TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE

INGENIERA GENTICA
Conjunto de metodologas que permite transferir genes de un organismo a otro y expresarlos (producir las protenas para las cuales estos genes codifican) en organismos diferentes al de origen. ADN recombinante: ADN que fragmentos de organismos diferentes combina

Organismos genticamente modificados (OGM) o transgnicos: organismos que reciben un gen que les aporta una nueva caracterstica se denominan.

TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR

ADN y ARN : las bases al enfrentarse pueden formar enlaces entre s siguiendo siempre la regla: A -T y C-G.

TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR

ADN mas estable que el ARN, por lo cual las tcnicas ms fcilmente manipulables son con ADN.

Enzimas: se usan para cortar y pegar fragmentos de ADN, o para sintetizar fragmentos de ADN. Estas enzimas se mejoran para que trabajen eficientemente en las condiciones de laboratorio.

ENZIMAS USADAS EN BIOLOGA MOLECULAR

- Enzimas de restriccin

DNA polimerasa: replica ADN 5-3 - Transcriptasa reversa: transcribe ARN a ADN - Ligasas
-

ENZIMAS USADAS EN BIOLOGA MOLECULAR

http://www.lourdesluengo.es/animaciones/unidad15/enzimas_restriccion.swf

ETAPAS PARA LA OBTENCIN DE UN OMG

Las etapas son bsicamente cinco: 1- Corroborar que existe un gen que codifica para la caracterstica de inters. 2- Clonar el gen de inters. 3- Modificar el gen para que funcione mejor en el organismo receptor.

4- Transferir el gen al organismo receptor.

5- Caracterizar el organismo receptor transformado.

1- CORROBORAR QUE EXISTE UN GEN QUE CODIFICA PARA LA CARACTERSTICA DE INTERS.

-Cuando se encuentra una caracterstica en un organismo que resulta interesante para transferir a otro organismo debe verificarse que es producto de un gen. -Se identifica el gen de inters por medio de cruzamientos a partir de una caracterstica que se expresa, y se verifican las proporciones mendelianas. -Si la caracterstica se atribuye a una protena, que es producto directo de un gen, ser ms sencillo transferir esa caracterstica a un organismo que no la tiene.

2- CLONAR EL GEN DE INTERS.

La tarea de clonar un gen involucra varias tcnicas:

i)

Extraccin de ADN

ii) Bsqueda de un gen entre la mezcla de genes del ADN iii) Secuenciacin iv) Construccin del vector recombinante.

2.I- EXTRACCION DE ADN -Ruptura de clulas detergente: ruptura de membrana plasmatica proteinasa K degrada protenas EDTA+frio inhibe DNAasas
-Desproteinizacin de la muestra cloroformo-fenol -Purificacin y concentracin precipitacin de ADN con etanol

2.II- BSQUEDA DE UN GEN ENTRE LA MEZCLA DE GENES DEL ADN

Tcnica de PCR (siglas en ingls de Reaccin en Cadena de la Polimerasa) permite amplificar la cantidad de ADN y esto facilita el clonado del gen de inters.

2.II- BSQUEDA DE UN GEN ENTRE LA MEZCLA DE GENES DEL ADN

Electroforesis en gel de agarosa

2.III- SECUENCIACIN

Secuenciacin: consiste en conocer la cantidad y el orden en que se ubican los nucletidos en el fragmento de ADN analizado. Actualmente se realiza en un secuenciador automtico utilizando nucletidos marcados fluorescentemente, que son ledos por un lser acoplado a una computadora.

2.III- SECUENCIACIN

2.IV- CONSTRUCCIN DEL VECTOR RECOMBINANTE

Esta etapa consiste en recortar y pegar ADN para insertar el gen de inters dentro de un vector (son en general molculas de ADN circulares)

Ejemplo: insulina recombinante http://www.lourdesluengo.es/animaciones/unidad15/produccion_insulina.swf

2.IV- CONSTRUCCIN DEL VECTOR RECOMBINANTE

Vectores
- Hospedador
- Funcin Procariota Eucariota Clonado Expresin

- Tipos: - plsmidos - virus - csmidos - fgmidos - YACS, etc.

2.IV- CONSTRUCCIN DEL VECTOR RECOMBINANTE Para tener gran cantidad y fcil disponibilidad del ADN de inters, el vector se inserta dentro de bacterias (E. coli), las cuales crecen fcil y rpidamente Hospedador
Procariota: Ej. Escherichia coli, Bacillus subtillis Fcil de manejar Poca infraestructura Econmico
Eucariota: Ej. Levaduras, clulas de mamferos, clulas de insectos, etc. Modificaciones post-traduccionales Localizacin celular Caro

2.IV- CONSTRUCCIN DEL VECTOR RECOMBINANTE

Seleccin de clones: - complementacin - gen reportero - ATB

3- MODIFICAR EL GEN
Modificar el inserto significa agregarle pequeas secuencias de ADN, mediante el uso de ligasas, necesarias para que el gen funcione correctamente en el organismo receptor.

4- TRANSFERIR EL GEN AL ORGANISMO RECEPTOR El gen de inters se puede introducir en clulas vegetales o animales y dar lugar a la formacin de un organismo genticamente modificado (OGM) o transgnico.

5- CARACTERIZAR EL ORGANISMO RECEPTOR TRANSFORMADO

Una vez obtenido el OGM, se debe demostrar, entre otras cosas, si tiene una (o ms) copias del transgn, y cmo y en qu tejidos se expresa el gen. La PCR es una tecnica rapida que permite amplificar el transgn, si es que est en el genoma del organismo.
Para analizar en qu tejido, momento y cantidad se expresa el gen se analiza la presencia del ARN mensajero y de la protena codificados por el transgn (protena recombinante), mediante tcnicas especficas denominadas Northern blot (para el ARNm), y Western blot y ELISA (para las protenas).

LAS TCNICAS DE SEPARACIN DE LAS BIOMOLCULAS

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

Importante propiedad: actividad

RT-PCR

MTODOS DE TRANSFORMACIN
Bacterias: -Competencia: - CaCl2 , frio y shock trmico (ej: 42 C por 30120 segundos) - electroporacin: shock elctrico (10-20kV/cm)

Levadura y otros hongos -Acetato de Litio/transportador de ADN monohebra/Mtodo del polietilenglicol - Congelamiento/descongelamiento: -Transformacin por biobalstica: Nanopartculas de oro o tungsteno cubiertas de ADN que pueden dispararse a hongos -Transformacin por Protoplasto: las esporas de hongo pueden ser convertidas a protoplastos al remover su cubierta protectora, y luego ser empapadas en una solucin de ADN y ser transformadas.

ACTIVIDAD

- Leer los trabajos de divulgacin cientfica - Identificar las tcnicas de ingeniera gentica usadas y con que objetivo se utilizan

MTODOS DE TRANSFORMACIN Plantas: transformacin mediada por Agrobacterium

MTODOS DE TRANSFORMACIN
Balstica: eficiencia de transformacin es ms baja que utilizando Agrobacterium, pero la mayora de las plantas pueden ser transformadas con este mtodo. Electroporacin

Transduccin (transformacin viral): Se empaca el material gentico deseado en un virus adecuado capaz de infectar vegetales. Si el material gentico es ADN, puede recombinar con los cromosomas para producir clulas recombinantes. La mayor parte de virus vegetales consisten en ARN monohebra, que se replica en el citoplasma de la clula infectada. En este caso es transfeccin, los genes insertados nunca llegan al ncleo celular, y no se integra al genoma del husped.

MTODOS DE TRANSFECCION

Electroporacin Polmeros Liposomas Biobalistica Transduccin

APLICACIONES DE LAS TCNICAS DE BIOTECNOLOGA MODERNA

Vacunas, como la de la hepatitis B Frmacos, como la insulina y la hormona del crecimiento humano Enzimas para disolver manchas, como las que se usan en los detergentes en polvo Enzimas para la industria alimenticia, como las empleadas en la elaboracin del queso y en la obtencin de jugos de fruta

Plantas resistentes a enfermedades.

BIOTECNOLOGA ORNAMENTAL
Desarrollo floral i) Cantidad de ptalos. Se conocen varios genes involucrados en el desarrollo de los ptalos (y de las otros ciclos florales). ii) Color de los ptalos: flavonoides: antocianinas, anaranjado (pelargonidina), rojo (cianidina), azul (delfinidina). carotenoides: naranja/rojo, bronce y marrn betalainas: marfil, amarillo, naranja, rojo y violeta. - claveles de distintas gamas de azul mediante el agregado de genes de sntesis del pigmento delfinidina obtenidos de las flores de pensamiento. - Otras especies, supresin de colores al expresar una forma antisentido del mismo gen endgeno responsable del color que se quiere inhibir.

BIOTECNOLOGA ORNAMENTAL
iii) Retardo de la marchitez o senescencia. Sustancia endgena de las plantas responsable de su marchitamiento es principalmente el etileno, hormona voltil. planta transgnica: inhibicin de la sntesis de las enzimas que participan en la ruta biosinttica del etileno para disminuir la concentracin de esta molcula iv) Planta entera: Ejemplo, aumentando el nmero de hojas por planta y/o acortando la longitud de los entrenudos. Esto ltimo tambin se puede lograr inhibiendo la sntesis o la actividad de la hormona vegetal denominada gibirelina.

ELEMENTOS TRANSPONIBLES

ELEMENTOS TRANSPONIBLES Elementos transponibles en procariotas

Elementos de insercin (IS)

Transposon (Tn)

Compuesto

Simple

ELEMENTOS TRANSPONIBLES

Elementos transponibles en eucariotas

clase 1 la movilizacin necesita una molcula copia de ARN

clase 2
la movilizacin es directa

ELEMENTOS TRANSPONIBLES

Elementos transponibles

Replicativo

Conservativo

queda una copia en el lugar original, y una nueva copia en un sitio nuevo del genoma (copiar y pegar).

el elemento transponible es removido de su ubicacin original, y luego integrado en un sitio nuevo del genoma (cortar y pegar).

ELEMENTOS TRANSPONIBLES Herramientas para la Biotecnologa

El criterio bsico para evaluar la aplicabilidad de un transposn en un sistema dado depender de: i) que el elemento transponible sea movilizable eficientemente en el organismo de inters, ii) que se conozca cmo y dnde es la insercin de los elementos transponibles.

ELEMENTOS TRANSPONIBLES Herramientas para la Biotecnologa -Herramienta para la transformacin gentica -Modificados para su utilizacin en el campo de la genmica funcional

MARCADORES MOLECULARES
Marcadores Moleculares: -sealadores de diferentes regiones del genoma -permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos -sealan tanto regiones codificantes como no-codificantes del genoma. Un marcador ideal debe ser: altamente polimrfico o variable dentro y entre especies de herencia mendeliana no episttica (sin interaccin entre genes) insensible a los efectos ambientales de rpida identificacin y simple anlisis de posible deteccin en los estadios tempranos del desarrollo.

MARCADORES MOLECULARES

MARCADORES MOLECULARES
Marcadores basados en la hibrididacin del ADN
RFLP VNTR

MARCADORES MOLECULARES
Marcadores basados en la amplificacin del ADN

MARCADORES MOLECULARES
Marcadores mixtos

MARCADORES MOLECULARES
Ventajas de las tcnicas basadas en ADN para caracterizar e identificar individuos
Utilizando varios marcadores a la vez, se puede identificar a un individuo de entre billones de otros individuos. Las tcnicas acopladas a PCR, permiten trabajar con poca cantidad de muestra inicial. Las tcnicas basadas en ADN, pueden utilizarse sobre prcticamente cualquier tipo de muestra biolgica. La molcula de ADN es mucho ms estable en el tiempo que las protenas, y esto permite utilizar muestras que han estado sometidas a fuertes cambios (de pH, temperatura, solventes, etc).

MARCADORES MOLECULARES