BACTERIAS ANAEROBIAS DE IMPORTANCIA CLINICA

Evelyn Rodrguez Facultad de Microbiologa, UCR

Por qu son importantes?

Flora bacteriana humana predominante Causan infecciones e intoxicaciones serias, con frecuencia fatales Patgenos oportunistas En asocio con infecciones por aerobios

Requerimientos de O2 para crecer

Aerobios: 15-21% Microaeroflicos: 5-10% Facultativos: 0-21% Anaerobios: 0%. Segn puedan soportar O2

Obligados: < 0.05% Moderados: 0-5% Tolerantes: 0---?%

Toxicidad del oxgeno

O2 + e- O2- radical superxido O2 - + e- + 2 H+ H2 O2 + e- + H+

H2 O2

Perxido de hidrgeno

Radical hidroxilo (los macrfagos y PMN usan esos derivados para destruir patgenos)

H2 O + OH.

Proteccin contra los txicos del O2

Superxido dismutasa:
2O2- + 2 H+

H2 O2

(dismunye el radical superxido )

Catalasa:
2 H2 O2 2 H2 O + O2

Peroxidasa:
H2 O2 + Sust. reducido H2 O + sust oxidado

Vitamina E, C, glutatin

Anaerobios y Presencia de O2
Los e-disponibles para reacciones metablicas se dirigen a reducir el O2 :
E disponible para sntesis Efecto bacteriosttico (reversible) Efecto bactericida

Se forman los derivados txicos

Flora normal predominante en humanos

Piel Tracto respiratorio Boca Intestino Uretra Vagina Propionibacterium BG- CGCG+, CG-, BGBacteroides, Clostridium, Bifidobacterium Peptostretococccs. Bacteroides, BGLactobacillus, Peptostreptococus

Infecciones por anaerobios

Aprox. 99% de tipo endgeno Asociadas a una mucosa cerca del sitio anatmico de la infeccin Llegada de anaerobios a sitio diferente, muerte de los anaerobios muy estrictos, crecimiento de facultativos y predominio de anaerobios menos estrictos Factores de virulencia Flora mixta: 3-4 anaerobios

Factores que predisponen las infecciones por anaerobios

Trauma

De piel De membranas mucosas

Irrigacin sangunea deficiente Necrosis de tejidos Disminucin del potencial de Redox

Sospechas de infeccin por anaerobios

Historia de mordeduras, cirugas, extracciones dentales, otros Infeccin en proximidades de superficies mucosas Tratamiento previo con aminoglicsidos, trimetoprn-sulfa, algunas quinolonas Olor ftido Presencia de gas Coloracin negruzca Florescencia roja con UV Presencia de grnulos de azufre Morfologa en tincin de Gram Ausencia de crecimiento en aerobiosis

Frecuencia de anaerobios en muestras clnicas

Bacteroides Cocos G+ Propionibacterium Clostridium Fusobacterium Otros

Anaerobios de importancia clnica

Tincin de Gram
Gram positivos

Cocos

Bacilos

Peptostreptococcus Peptococcus

Con esporas

Sin esporas

Clostridium

Actinomyces Bifidobacterium Eubacterium Lactobacillus Propionibacterium

Anaerobios de importancia clnica

Tincin de Gram
Negativa

Cocos

Bacilos

Veillonella

Bacteroides Fusobacterium Porphyromonas Prevotella

1. Seleccin de muestras
Todas las muestras que se contaminen con las bacterias de la flora normal deben ser rechazadas:

Torunda de garganta o nasofaringe o cualquier sitio de la mucosa oral Esputo expectorado Lavados bronquiales Torundas vaginales, cervicales o uretrales Torundas de abscesos Heces o torundas rectales* excepto para C. difficile

Aspirados
Cualquier aspirado de un sitio normalmente estril es aceptable. Desinfeccin adecuada del sitio con aguja y jeringa. NUNCA con torunda Se debe expulsar el aire que quede en la jeringa (cuidado con aerosoles) Transporte rpido al laboratorio (tapn de hule estril) o inoculacin de medios PRAS

Abscesos
Con aguja y jeringa, NO con torunda. Si son profundos deben ser aspirados con catter o por procedimientos quirrgicos Si son orales, se asla la zona con algodn y se limpia con torunda y alcohol. Luego se aspira con aguja

Ulceras superficiales
Desinfeccin del sitio y debridacin del tejido expuesto (por flora aerobia contaminante) Coleccin del material en la zona profunda de la lcera Si la lcera es purulenta, se puede aspirar el material

Desinfeccin de heridas

Toma de muestra
Con torunda Con jeringa

Con cureta

Secreciones del tracto respiratorio

Las colectadas a travs de la cavidad oral NO son aceptables para anaerobios Se requieren procedimientos quirrgicos o invasivos con agujas o catteres que lleguen hasta los sitios deseados

Muestras del Tracto Genitourinario

Aspiracin suprapbica (orina) Aspiracin de abscesos Culdocentesis (para obtener muestras del saco vaginal) Succin de la pared endometrial Procedimientos quirrgicos Lavados (no muy adecuada)

Tejidos
Cualquier muestra de tejido obtenida por ciruga es adecuada para anaerobios pequea, se debe inocular en un medio sin oxgeno grande, se coloca en placa de Petri y se procesa rpido. Si se dispone de bolsas de anaerobiosis se puede tardar ms tiempo

2. Transporte de muestras
Siempre a temperatura ambiente Nunca en la jeringa:
Con aguja es muy riesgoso Sin aguja se puede perder el material Si el tiempo es corto se puede usar tapones de hule

Medios de transporte PRAS (ideal)

En medios de transporte

En medios PRAS Torundas en medios semislidos

3. Procesamiento de muestras
Idealmente en cmara anaerbica Examen macroscpico de la muestra:

Es adecuada? Se ha desecado? Tiene mal olor? Fluoresce con luz UV? Se observa el tejido necrtico? Se ven grnulos de azufre? Es purulenta?

3. Procesamiento de muestras
Examen microscpico:

Fijacin del frotis con metanol 30 seg y no con calor Tincin de Gram con fucsina bsica 0.5% Tipo y nmero de microorganismos Identificacin presuntiva en algunos casos Sugiere el tipo de medios de cultivo a emplear Presencia de leucocitos * Control de calidad

Observaciones:

Bacteroides Prevotella Porphyromonas

Fusobacterium

Clostridium

Propionibacterium Actinomyces Bifidobacterium Eubacterium

Veillonella

Peptostreptococcus

3. Procesamiento de muestras
Muestra

Ex directo

En medio lquido (PRAS)

En Platos

Microscpico

Macroscpico

AS suplementado con Vit K y hemina Medios selectivos segn tincin de Gram

Medios para aerobios

Incubacin anaerobia

Medios selectivos para anaerobios

BBE: grupo Bacteroides fragilis y Bilophila Gentamicina (inhibicin de aerobios) Bilis (inhibicin de otros anaerobios) Esculina y hierro (colonias negras de B. fragilis)

AS BBE Grupo B. fragilis

BBE

B. fragilis vrs. B. vulgatus

Bilophila

Medios selectivos para anaerobios

KVLB: Bacteroides y Prevotella

Kanamicina (inhibicin de aerobios y otros anaerobios G-) Vancomicina (inhibicin de G+) Sangre lisada (pigmento de Prevotella)

KVLB Prevotella

AS

Medios selectivos para anaerobios

PEA: crecimiento de anaerobios Feniletilacohol (Inhibicin de aerobios y del swarming, La morfologa de anaerobios es similar a la de AS

Clostridium septicum

4. Inoculacin
Previa homogeneizacin de la muestra

5. Incubacin
Cmara de anaerobiosis Incubadora, para medios PRAS (sellados) Evacuacin y reemplazo Jarra o bolsas de anaerobiosis 2 a 3 hr para lograr anaerobiosis NUNCA abrir la jarra antes de 48 hr Incubar de 5 a 7 das, hasta 3 semanas (Actinomyces)

Qu sugiere el crecimiento de anaerobios en placas de cultivo?

Mal olor: Fusobacterium Clostridium,Porphyromonas Morfotipos coloniales presentes en anaerobiosis y ausentes en aerobiosis Swarming extenso C. tetani, C. septium, Clostriium sp.

Qu sugiere el crecimiento de anaerobios en placas de cultivo?

Doble hemlisis en AS C. perfringens

Fluorescencia roja con UV Prevotella, Porphyromonas

Qu sugiere el crecimiento de anaerobios en placas de cultivo?

Colonias caf oscuro Prevotella, Porphyromonas Peptostreptococcus niger Ennegrecimiento y buen crecimiento en BBE grupo Bacteroides fragilis

Qu sugiere el crecimiento de anaerobios en placas de cultivo?

Colonias lecitinasa + en AYH C. Perfringens y otros

Colonias lipasa + en AYH C. botulinum, C, sporogenes, C. novyi

6. Identificacin
Aislamiento en cultivo puro
Morfologa colonial Tincin de Gram

Prueba de tolerancia al O2

1. AS + CO2

2. AS + anaerobiosis

Si 1>2: facultativo Si 1<2: anaerobio

Identificacin presuntiva: B, CB G+
esporas

SI: Clostridium

NO: catalasa

Morf. Gram

+: Actinomyces Propionibacterium Eubacterium

-: Morfologia colonial

irregular swarming col. gdes Clostridium

regular sin doble hemlisis Actinomy, Propion. Lactobacillus

doble hemlisis C. perfringens

Morf. Gram

Identificacin presuntiva: B G- o variables

esporas

S: Clostridium

NO: Fluroscencia UV o colonias negras

Porphyromonas Prevotella

NO: sensib a vancomicina

Sensible Clostridium

Resistente BG-: Fusobacterium Bacteroides

Morf. Gram

Identificacin presuntiva: cocos

Gram positivos

Gram negativos

Peptostreptococcus Peptococcus niger

Morf. colonial

Veionella

Importancia de la identificacin presuntiva

Puede indicar la fuente probable de una infeccin:

Bacteremia por :
Clostridium: problemas de colon Porphyromonas: lesiones de cavidad oral Bacteroides: origen intestinal

Ayuda en la escogencia de antibiticos Base de datos que permita conocer la importancia de los agentes en determinados procesos

Identificacin presuntiva (nivel II)

Morfologa colonial Tincin de Gram Susceptibilidad a Kanamicina, Vancomicina Colistina Catalasa, indol, nitratos, urea, movilidad

Identificacin presuntiva (nivel II)

Grupo
Kanamicina 1000ug Vancomicina 5ug Colistina 10ug

Gram Gram +
B. Grupo fragilis B. ureolyticus *** Fusobacterium Porphyromonas Prevotella Veillonella

V V R S S R R S

R* S** R R R S R R

V R R S S R R S

Identificacin presuntiva nivel II: CG+

Sodio polianetil sulfonato (SPS) 10000 ug Peptostreptococcus anaerobius Otros cocos G + S R

Identificacin definitiva
Tubos convencionales (PRAS) Por pruebas bioqumicas miniaturizadas

API 20A

Sistemas de identificacin basados en EZ preformadas:

API ID 32, RAPID ANA II, Vitek ANI Card

Cromatografa de gases Cromatografa de gas lquido alta resolucin (anlisis de c. grasos celulares)

Tratamiento de las infecciones por anaerobios

1. Limitar la proliferacin de anaerobios: Drenar, debridar, eliminar obstruccin, liberar el gas atrapado, mejorar la circulacin, oxigenar, ciruga. 2. Impedir que la infeccin se extienda a tejidos sanos: Tratamiento con antibiticos. 3. Neutralizar las toxinas.

TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO
Generalmente emprico Con base en el sitio y tipo de infeccin:

Endocarditis: slo bactericidas Abscesos cerebrales: no clindamicina porque no atraviesa barrera hematoenceflica

Penicinilinas, Cefalosporinas, Imipenem, Clindamicina, Metronidazol, Cloranfenicol PSA

PSA Bacterias anaerobias: Cundo debe hacerse?

NO de rutina Si el m.o. aislado es conocido como resistente:

grupo Bacteroides fragilis B. gracilis Fusobacterium Bilophila

- Clostridium perfringens - C ramosum, C. innocum - C. clostridioforme

Si la infeccin persiste despus de tratamiento emprico. Si no hay datos precedentes de sensibilidad (c/6 meses) En infecciones severas En tratamientos prolongados Evaluacin de nuevos antimicrobianos

Resistencia mltiple en CR, grupo Bacteroides

Aislamientos: 34 Antibiticos probados: 16
Resistencia a nmero frecuencia 14 AB 1 3% 12 AB 2 6% 11 AB 1 3% 9 AB 1 3% 8 AB 5 14% 10/34 (30%) de las cepas fueron resistentes a la mitad de los AB probados

PSA Bacterias anaerobias Idealmente, segn tipo de muestra

Infecciones del SNC Endocarditis Osteomielitis Bacteremia Implantes Infeccin de articulaciones

Mtodos PSA-Bacterias anaerobias

Dilucin en agar: REFERENCIA (NCCLS) agar Brucella, con sangre lisada y vitamina K. una placa para cada antibitico en cada concentracin Inculo estandarizado como KB incubacin anaerobia no es prctico interpretacin en tablas especficas para anaerobios Caro, difcil. No se hace en CR

Mtodos PSA-Bacterias anaerobias: Dilucin en caldo

Micro o macromtodos Varios caldos:

Caldo Brucella + hemina + vit K West-Wilkins ICC, otros

Pocillos de microdilucin comerciales y determinar la MIC Slo si hay buen crecimiento en el control sin AB

Sistemas automatizados (VITEK)

Mtodos PSA Bacterias anaerobias Epsilomtrico o E test

Inculo 0,5 McFarland Medio de cultivo AS u otros Una tira y una placa por antibitico Incubacin: anaerobiosis 2448-72 hrs Interpretacin: MIC en la misma tira Caro ($300 c/paq de 100ud)
_

Mtodos PSA Bacterias anaerobias ATB ANA (casa Biomerierux

( estudios recientes lo equiparan al mtodo de referencia, No validado) ATB impregnado en las celdas inculo: 3 Mc Farland Incubacin: anaerobiosis 24-48 h Interpretacin: dos conc. si crece en ambas es R si crece en la mayor es I si no crece en ninguna es S No todas las bacterias crecen bien, en cuyo caso NO se puede interpretar Caro? ($10 cada tira).

Importancia clnica: BG+ esporulados (Clostridium)

1. Ttanus: C. tetani
Ampliamente distribuido en el suelo: hasta en 54% (7/% en Meseta Central, 43% en UCR). Presente en aguas, sedimentos e intestinos de animales Contaminacin de la herida con esporas Contaminacin fecal del cordn umbilical (Ttanos neonatal) Disminucin del potencial de oxidorrecduccin Germinacin y produccin de tetanospasmina, Inhibicin de neurotransmisores y rigidez muscular

C. tetani, cont.
P.I.:7 das (1-54) Sntomas en mandbula (risa sardnica), cuello, espalda, faringe, dificultad respiratoria y muerte. Vacuna DPT Diagnstico: clnico*, de lab: BG+, esporulados (pocas veces), sarwming en AS, toxigenicidad en ratn Tx: toxoide Casos en CR: s, (pocos), ttano neonatal

Importancia clnica: BG+ esporulados (Clostridium)

2. Gangrena gaseosa o mionecrosis: C. perfringens (80%), C. hystoliticum, C. septicum, C. novyi, C. bifermentans.
Heridas contaminadas, traumas o cirugas Invasin y necrosis licuefactiva de msculo Produccin de exotoxina mionecrtica potente y de rpida accin Diagnstico: BG+, esporulados o no en las muestras Debridacin Amputacin No hay registros en CR

Importancia clnica: BG+ esporulados (Clostridium)

3. Botulismo: C. botulinum
Distribucin mundial en suelos, ambientes acuticos, e intestinos de aves y mamferos. Conglomerado de especies fenotpicamente diversas Productoras de la exotoxina ms letal que se conoce: neurotoxina botulnica (1 X 108 LD 50 ratn/mg)

C. botulinum, cont.
parlisis flcida aguda bilateral que inicia en cara, cabeza, faringe y desciende simtricamente a trax y extremidades muerte por fallo respiratorio (parlisis de la lengua, msculos de faringe, diafragma e intercostales) Diagnstico: Identificacin de la toxina especfica en:
Suelo Heces Alimento Aspirado gstrico Suero

Cultivo de C. botulinum e identificacin de toxina

1. Botulismo clsico
Alimentos en conserva (hortalizas y frutas), pasteles, papas asadas (USA, tipoA)
Coccin inadecuada

Embutidos, Europa, tipo B Pescado, Japn, tipo E

Sobrevivencia de esporas

Germinacin y multiplicacin Produccin de toxina Ingestim de toxina preformada en alimentos

PI 12-36 h, hasta das

INTOXICACION

2. Botulismo intestinal

Ingestin de esporas
Germinacin y multiplicacin en intestino Produccin de toxina en intestino

INFECCIN, con produccin de toxina

2. Botulismo intestinal
Forma ms comn de la enfermedad (USA) Nios < 1 ao (94% < 6 m meses) o adultos con alteraciones en anatoma y flora intestinal Estreimiento, intranquilidad, prdida de control de cabeza, hipotona (beb laxo) fallo respiratorio. 5% de casos de muerte
benigna Muerte repentina
sbita Letalidad de 1% en hospitalizados

3. Botulismo por heridas

Esporas en suelos
Germinacin y multiplicacin en herida

Produccin de toxina in situ

Similar a ttano

Se ha relacionado con drogas endovenosas

Clostridium boulinum, Costa Rica (23%)

Jicaral Barranca Mata de Limn Pitahaya Paquera Chirrip Parismina Aislamientos Suelos toxigncicos

Qu pasa en Costa Rica?

Casos en CR? Condiciones para que se den? Uso de conservas en CR? Papel de C. perfringens en suelos? 58% de las cepas con efecto inhibitorio sobre C. botulinum 2 cepas de 38 inhiban la produccin de toxina

Importancia clnica: BG+ esporulados (Clostridium)

4. Txicoinfeccin: C. perfringens
Patgeno ms abundante en la naturaleza Presente en casi todo material expuesto al polvo, incluyendo alimentos (< 5 x 102 esporas/da) 103 a 108 UFC/g de heces en nios desde 6 meses hasta adultos

4. Txicoinfeccin: C. perfringens (cont.)

En CR:

88% en suelos

46 % de carnes cocidas en restaurantes 44 % de embutidos a base de carne de cerdo (chorizo, salchichn y mortadela) 93% de ganado vacuno, 55% de carne en canal, 61% a 75% de carne procesada o molida en el expendio y 3 % restaurantes

4. Txicoinfeccin: C. perfringens (cont.)

Carnes y derivados
Coccin inadecuada Sobrevivencia de esporas Germinacin y multiplicacin Recalentamiento inadecuado Ingestin de 105-108 cl/g Esporulacin en intestino

enterotoxina

Diarrea, clico y nuseas

4. Txicoinfeccin: C. perfringens (cont.)

Aparicin repentina de clicos, diarrea y nusea (generalmente sin vmitos ni fiebre) PI: 7 a 15 hr. Leve, de corta duracin (menos de 24 hr) Segunda causa de enfermedad asociada a alimentos en USA, slo precedida por Salmonella. Diagnstico:

Datos epidemiolgicos sugestivos Aislamiento de al menos 105 cl/g alimento o 106/g en heces Determinacin de enterotoxina en heces o en cepas aisladas

Importancia clnica: BG+ esporulados (Clostridium)

5. Diarrea asociada a antibiticos, colitis seudomembranosa, diarrea nosocomial : C. difficile AB:ampicilina, clindamicina y cefalosporinas
Aislado de suelos, paja, heces. Parte de la flora normal 50% en nios < 1 ao 3% en nios > 2 aos 1.9% (Suecia) a 15.4% (Japn) en adultos 21% en pacientes hospitalizados con alta prevalencia de C. difficile, 1/3 con sntomas.

C. difficile, cont.
Proliferacin de C. difficile por alteracin de la flora normal. Producin de toxinas A y B (enterotoxina y citotoxina) y factor de alteracin de la motilidad Diarrea y necrosis del colon

Importancia clnica: BG+ no esporulados

1. Actinomycosis: Actinomyces, Bifidobacterium, Eubacterium y Propionibacterium)
Infecciones oportunistas, parte de flora normal Infeccin granulomatosa crnica, con fstulas que drenan en la superficie pus y grnulos de azufre. Comn en regin orofacial, tambin en cerebro, regin pleuropulmonar y rganos genitales Morfologa microscpica en material purulento: Dx presuntivo

Importancia clnica: BG+ no esporulados

2. Vaginosis bacteriana: Mobiluncus (Bacteroides, Peptostreptococcus, Gardnerella)
Flujo anormal y maloliente, infeccin ms profunda hasta tero. Partos prematuros y otras complicaciones De difcil cultivo, morfologa microscpica caracterstica (BG positivos curvos)

3. Abscesos, bacteremias, infecciones de heridas, peritonitis, etc.

Importancia clnica: BGGrupo Bacteroides fragilis, Prevotella, Porphyromonas y Fusobacterium. Generalmente de la flora normal Infecciones mixtas:

Tejidos blandos Orales, abdominales, respiratorias, etc Abscesos Peritonitis Bacteremias Infecciones sistmicas

Grupo Bacteroides fragilis

Patgeno ms frecuente en infecciones humanas Fuente usual: flora normal fecal Abscesos cerebrales, pulmonares, infecciones intraabdominales e intraplvicas, peritonitis. 20 a 30% de las infecciones por anaerobios 25% de los aislamientos de anaerobios en el HSJD: 35% de abscesos, 30% de secreciones, 17% de cavidad abdominal.

Importancia clnica: Cocos

Gram positivos:

Peptostreptococcus anaerobius Peptococcus niger ( > importancia veterinaria) Abscesos cerebrales,orales, pulmonares, genitales, etc.

Gram negativos:

Veillonella (habitante de cavidad oral). Infecciones en cabeza, cuello, dentales y pulmonares, heridas por mordeduras