INGENIERA GENTICA

1.- INTRODUCCIN
La ingeniera gentica puede definirse como un conjunto de tcnicas, nacidas de la Biologa molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo. La ingeniera gentica es una tcnica que consiste en la introduccin de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos. Se realiza a travs de las enzimas de restriccin que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extrao un ADN receptor. Por ejemplo, la integracin de un ADN vrico en un ADN celular. La ingeniera gentica incluye un conjunto de tcnicas biotecnolgicas, entre las que destacan: y y y la tecnologa del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro. La secuenciacin del ADN: Tcnica que permite saber el orden o secuencia de los nucletidos que forman parte de un gen. la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el nmero de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mnima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio. las aplicaciones de la ingeniera gentica: Son numerosas las aplicaciones prcticas y comerciales de la ingeniera gentica. Entre esas aplicaciones destacaremos: a) O de obtencin de organismos genticamente modificados    Microorganismos genticamente modificados Animales transgnicos Plantas transgnicas

b) Terapia gnica c) Clonacin reproductiva d) Clonacin teraputica e) Proyecto genoma humano Se abre un campo que nos ofrece adems la posibilidad de utilizar plantas y animales transgnicos as como microorganismos modificados genticamente para producir frmacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtencin de nuevas vacunas o la clonacin de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto perjudicial que un uso inadecuado podra provocar en el ser humano y en el propio planeta.

2.- TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE (Obtencin de fragmentos de ADN)

Esta tecnologa nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevar adems el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las clulas de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podr "expresar" la informacin de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricacin de insulina, lo que haramos al ponrselo a una bacteria es "obligar" a sta a que fabrique la insulina. Por lo tanto en la tecnologa del ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas bsicas:

Por enzimas de restriccin

1. Corte especfico del ADN en fragmentos pequeos y manejables mediante la utilizacin de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restriccin que pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres, siendo lo caracterstico de ellas estos dos principios: o o Cada enzima de restriccin reconoce una secuencia especfica de nucletidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN. Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restriccin. En los siguientes dibujos puede verse como actuaran estas enzimas.

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restriccin. Se aprecia la actuacin en ambas hebras.

En este esquema se ve el resultado de la actuacin de la enzima de restriccin. Ha quedado rota la molcula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente. Los fragmentos obtenidos se pueden separar por tamaos -es decir, segn el nmero de pares de nucletidos que llevan- mediante la tcnica de electroforesis

Por retrotranscriptasas
Esta tcnica se emplea para obtener fragmentos de ADN correspondientes a un gen estructural. Si se conoce la secuencia de aminocidos de una protena en cuestin, consistira en sintetizar in vitro el ARNm correspondiente, o bien aislar de la clula el ARNm deseado, a partir del cual y por medio de la transcriptasa inversa se sintetizara el ADN correspondiente

3. INSERCIN DE LOS FRAGMENTOS DE ADN.

Esta insercin se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las clulas hospedadoras. Los vectores de clonacin son pequeas molculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las clulas hospedadoras. Se utilizan como vectores de clonacin pequeos elementos genticos tales como: plsmidos, virus y cosmidios Para realizar la unin del fragmento deseado al vector escogido, este deber ser fragmentado por la misma enzima de restriccin empleada para obtener el fragmento. Ello origina que los extremos de uno y otro fragmento tengan los extremos cohesivos formados por bases complementarias, lo que provoca la hibridacin, es decir, la unin de esas zonas de ADN por complementariedad de bases, unindose luego los extremos mediante una ADN-ligasa . y Plsmidos. Son molculas de ADN circular, con un tamao menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicacin.

En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la insercin de un gen en un plsmido. En la figura a tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plsmido (color turquesa) Figura a

En la figura b, vemos como una enzima de restriccin ha cortado el gen y el plsmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.

Figura b La unin del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonacin, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molcula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

Figura c y

Bacterifagos. El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vrico (figura d) Posteriormente se ensamblarn las distintas partes del virus (figura e). As quedar el virus completo(figura f). En el siguiente paso se insertar este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIN.

figura e figura d y

figura f

Transduccin. Este mtodo consiste en introducir el ADN en la clula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonacin el genoma del virus. En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El nmero 1 corresponde al virus aproximndose a una bacteria. Se puede observar cmo lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la clula bacteriana.

Csmidos . Son plsmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un borde cohesivo procedente del genoma del fago lambda (extremo cos)y se empaqueta en el interior de un fago. Se construye el csmido uniendo los tres elementos gnicos, y el resultado final es poder introducir en la clula receptora fragmentos largos de ADN.

Adems del origen de replicacin, los vectores de clonacin deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las clulas que contienen el vector de clonacin. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibiticos y genes de bioluminiscencia. y Genes de resistencia a antibiticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonacin, porque estas bacterias sern resistentes al antibitico del gen marcador.

Genes de luminiscencia.. En este caso, la clula que contenga el gen que se quiere clonar, tendr la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa caracterstica. Este sistema se emplea cuando la clula hospedadora es una clula eucariota.

4. OBTENCIN DE MULTIPLES COPIAS DE ADN

Clonado del ADN. Una vez que se ha conseguido la poblacin de bacterias transformadas, (recuerda que llevan adems del gen de inters un gen por ejemplo de resistencia a un antibitico por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina), por lo que las bacterias que se consideran transformadas, sern aquellas que sobrevivan.

El siguiente paso es poner a las bacterias en un medio de cultivo apropiado para que se multipliquen. A la vez que se reproducen las bacterias lo hace tambin el plsmido con el gen que interesa, el resultado es que se obtiene un clon de clulas que llevan todas ese gen de inters. Se pueden formar por tanto diferentes clones con genes de inters para el hombre. Este conjunto de clones se denomina biblioteca genmica.

5. DETERMINACIN DE LA SECUENCIA DE NUCLETIDOS.

Otra tcnica propia de la Ingeniera Gentica es la determinacin de la secuencia de nucletidos de un ADN, conocida como secuenciacin de dicho cido nuclico. Se ha conseguido gracias a las enzimas de restriccin y a la posibilidad de obtener numerosas copias de un cido nuclico por clonacin. Se pueden conseguir muchos fragmentos , de diversos tamaos y lo que se trata es de recomponer la molcula original como si se tratase de un puzle. As se han secuenciado genes, desde virus hasta el genoma humano. El mtodo ms usado para la secuenciacin es el conocido como tcnica de terminacin de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conocindose actualmente como la tcnica del didesoxi. Se denomina as por ser necesario los didesoxirribonucletidos (figura 1), que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'. En la figura 2 vemos un nucletido normal con el grupo alcohol en el carbono 3'.

Figura 1

Figura 2

Como los nucletidos se unen por este grupo OH del carbono 3', hay que pensar que si nos encontramos con un didesoxinucletido ser imposible que se una otro nucletido y la cadena terminar aqu. Figura 3 (Es necesario tener esto presente para comprender la tcnica del didesoxi)

Figura 3

Abreviadamente, ste sera el mtodo a seguir: Como la tcnica se basa en la sntesis de ADN, para hacer la reaccin de secuenciacin se necesita: y Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar.

Como "cebador" para iniciar la sntesis, se necesita un corto oligonucletido complementario del extremo de la cadena.

y y

desoxinucletidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP. didesoxinucletidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciacin.

Al aadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerizacin en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucletido (Figura 4).

Figura 4 Se produce un conjunto de cadenas dobles cuyas longitudes dependen de la situacin del didesoxinucletido incorporado. En el caso expuesto en el dibujo, esta reaccin de

secuenciacin se hace con un didesoxi de ADENINA, lo que significa que cuando se incorpore esta Adenina no podr continuarse la polimerizacin de nuevos nucletidos, nos queda por tanto un pequeo fragmento de ADN que termina en la ADENINA, lo que nos dice que en el ADN original, en ese lugar estar el nucletido complementario que lleva TIMINA. En el caso expuesto deducimos tres fragmentos con 5, 10 y 14 nucletidos (sin contar el cebador) en cuyos extremos tenemos ADENINA, nos permite interpretar que en el ADN original, en esas situaciones tendremos TIMINA. Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciacin, cada una con un didesoxi distinto . Los fragmentos resultantes se separan por tamao mediante electroforesis, se autorradiografan, y la sucesin de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparndolas entre s, dan la secuencia del ADN. (Figura 5)

Figura 5

6. Aplicaciones de la ingeniera gentica

y Obtencin de organismos genticamente modificados Microorganismos genticamente modificados
Son microorganismos (bacterias) que contienen un gene procedente otro organismos o transgen. Este microorganismo se emplean en:

Mejora del medio ambiente. Empleo de microorganismos para eliminar la contaminacin ambiental, biorremediacin:

 Eliminacin de hidrocarburos (mareas negras), de metales pesados y de plsticos Produccin de biocombustibles (biodiesel e bioalcoholl). Productos industriales, farmacuticos e mdicos: o Encimas que degradan substancias, como las de los detergentes. o Antibiticos, como a tetraciclina y la penicilina. o Protenas humanas empleadas en medicina, como el interfern, la insulina humana, la hormona del crecimiento y el factor antihemoflico.

 
Animales transgnicos

Los animales transgnicos llevan en sus clulas algn gen procedente de otro organismo. El transgen, que fue obtenido media la tecnologa de ADN recombinante, insertase en el ADN del animal hospedante mediante diferentes mecanismos, por ejemplo, por microinyeccin en un vulo fecundado

Plantas transgnicas
A ingeniera gentica en vegetales tiene como objetivo transferir genes en las plantas a partir de muchos tipos de organismos distintos, simulando cruzamientos que jams se realizaran en la naturaleza, obteniendo nuevas y tiles variedades vegetales. Para introducir nuevos genes en una planta pueden emplearse diferentes procedimientos. Uno es emplear un plsmido, llamado Ti, que es un vector natural presente en la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens

Mediante las tcnicas de ingeniera gentica conseguirnos plantas transgnicas con fines muy diferentes: Resistencia contra herbicidas o plagas que permiten reducir la necesidad de fumigar los campos de cultivo con productos qumicos. Resistencia a las heladas, la sequia o al exceso de acidez y salinidad del suelo. Atrasar la maduracin. Se desarrollan plantas que producen frutos que al madurar no empodrecen. Mejorar o valor nutritivo de las plantas empleadas en la agricultura. Ejemplo, plantas que producen arroz amarillo con provitamina A y que en el cuerpo humano se convierte en vitamina. Producir substancias de inters farmacolgico

y Terapia gnica
La terapia gnica tiene como objetivo tratar, curar y prevenir enfermedades producidas por un solo gen defectuoso introduciendo en el paciente un gen teraputico o funcional. La insercin del gen funcional pretende sustituir el gen defectuoso y reparar una anomala gnica , o bien proporcionar a esas clulas una nueva funcin que cubra las insuficiencias presentadas por las clulas de un tejido determinado. Hay varios tipos: Terapia xnica somtica,intntase corregir la enfermedad tratando solo algunas clulas del cuerpo de la persona enferma, a las que se les introduce el gen teraputico. Este mecanismo se puede llevar a cabo de dos formas diferentes: yTerapia in vivo, introduciendo los vectores directamente en la persona enferma por va sangunea, que solo son reconocidos por las clulas diana. As se consigue modificar los genes defectuosos en todas las clulas de una determinada lnea celular. yTerapia ex vivo, se extraen clulas del enfermo y se cultivan y se exponen al virus portador del gen y tras la modificacin mediante la insercin del gen funcional vuelven a inyectarse en el cuerpo del paciente para que desempeen su funcin normal. Terapia gnica de la lnea germinal, consiste en introducir clulas transgnicas en un vulo fecundado, el gen teraputico formar parte del cdigo gentico de todas las clulas del cuerpo

y Clonacin reproductiva
La biotecnologa actual permite crear clones de animales gracias a una tcnica que se conoce como clonacin reproductiva. Esta tcnica consiste en eliminar el ncleo de un vulo de un animal donador y sustituirlo por el ncleo de una clula somtica procedente del animal que se quiere clonar, mtodo denominado transplante nuclear. As, se crea un embrin artificial que posteriormente se implanta en el tero de una hembra de la misma especie para que finalice su desarrollo embrionario. El organismo que se obtiene es genticamente idntico al individuo del que procede el ncleo de la clula somtica empleada Puede usarse para obtener descendientes de individuos muy seleccionados.

y Clonacin teraputica.

La clonacin teraputica o con fines curativos, no persigue la obtencin de un individuo viable si no producir un tipo de clulas denominadas clulas madre embrionarias, que pueden mantenerse en cultivo y utilizarse con fines teraputicos. La Clonacin teraputica, para alcanzar la verdadera capacidad tecnologca, tendria que conseguir reconstruir adems de tejidos complejos, rganos o algunas de las partes con total funcionalidad.

o Obtencin de clulas madre

Son clulas indiferenciadas que pueden dividirse indefinidamente produciendo nuevas clulas madre y en determinadas condiciones, diferenciarse en uno o varios tipos de clulas especializadas( clulas musculares, sanguneas, hepticas .) Poden ser de varios tipos:

yClulas madre embrionarias son clulas pluripotentes, aunque por si mismas no pueden dar origen al organismo completo (precisan de la placenta), son el origen de todos los tipos celulares y tejidos del individuo adulto. Se forman a partir del cigoto, que es la nica clula totipotente capaz de generar, a travs de sucesivas divisiones celulares, el nuevo individuo y toda la variedad de cientos de clulas diferentes del nuevo organismo. yClulas madre adultas (AST). Se encuentran en una gran cantidad de tejidos del organismo adulto, como la sangre y la piel. Su principal funcin es substituir las clulas que mueren dentro de un rgano o tejido. Son clulas multipotentes, capaces de originar muchos tipos celulares, pero no todos

Muchas de las tecnologas basadas en el ADN se estn empleando en el conocimiento del genoma completo de la especie humana. El genoma humano es el conjunto de todos los genes que posee nuestra especie distribuidos entre los 23 pares de cromosomas que tenemos en nuestras clulas En 1990 comenz formalmente el Proyectos Genoma Humano (PGH) ideado para localizar secuenciar y estudiar la funcin de todos los genes humanos, con un plazo de realizacin de 15 aos. En el ao 2003 fue rematado un borrador inicial del genoma y el PGH se dio por rematado dos aos antes de los estipulado. Que es lo que descubri el PGH? Cuales son sus futuras aplicaciones prcticas? y El genoma humano contiene unos 35000 genes, muchos menos del milln que se esperaba y El 5% del genoma esta casi desierto y Los genes no estn extendidos regularmente por los cromosomas, existe largos espacis vacios entre un gen y otro y Tan solo el 5% del ADN humano contiene genes portadores de instrucciones para sintetizar proteinas y Una gran parte de nuestro ADN procede de virus y bacterias que en algn momento infectaron los antepasados de nuestra especie. Por lo menos 223 de nuestros genes pueden tener origen bacteriano y La diferencia entre dos personas es tan solo del 0.01%, esto significa que entre dos personas se comparte el 99.99% del mismo ADN. y El nmero de nuestros genes es semejante al nmero de genes existentes en el chimpac y en el ratn y no es muy superior al nmero presente en invertebrados como la lombriz de tierra o la mosca del vinagre El remate del PGH marca el comienzo de una nueva era, la era del genoma en la medicina y en la salud. El conocimiento de nuestro genoma puede ayudar a identificar genes que causan enfermedades hereditarias y a desarrollar nuevas formulaciones para su prevencin y tratamiento

y Proyecto genoma humano