2001
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2001 2001 2001 2001 2001 2000 2000
CAPTULO 9 Anexos
Matsushita Electric Ind Co. Ltd (Japn) 2001 Bioett AB (Suecia) Biacore AB (Suecia) Carrier Corporation (USA) Forskarpatent I Syd AB (Suecia) BST Bio Sensor Technologies GmbH (Alemania) Sapporo Immuno Diagnostic Laboratory (Japn) Saicom Srl. (Italia)
Biosensor Systems Design Inc. (USA) 2000 Lockheed Martin Energy Research Co. (USA) Ebara Corporation (Japn) 2000 2000
Kimberly-Clark Worldwide Inc. (USA) 2000
WO00/77522 RU2149182
Biosensor Systems Design Inc. (USA) 2000 British Nuclear Fuels Plc (Reino Unido) Aberdeen University (Reino Unido) Sapporo Immuno Diagnostic Laboratory (Japn) Texas Instruments Inc. (USA) 2000
WO00/14267 WO00/04378 EP0973023 * Solicitud de patente
2000 2000 2000
Anexo 2
Grupos de Investigacin
En este epgrafe se recogen los principales grupos de investigacin espaoles que trabajan en biosensores y tecnologas relacionadas (tcnicas de inmovilizacin, nanomateriales). Se han organizado en dos secciones: equipos de investigadores ubicados en la Comunidad de Madrid y grupos de otras autonomas.
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2.1 Comunidad de Madrid
Universidad de Alcal de Henares (UAH) www.uah.es

Dpto. Qumica Analtica e Ingeniera Qumica, Facultad de Ciencias www2.uah.es/dep_qaiq Tel. 91 8854941. Fax 91 8854971. Correo electrnico dep428@uah.es Investigadora: Elena Domnguez (elena.dominguez@uah.es) Lneas de investigacin: Desarrollo y aplicacin de biosensores para la vigilancia de la contaminacin por plaguicidas y sus productos de transformacin en aguas subterrneas. Desarrollo de biosensores enzimticos para el anlisis de azcares en productos alimenticios.
Universidad Autnoma de Madrid (UAM) www.uam.es

Dpto. Biologa, Facultad de Ciencias www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/default.html Tel. 91 4978339/41. Fax 91 4978344. Correo electrnico biologia@uam.es Investigador: Francisco Legans Nieto (Tel. 91 497 81 76; francisco.leganes@uam.es) Lneas de investigacin: Construccin de biosensores basados en cianobacterias luminiscentes. Dpto. Qumica Analtica y Anlisis Instrumental, Facultad de Ciencias www.uam.es/departamentos/ciencias/quimanalitica/default.html Investigadora: M Encarnacin Lorenzo Abad (Tel. 91 4974488. Fax 91 4974931; encarnacion.lorenzo@uam.es) Lneas de investigacin: Biosensores para reconocimiento de ADN. Grupo de Materiales en lmina delgada y nanomateriales, dpto. Fsica Aplicada, Facultad de Ciencias www.uam.es/departamentos/ciencias/fisapli Tel. 91 4978608. Fax 91 4973969 Investigador responsable: Jos Manuel Martnez Duart. (Tel. 91 4974509; martinez.duart@uam.es) Lneas de investigacin: Nanomateriales para aplicaciones en biosensores.
CAPTULO 9 Anexos
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Universidad Complutense de Madrid (UCM) www.ucm.es

Grupo de ptica Aplicada, dpto. ptica, Facultad de CC. Fsicas www.ucm.es/info/optica Tel. 91 3944555. Fax 91 3944683. Correo electrnico optica@fis.ucm.es Investigador: Eusebio Bernabeu Martnez (Tel. 91 3944553; ebernabeu@fis.ucm.es) Lneas de investigacin: Sensores pticos (resonancia de plasmones superficiales).
Dpto. Qumica Analtica, Facultad de CC. Qumicas www.ucm.es/info/analitic Tel. 91 3944331. Fax 913944329. Correo electrnico depquian@quim.ucm.es Investigador responsable: Jos Manuel Pingarrn Carrazn (Tel. 91 3944315; pingarro@quim.ucm.es) Lneas de investigacin: Biosensores electroqumicos para deteccin de compuestos orgnicos de inters en alimentos, especies orgnicas de inters ambiental y toxicolgico. Biosensores para monitorizacin in situ de contaminantes medioambientales. Desarrollo de PIMs para anlisis de residuos en alimentos. Dpto. Qumica Fsica II, Facultad de Farmacia www.ucm.es/info/QCAFCAII/index.htm Tel. 91 3941750. Fax 91 3942032 Investigador: Enrique Jos Lpez Cabarcos Lneas de investigacin: Aplicacin de micro y nanogeles funcionales en biosensores.
Dpto. Microbiologa III, Facultad de CC. Biolgicas www.ucm.es/info/micro3 Tel. y Fax 91 3944964 Investigadora: Josefina Rodrguez de Lecea (Tel. 91 3944965) Lneas de investigacin: Deteccin de txicos en alimentos mediante biosensor eucariota Tetrahymena termophila. Grupo del dpto. Qumica Orgnica I, Facultad de CC. Qumicas www.ucm.es/info/quimorga Tel. 91 3944231. Fax 91 3944103. Correo electrnico qorgan1@quim.ucm.es Investigador responsable: Guillermo Orellana Moraleda (orellana@quim.ucm.es) Lneas de investigacin: Sensores qumicos y biosensores de fibra ptica.
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Consejo Superior de de Investigaciones Cientficas (CSIC) www.csic.es

Centro Nacional de Investigaciones Metalrgicas (CENIM-CSIC) www.montejava.es/cenim Dpto. Ingeniera de Materiales Investigador: Juan Carlos Galvn Sierra Lneas de investigacin: Materiales nanocompuestos para sensores electroqumicos. Instituto de Catlisis y Petroleoqumica (ICP- CSIC) www.icp.csic.es Grupo de Electro-biocatlisis y Biosensores, dpto. Biocatlisis www.icp.csic.es/biocatalisis.html Investigadores responsables: Vctor M. Fernndez y Antonio Lpez de Lacey (Tel. 91 5854807/4813) Lneas de investigacin: Estudio y diseo de nuevos biosensores (enzimas, anticuerpos, oligonucleticos,...) Inmovilizacin de enzimas sobre electrodos. Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros (ICTP-CSIC) www.ictp.csic.es Dpto. Fotoqumica de Polmeros www.ictp.csic.es/index.php?opc=91 Investigador responsable: Fernando Catalina Lapuente (Tel. 91 5622900, ext. 314; fcatalina@ictp.csic.es) Lneas de investigacin: Sensores fluorescentes de inters aplicado.
Instituto de Microelectrnica de Madrid-IMM, Centro Nacional de Microelectrnica, CNM-CSIC www.imm.cnm.csic.es/principa.htm Grupo de biosensores www.imm.cnm.csic.es/biosensores/home.html Investigadora responsable: Laura M. Lechuga (laura@imm.cnm.csic.es) Lneas de investigacin: Transductores (SPR, optoelectrnicos, nanomecnicos, micropalancas de silicio). Tcnicas de inmovilizacin de receptores biolgicos. Biosensores aplicados al campo medioambiental, qumico, biomdico. Centro Nacional de Biotecnologa (CNB-CSIC) www.cnb.uam.es Grupo de Microbiologa Medioambiental, dpto. Biotecnologa Microbiana www.cnb.uam.es/personal/VDP92456.html Investigador responsable: Vctor de Lorenzo Prieto (Tel. 91 5854500, ext. 4536) Lneas de investigacin: Multisensores para la deteccin de metales pesados.
2.2 Otras Comunidades Autnomas
Universidad Autnoma de Barcelona (UAB) www.uab.es

Grupo de sensores y biosensores, Dpto. Qumica http://einstein.uab.es/_c_gr_gsb Tel. 93 5811976/1836. Fax 93 5812379 Investigador responsable: Salvador Alegret Sanrom (salegret@gsb.uab.es) Lneas de investigacin: Nuevos sistemas de transduccin y de reconocimiento biolgico y qumico. Desarrollo de transductores y tecnologas asociadas de inmovilizacin de materiales biolgicos. Escuela Universitaria Politcnica del Medio Ambiente (EUPMA) www.eupma.edu Tel. 93 5796780. Fax 93 5796785. Correo electrnico info@eupma.edu Investigador responsable: Francisco Cspedes Mulero (Tel. 93 5796783; fcespedes@eupma.uab.es) Lneas de investigacin: Sensores y biosensores biomimticos aplicados al medio ambiente y al sector agroalimentario.
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CAPTULO 9 Anexos
Universidad de Barcelona (UB) www.ub.es

Grupo de Electroqumica de Materiales y Nanotecnologas, dpto. Qumica Fsica www.qf.ub.es/a2/gra2.html Tel. 93 4021240. Fax 93 4021231 Investigador responsable: Fausto Sanz Carrasco (sanz@qf.ub.es) Lneas de investigacin: Funcionalizacin de superficies para el desarrollo de sensores de masa/ biosensores.
Universidad de Burgos (UBU) www.ubu.es

Dpto. Qumica, Facultad de Ciencias www.ubu.es/investig/mem-inve/meminv97/14quim.htm Tel. 947 258854. Fax 947 258831. Correo electrnico quim@ubu.es Investigadora: M. Julia Arcos Mtnez (jarcos@ubu.es) Lneas de investigacin: Biosensores en electroanlisis.
Universidad de Cdiz (UCA) www.uca.es
Dpto. Qumica Analtica Tel. 956 016361/6355. Fax 956 016460 Investigador responsable: Jos Luis Hidalgo-Hidalgo de Cisneros (jluis.hidalgo@uca.es) Lneas de investigacin: Desarrollo y caracterizacin de nuevos sensores electroqumicos basados en la tecnologa sol-gel.
Universidad de Crdoba (UCO) www.uco.es

Dpto. Qumica Analtica, Facultad de Ciencias Investigadora responsable: M Dolores Luque de Castro (qa1lucam@uco.es)
100
Universidad de Granada (UGR) www.ugr.es

Grupo de Control Analtico Ambiental, Bioqumico y Alimentario, dpto. Qumica Analtica www.ugr.es/~ansegura Tel 958 243326. Fax 958 243328. Correo electrnico qanaliti@azahar.ugr.es Investigador responsable: Alberto Fernndez Gutirrez (Tel. 958 243297; albertof@goliat.ugr.es) Lneas de investigacin: Nuevas fases sensoras (tecnologa sol-gel, PIMs) para el diseo de sensores luminiscentes.
Universidad de Mlaga (UMA) www.uma.es

Dpto. Qumica Analtica, Facultad de Ciencias Tel. 95 2131953 Investigadora responsable: Aurora Navas Daz (Tel. 95 2131880; a_navas@uma.es) Lneas de investigacin: Enzimas inmovilizadas sobre geles mediante atrapamiento para biosensores fluorescentes o quimioluminiscentes destinados al anlisis agroalimentario.
Universidad Miguel Hernndez (UMH) www.umh.es

Instituto de Biologa Molecular y Celular. Dpto. Agroqumica y Medio Ambiente http://cbmc.umh.es Investigadora: Carmen Reyes Mateo Martnez (Tel 96 6658469. Fax 96 6658758. rmateo@umh.es) Lneas de investigacin: Diseo y caracterizacin de nuevos biosensores fluorescentes.
Universidad de Oviedo (UNIOVI) www.uniovi.es

Dpto. Qumica Analtica y Fsica, Facultad de Qumica www.uniovi.es/QFAnalitica Tel. 98 5103480. Fax 98 5103125. Correo electrnico quifisan@correo.uniovi.es Investigador responsable: Paulino Tun Blanco (ptb@fluor.quimica.uniovi.es) Lneas de investigacin: Biosensores (enzimticos, PIMs, inmunosensores). Sntesis de PIMs. Sensores basados en tcnicas de luminiscencia y fibra ptica.
Grupo de Materiales Magnticos Amorfos y Nanocristalinos, dpto. Fsica, Facultad de Ciencias Tel. 98 5102897. Fax 98 5103324 Investigadora responsable: Blanca Hernando Grande (Tel. 98 5103317/3323 grande@pinon.ccu.uniovi.es) Lneas de investigacin: Materiales magnticos con aplicaciones en microsensores.
101
Universidad Politcnica de Valencia (UPV) www.upv.es

CAPTULO 9 Anexos
Dpto. Qumica www.upv.es/informa/info/DQ/index_2f200c.html Tel. 96 3877340. Fax 96 3877349. Correo electrnico depquim@upvnet.upv.es Investigador: Juan Soto Camino (Tel. 96 3873431; juansoto@qim.upv.es) Lneas de investigacin: Desarrollo de sensores electroqumicos u pticos para la determinacin de contaminantes en aguas. Centro de Investigacin e Innovacin en Bioingeniera www.ci2b.upv.es Grupo de Inmunotecnologa Investigador responsable: ngel Montoya Baides (Tel. 96 3878356. Fax 96 3877093; amontoya@eln.upv.es) Lneas de investigacin: Desarrollo de biosensores para analitos de inters en biomedicina, industrias agroalimentarias y el medio ambiente. Inmunosensores. Grupo de Bioelectrnica Investigador responsable: Jos Mara Ferrero Corral (Tel. 96 3876066. Fax 96 3877609; jmferrer@eln.upv.es) Lneas de investigacin: Biosensores enzimticos aplicables en la industria del tabaco e inmunnosensores para la industria alimentaria.
Universidad Rovira i Virgili www.urv.es

Centro de Innovacin en Biotecnologa Aplicada DINAMIC Escuela Tcnica Superior de Ingeniera www.etseq.urv.es/dinamic Investigador responsable: Ioanis Katakis (Tel. 977 559655. Fax 977559667; ikatakis@etseq.urv.es) Lneas de investigacin: Biosensores. Transduccin, immunosensores, sensores de ADN, sensores de deshidrogenasa.
Universidad de Sevilla (US) www.us.es

Grupo de Cintica Electrdica e Instrumentacin, dpto. Qumica Fsica www.quimfis.us.es Tel. 95 4557175. Fax 95 4557174 Investigador responsable: Manuel M Domnguez Prez (domingue@us.es) Lneas de investigacin: Desarrollo de monocapas autoensambladas para su aplicacin en biosensores electroqumicos.
Universidad de Zaragoza (UNIZAR) www.unizar.es

Grupo de Espectroscopa Analtica y Sensores, dpto. Qumica Analtica www.unizar.es/geas Tel. 976 761290. Fax 976 761292 Investigador responsable: Juan Ramn Castillo Surez (jcastilo@posta.unizar.es) Lneas de investigacin: Sensores electroqumicos y optoenzimticos. Grupo de Tecnologa de las Comunicaciones, dpto. Ingeniera Electrnica y Comunicaciones http://diec.unizar.es Tel. 976 761948. Fax 976 762111. Correo electrnico sed5008@unizar.es Investigador responsable: Juan Ignacio Garcs Gregorio (Tel. 976 761964, ext. 841964; ngarces@unizar.es) Lneas de investigacin: Sensores pticos para la medida de parmetros de inters medioambiental.
102
Fundacin CIDETEC www.cidetec.es/home.htm

Investigadora responsable: Estbalitz Ochoteco Vaquero (eochoteco@cidetec.es) Lneas de investigacin: Micro y nanogeles funcionales aplicados al diseo de biosensores.
Consejo Superior de Investigaciones Ciencficas (CSIC) www.cisic.es

Instituto de Investigaciones Qumicas y Ambientales (IIQA-CSIC). Dpto. Qumica Ambiental www.iiqab.csic.es Tel. 93 4006100. Fax 93 2045404 Investigador responsable: Dami Barcel Cullers (dbcqam@iiqab.csic.es) Lneas de investigacin: Biosensores para la monitorizacin de contaminantes ambientales. Instituto de Tecnologa Qumica (CSIC-UPV). Unidad Estructural de Productos y Procesos en Qumica Fina www.upv.es/itq/index.htm Investigador responsable: Hermenegildo Garca Gmez (hgarcia@qim.upv.es) Lneas de investigacin: Materiales funcionales en slidos porosos con aplicacin en sensores. Instituto de Microelectrnica de Barcelona, Centro Nacional de Microelectrnica (CNM-CSIC) www.cnm.es Tel. 93 5947700. Fax 93 5801496. Correo electrnico info@cnm.es Investigadores: Francisco J. Muoz Pascual (Tel. 93 5941305; francescxavier.munoz@cnm.es), Jaume Esteve Tinto (Tel. 93 5941104; jaume.esteve@cnm.es) Lneas de investigacin: Microelectrnica para el desarrollo de nuevos sensores. Transductores.
103
CAPTULO 9 Anexos
Anexo 3
Proyectos de Investigacin
A continuacin se detallan los proyectos de investigacin referidos a biosensores y tecnologas relacionadas (inmovilizacin de elementos biolgicos, nanotecnologa, microelectrnica) englobados en el V Programa Marco, de Cooperacin Internacional y aquellos que han recibido ayudas del Ministerio de Ciencia y Tecnologa dentro del Plan Nacional (PN) de I+D+I 2000-2003. (www.mcyt.es/proyectosID/)
Seguridad alimentaria
Xenobiticos
Ttulo Development and field validation of biosensor methods for the assessment of the effects of pollution and solar UV radiation on marine invertebrates. EVK3-CT-1999-00005 (V Programa Marco). Desde 01-02-2000 hasta 31-01-2003. 1.239.477 . Estudio del impacto ambiental de compuestos xenobiticos sobre especies marinas de inters comercial (bivalvos). www.uni-mainz.de Simple methods for determining potent xenobiotics in water and foodstuffs. INTAS-2000-00870 (Cooperacin International). Desde 01-08-2001 hasta 31-07-2004 . Anlisis de diversos compuestos contaminantes (esteroides de accin estrognica, antibiticos) en muestras de alimentos y agua. Intelligent signal processing of biosensor arrays using pattern recognition for characterisation of wastewater: aiming towards alarm systems. QLK3-CT-2000-01481 (V Programa Marco). Desde 01-10-2000 hasta 30-09-2003. 1.387.822 . Estudio de la calidad del agua mediante la deteccin de diversos contaminantes txicos como compuestos fenlicos, metales pesados, etc. Development and risk assessment of a field-based portable biosensor using genetically-modified bioluminescent bacteria. QLK3-CT-2002-02063 (V Programa Marco). Desde 01-02-2003 hasta 31-01-2006. 1.564.004 . Estudio de los contaminantes presentes en suelo y agua a travs de un biosensor que contiene un microorganismo modificado genticamente.
Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin Pgina web Ttulo Referencia Duracin Descripcin
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Ttulo
Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin
Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin
Ttulo Referencia Duracin Descripcin
Achievement of high standards of wine quality using novel chemical and biological sensors. INTAS-2000-00273 (Cooperacin Internacional). Desde 01-08-2001 hasta 31-07-2004. Deteccin de plaguicidas en matrices alimentarias mediante biosensores enzimticos. CE based instrument using Microsystem and Biosensor technologies for bioremediation monitoring Applications. EVK1-CT-1999-00008 (V Programa Marco). Desde 01-03-2000 hasta 28-02-2003. 1.936.430 . Combinacin de distintas tcnicas (electroforesis capilar o CE) con la tecnologa de los biosensores para la monitorizacin de metales pesados y compuestos orgnicos (PCBs y HAPs) en muestras de suelo, vegetales y agua. Automated water analyser computer supported system. EVK1-CT-2000-00045 (V Programa Marco). Desde 01-03-2001 hasta 29-02-2004. 2.555.995 . Desarrollo de un biosensor para realizar estudios de campo sobre la contaminacin del agua.
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Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin Assembly and application of photosystem II-based biosensors for large scale environmental screening of specific herbicides and heavy metals. QLK3-CT-2001-01629 (V Programa Marco). Desde 01-08-2001 hasta 31-07-2004. 1.598.135 . Anlisis de cribado de contaminantes del medio, en concreto, de herbicidas y metales pesados. Tissue engineering of living biosensors to evaluate risks for health by neurotoxic pesticides. QLK4-CT-2002-02264 (V Programa Marco). Desde 01-01-2003 hasta 31-12-2005. 1.607.136 . Determinacin de plaguicidas. Development of single and multi-analyte affinity sensors for rapid detection of adrogen residues in live and post-mortem animals. QLK1-CT-2001-01670 (V Programa Marco). Desde 01-10-2001 hasta 30-09-2004. 1.710.152 . Diseo de biosensores para detectar residuos de anabolizantes en productos crnicos. Analysis of pesticide residuals in foods by immunochemical assay based on surface plasmon resonance. QLK1-CT-1999-51347 (V Programa Marco). Desde 01-09-2000 hasta 31-08-2002. 142.484 . Imunosensor de SPR diseado para el anlisis de un amplio grupo de plaguicidas.
CAPTULO 9 Anexos
Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin
Development of a test kit for the determination of pesticides in foodstuffs. QLK1-CT-2000-41054 (V Programa Marco). Desde 06-07-2000 hasta 05-07-2001. 30.000 . Desarrollo de un kit para la deteccin de plaguicidas mediante un inmunosensor. Sensors for monitoring water pollution from contaminated land, landfills and sediments. EVK1-CT-1999-20001 (V Programa Marco). Desde 01-08-2000 hasta 31-01-2004. 766.800 . Deteccin de compuestos contaminantes en aguas y suelos. www.cranfield.ac.uk/biotech/senspol.htm.
Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin Pgina web
Biotoxinas
Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin Prevention of ochratoxin A in cereals. QLK1-CT-1999-00433 (V Programa Marco). Desde 01-02-2000 hasta 31-10-2003. 2.532.239 . Determinacin de la presencia de toxinas de origen fngico (ocratoxina A) en cereales. Construction of miniaturised free flow electrophoresis (mFFE) incorporating dedicated sensors for real-time analysis of food contaminants. QLK1-CT-1999-00343 (V Programa Marco). Desde 01-02-2000 hasta 31-01-2003. 1.192.111 . Deteccin de diversos analitos (toxinas, microorganismos) a partir de un sistema de electroforesis miniaturizado en combinacin con un biosensor ptico. Detection of algal toxins using piezoelectric crystal biosensor. QLK1-CT-1999-51197 (V Programa Marco). Desde 03-03-2000 hasta 02-03-2002. 112.988 . Determinacin de toxinas marinas.
Ttulo
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Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin
Microorganismos Patgenos
Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin Rapid detection of food-borne pathogens y optical biosensors using lectins. QLK1-CT-2002-51664 (V Programa Marco). Desde 17-12-2002 hasta 16-12-2004. 150.404 . Deteccin de los principales microorganismos patgenos (Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Campylobacter sp., Escherichia coli) en alimentos. Desarrollo de un microsistema biosensor ptico para la medida de toxicidad en agua. Mauricio Moreno Sereno. Universidad Autnoma de Barcelona. DPI2003-08060-C03-03 (PN Diseo y produccin industrial). Desarrollo de nuevos sensores y biosensores pticos para la medida de parmetros de inters medioambiental: Dispositivos, tcnicas e integracin. Juan Ignacio Garcs Gregorio. Universidad de Zaragoza. DPI2003-09735-C02-02 (PN Diseo y produccin industrial). Micro-biosensores electroqumicos de bajo coste conteniendo microorganismos para la determinacin del grado de toxicidad en aguas. Francisco Javier Muoz Pascual. Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. DPI2003-08060-C03-01 (PN Diseo y produccin industrial).
CAPTULO 9 Anexos
Ttulo Investigador responsable Institucin Referencia Ttulo
Investigador responsable Institucin Referencia Ttulo Investigador responsable Institucin Referencia
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Componentes del Alimento

Ttulo Referencia Duracin Descripcin Development of novel electrochemical biosensors for glycoalkaloids determination in foodstuffs and biological samples. INTAS-2000-00151 (Cooperacin Internacional). Desde 01-09-2001 hasta 31-08-2003. Deteccin de compuestos antinutritivos (glucoalcaloides) a partir de un biosensor enzimtico.
Calidad Alimentaria
Ttulo Referencia Duracin Descripcin Monitoring of total antioxidant activity in different beverages using biosensors technology. INTAS-2000-00809 (Cooperacin internacional). Desde 01-08-2001 hasta 31-01-2004. Determinacin de la capacidad antioxidante de ciertas bebidas mediante la cuantificacin de flavonoides polifenlicos.
Enzyme-based detection biosensor. QLK1-CT-2000-40760 (V Programa Marco). Desde 15-05-2000 hasta 14-05-2001. 30.000 . Deteccin de mltiples componentes del alimento (azcares, alcoholes, cidos orgnicos) en distintas matrices (zumos de fruta, productos lcteos, vino). Nanodimensional alcohol biosensor. HPMF-CT-1999-00237 (V Programa Marco). Desde 01-02-2000 hasta 31-01-2001. 85.500 . Determinacin de alcohol mediante la tecnologa de biosensores.
Control de Procesos
Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin Biosensor based device for on line control of wine making. QLK1-CT-2000-41249 (V Programa Marco). Desde 20-11-2000 hasta 19-11-2001. 30.000 . Control on line de la fermentacin en la elaboracin del vino a partir de las medidas de varios compuestos (etanol, glucosa). Novel technology for fermentation process monitoring and quality control of alcoholic beverages based on enzyme electrodes and kits. INTAS-2000-00751 (Cooperacin Internacional). Desde 01-07-2001 hasta 30-06-2004. Control de calidad del producto y monitorizacin en tiempo real del proceso fermentativo en industrias de bebidas alcohlicas. Biosensor based device for on line control of wine making. QLK1-CT-2002-70884 (V Programa Marco). Desde 01-09-2002 hasta 31-08-2004. 1.087.620 . Monitorizacin en tiempo real del proceso fermentativo para la obtencin de vino. Novel technology for controlling wine production and quality. HPRN-CT-2002-00186 (V Programa Marco). Desde 01-09-2002 hasta 31-08-2006. 1.499.883 . Empleo de biosensores para el control de la produccin del vino. Desarrollo de microsensores e instrumentacin avanzada en la monitorizacin de procesos de compostaje. Francisco Cspedes Mulero. Fundacin de Estudios del Medioambiente de Mollet del Valls. DPI2003-08229-C03-02 (PN Diseo y produccin industrial).
Ttulo Referencia Duracin Descripcin
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Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin Ttulo Investigador responsable Institucin Referencia
Rapid assessemnt of food safety via novel at-line measurements. QLK1-CT-2000-00518 (V Programa Marco). Desde 01-10-2000 hasta 30-09-2003. 1.542.418 . Tecnologa de biosensores aplicada al control de procesos como herramienta para mejorar la trazabilidad de los compuestos txicos e integrarse en el sistema APPCC. .
Otras Aplicaciones en Agroalimentacin

Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin DNA biosensor for analytical investigation and labelling in food. QLK1-CT-2001-00876 (V Programa Marco). Desde 01-08-2001 hasta 31-07-2004. 1.729.312 . Identificacin de material gentico de plantas modificadas genticamente en matrices alimentarias.
Otros proyectos de Investigacin

Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin Micro-inductive based biosensor arrays for very high sensitivity detection. IST-2001-33011 (V Programa Marco). Desde 01-10-2001 hasta 30-09-2002. 133.000 . Diseo de un biosensor de alta sensibilidad destinado a diversos campos de aplicacin, entre ellos, el agroalimentario. Towards increased diagnostic sensitivity by assay miniaturisation. HPMI-CT-2002-00214 (V Programa Marco). Desde 02-04-2003 hasta 01-04-2007. 333.000 . Desarrollo de un biosensor de alta sensibilidad y de pequeo tamao. A bioanalytical microsystem based on an optical microchip. IST-2000-28214 (V Programa Marco). Desde 01-06-2001 hasta 31-05-2004. 2.330.000 . Diseo de un prototipo basado en la tecnologa de biosensores (inmunosensor ptico) para aplicaciones biolgicas y clnicas. Development of strain and torque sensors based upon surface acoustic waves technology. G6ST-CT-2000-00209 (V Programa Marco). Desde 20-09-2000 hasta 19-09-2001. 30.000 . Desarrollo de la tecnologa de ondas acsticas de superficie (SAWs) aplicable a biosensores.
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Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin Ttulo Referencia Duracin Coste del proyecto Descripcin
CAPTULO 9 Anexos
Evaluation/validation of novel biosensors in real environmental and food samples. QLK3-CT-2000-01311. Desde 01-10-2001 hasta 31-01-2005. 650.000 . Evaluacin del empleo de nuevos biosensores en muestras reales, efectos de las matrices sobre estos dispositivos, estudio de las tcnicas de fabricacin y diseo de equipos porttiles. Sistemas complejos y sensores fluorescentes. Estudios de estabilidad. Fernando Catalina Lapuente. Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. MAT2003-00119 (PN Materiales). Aplicacin de nuevos materiales compuestos a la construccin de biosensores electroqumicos compactos. Esteve Fbregas Martnez. Universidad Autnoma de Barcelona. MAT2003-01253 (PN Materiales). Desarrollo de nanoestructuras de sol-geles hbridos y de polmeros impresos para la construccin de fases sensoras luminiscentes implementables en nanosensores de aplicacin ambiental. Alberto Fernndez Gutirrez. Universidad de Granada. MAT2003-09074-C02-01 (PN Materiales). De microgeles a nanogeles funcionales: aplicaciones en biosensores y estructuras coloidales conductoras. Enrique Jos Lpez Cabarcos. Universidad Complutense de Madrid. MAT2003-03051-C03-03 (PN Materiales). Nuevos materiales nanocomposites con propiedades bioelectrocatalticas obtenidos mediante qumica combinatoria para aplicaciones en el campo de biosensores. Dimitri Muraviev Muraviev. Universidad Autnoma de Barcelona. BIO2003-06087 (PN Biotecnologa). Generacin y ensayo de distintas formas de anticuerpos en el desarrollo de inmunosensores voltamtricos uni y bianalticos. Francisco Mndez Garca. Universidad de Oviedo. BIO2003-06008-C03-02 (PN Biotecnologa).
Ttulo Investigador responsable Institucin Referencia

Investigador responsable Institucin Referencia Ttulo
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Investigador responsable Institucin Referencia Ttulo Investigador responsable Institucin Referencia
Diseo de materiales nanocompuestos multifuncionales para sensores electroqumicos y recubrimientos anticorrosivos. Juan Carlos Galvn Sierra. Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. MAT2003-03231 (PN Materiales). Diseo y desarrollo de biosensores basados en monocapas autoensambladas y de sensores biomimticos basados en polmeros formados por impresin molecular. Jos M Pingarrn Carrazn. Universidad Complutense de Madrid. BIO2000-0928 (PN Biotecnologa). Desarrollo de analizadores miniaturizados para el control in situ de parmetros de inters medioambiental basados en la integracin de microsensores pticos y electrnicos y microsistemas de gestin. Julin Alonso Chamorro. Universidad Autnoma de Barcelona. DPI2003-09735-C02-01 (PN Diseo y produccin industrial). Materiales funcionales conteniendo huspedes orgnicos incorporados en slidos porosos con aplicacin en fotnica, celdas fotovolticas, mquinas moleculares y sensores. Hermenegildo Garca Gmez. Universidad Politcnica de Valencia. MAT2003-01226 (PN Materiales). Magnetoimpedancia y propiedades de magnetotransporte en materiales nanoestructurados y en nanomateriales con aplicaciones en microsensores magnticos y magnetoelsticos. Blanca Hernando Grande. Universidad de Oviedo. MAT2003-06942 (PN Materiales). Preparacin y caracterizacin de materiales nanoestructurados para aplicaciones en biosensores e ingeniera de tejidos (I). Jos Manuel Martnez Duart. Universidad Autnoma de Madrid. MAT2003-08067-C03-01 (PN Materiales). Sntesis de microgeles y nanogeles funcionales: Aplicaciones en biosensores y estructuras coloidales conductoras. Estbalitz Ochoteco Vaquero. Fundacin CIDETEC-Centro de Investigacin en Electroqumica. MAT2003-03051-C03-02 (PN Materiales).
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CAPTULO 9 Anexos
Investigadora responsable Institucin Referencia Ttulo Investigador responsable Institucin Referencia Ttulo Investigadora responsable Institucin Referencia
CAPTULO 10
Referencias, abreviaturas y glosario
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Referencias
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CAPTULO 10 Referencias, abreviaturas y glosario
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Abreviaturas
ADN ARN BETX BHA BLM BMP cido desoxirribonucleico cido ribonucleico Benceno, tolueno, xileno Butil hidroxianisol Membrana de bicapa lipdica Partcula magntica bacteriana Ensayo de inmunoabsorcin ligado a enzima Onda evanescente Hidrocarburo aromtico policclico Light-addressable potentiometric sensor Transistor de efecto de campo ion selectivo Nicotn-adenn-dinucletido Organismo modificado genticamente Bifenilo policlorado Reaccin en cadena de la polimerasa Polmero de impresin molecular cidos nucleicos peptdicos Pelcula polimerizada por plasma Microbalanza de cristales de cuarzo Monocapa autoensamblada Onda acstica de superficie Resonancia de plasmones superficiales
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ELISA EW HAP LAPS ISFET NAD OMG PCB PCR PIM PNA PPF QCM SAM SAW SPR
Glosario
Alrgeno: sustancia que desencadena una respuesta inmune en el organismo. Amina bigena: molcula obtenida por la transformacin qumica de un aminocido que puede tener efectos adversos sobre la salud. Su presencia se utiliza como indicador de la calidad de ciertos alimentos, principalmente carnes y pescados. Analito: compuesto de inters cuya presencia se desea detectar y/o cuantificar en la muestra sometida a estudio. Anticuerpo: protena sintetizada por el sistema inmunolgico como respuesta a la presencia de una sustancia extraa denominada antgeno a la que se une de manera selectiva. Antgeno: molcula que desencadena la sntesis de anticuerpos por parte del sistema inmunolgico que interaccionan de forma especfica con ella. Bifenilos policlorados (PCBs): conjunto de compuestos peligrosos para la salud sintetizados artificialmente que se han utilizado como agentes dielctricos, fluidos hidrulicos y componentes de plsticos y pinturas. Biosensor: dispositivo compacto de anlisis que se compone de un elemento capaz de reconocer e interaccionar con la sustancia o microorganismo de inters y de un sistema electrnico que permite procesar la seal producida por esta interaccin. Biotoxina: sustancia txica que ha sido sintetizada por un ser vivo. Cofactor: tomo, molcula o elemento de naturaleza no proteica necesario para que se produzca una reaccin qumica catalizada por enzimas. Compuesto xenobitico: cualquier sustancia que no ha sido sintetizada por los seres vivos. En general, este trmino se aplica a compuestos como aditivos, frmacos, plaguicidas, fertilizantes, etc. Dioxinas: conjunto de sustancias de carcter txico originadas como subproductos de diversos procesos industriales (incineraciones, sntesis de plaguicidas, blanqueo de papel, etc). Elemento de reconocimiento: componente de un biosensor con capacidad para reconocer e interaccionar con el analito o microorganismo de inters. Ensayo de inmunoabsorcin ligado a enzima (ELISA): tcnica de anlisis que permite detectar determinadas molculas a partir de su interaccin con anticuerpos especficos. Dichos anticuerpos tienen asociada una enzima gracias a la cual puede registrarse su unin con la sustancia sometida a estudio. Enzima: protena que cataliza o incrementa la velocidad de las reacciones qumicas en los seres vivos. Hidrocarburos aromticos policclicos (HAPs): conjunto de sustancias formadas a partir de la combustin incompleta de materia orgnica (carbn, petrleo, madera, restos animales y vegetales). Estos contaminantes ambientales son potencialmente txicos para los seres vivos. Micotoxina: sustancia txica que ha sido sintetizada por un hongo. Monitorizacin: seguimiento de uno o varios parmetros en un proceso mediante diversos dispositivos y sistemas con el fin de detectar posibles anomalas. Organismo modificado genticamente (OMG) u organismo transgnico: organismo en cuyo material gentico se ha introducido una fraccin de ADN procedente de otro organismo. Esta manipulacin permite obtener un ser vivo con determinadas caractersticas de inters comercial, por ejemplo, un cultivo resistente a ciertos insectos. Transductor o sistema de transduccin: componente de un biosensor que detecta la seal producida por la interaccin del analito o microorganismo de inters y la transforma en una seal elctrica que puede amplificarse, almacenarse y registrarse.
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aplicaciones de biosensores en la industria agroalimentaria

informe de vigilancia tecnolgica

CONFEDERACIN EMPRESARIAL DE MADRID - CEOE

informe de vigilancia tecnolgica

Coleccin coordinada por:

Fundacin para el conocimiento madri+d CEIM

Dra. Elena Domnguez Caas

Dr. Fernando Martn Gordillo

CEIM Direccin General de Universidades e Investigacin

Tecnologas de los biosensores

Aplicaciones de los biosensores en agroalimentacin

Retos y tendencias en tecnologas de biosensores

113 118 119

Referencias Lista de abreviaturas Glosario

CAPTULO 1 Resumen ejecutivo

Otros componentes de la muestra

3.1.1 Sensores Biocatalticos

CAPTULO 3 Tecnologas de Biosensores

3.1.1.2 Clulas Completas

3.1.1.3 Orgnulos Subcelulares

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE TEJIDOS COMO ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO

Inconvenientes Baja sensibilidad. Respuesta lenta. Limitada selectividad.

3.1.2 Sensores de Bioafinidad

3.1.2.3 Clulas Completas

3.1.2.5 cidos Nucleicos

3.1.2.6 Polmeros de Impresin Molecular

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS PIMs COMO ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO

3.1.2.8 cidos Nucleicos Peptdicos

CAPTULO 3 Tecnologas de Biosensores

Celulosa. Gel de slice. Colgeno. Hidroxiapatita. Acetato.

Sencilla. Bajo coste. Matriz regenerable. Sin modificaciones en ER.

Uniones irreversibles de los ER entre s mediante reactivos funcionales.

Tratamiento con sustancias qumicas txicas. No regenerable.

* ER: elemento de reconocimiento.

3.3.1 Transductor Electroqumico

CAPTULO 3 Tecnologas de Biosensores

Corriente generada por la reduccin u oxidacin de especies electroactivas.

Inconvenientes Es necesaria la utilizacin de electrodos de referencia (excepto en los conductimtricos).

3.3.2 Transductor ptico

CAPTULO 3 Tecnologas de Biosensores

3.3.2.1 Sensor de Fibra ptica

FIGURA 4.- Sensor de fibra ptica

3.3.2.2 Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR).

CAPTULO 3 Tecnologas de Biosensores

3.3.2.3 Resonancia de Espejos

3.3.2.4 Onda Evanescente (Ew)

Optrodos (Fibra ptica)

3.3.3 Transductor Piezoelctrico

CAPTULO 3 Tecnologas de Biosensores

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS BIOSENSORES PIEZOELCTRICOS.

3.3.4 Transductor Termomtrico

3.3.5 Transductor Nanomecnico

CAPTULO 3 Tecnologas de Biosensores

Aplicaciones de Biosensores en Agroalimentacin

Otras aplicaciones OMGs. Ciclo reproductivo animal.

4.1.1 Aditivos Alimentarios

CAPTULO 4 Aplicaciones de Biosensores en Agroalimentacin

TABLA 7. Ejemplos de biosensores utilizados en el anlisis de aditivos alimentarios

Biocataltica Biocataltica Biocataltica Biocataltica

Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico

cido benzico (27) Biocataltica

TABLA 8. Ejemplos de biosensores utilizados en el anlisis de frmacos

Levamisol Sulfonamidas Penicilina G Nicarbacina Aminoglucosidos Cloranfenicol Sulphametacina Residuos de -agonistas