P-53

P-53 Se descubre en 1979 oncogen (forma mutada e inactiva ) Gen supresor de tumores Integridad genmica Control en la progresin del ciclo celular Sobrevida celular

P-53

Presenta varias isoformas (N-p53 carece dominio N terminal ( 40/47kDa) Actua como inhibidor dominante negativo de la Full Lenght p53

IRES ( internal ribosomal entry sites ) Iniciacion de la traduccion CAP independiente (1988 picornavirus) Union directa de subunidad ribosomal 40s en un sitio interno sobre mRNA Se define por su funcion Tiene codon de iniciacion AUG Utilizacion de factores de iniciacion (ITAF )

IRES ( internal ribosomal entry sites )

Se reconoce a traves de ensayos utilizando construcciones bicistronicas Dos genes reporteros bajo un mismo promotor ( luciferasas ) Entre ambos la zona de probable IRES El primer reportero se va a traducir utilizando la estructura CAP,luego hay STOP Si encuentro el producto del segundo mensajero es que esa secuencia es un IRES

Los autores proponen que la traduccion en ambas isoformas se realiza a traves de dos IRES 5 UTR para full-lenght Protein coding region para (N-p53 Con distinta actividad en el ciclo celular

Objetivo:

Identificacion de las secuencias IRES Ubicacin en la secuencia completa del gen P-53

MFOLD algoritmo : estructuras secundarias 134 nt 5 UTR 5 251 nt

Metodo : Transcripcion In Vitro Plasmido monocistronico GFP gen reportero ( downstream ) RNA polimerasa T7 Presencia / ausencia de analogo de CAP

Metodo:

Transfecciones utilizando construcciones monocistronica DNAs 5251 y 134 nt P-53 RNAm de sangre de individuos sanos Clonado en el vector pCDNA 3 con GPF HCV IRES - GFP

Al agregar analogo de CAP : No inhibe la traducccion del +39 Inhibe parcialmente la 1 Si inhibe a la GFP - CAP

resultado

Con o sin analogo de CAP se observa traduccion Estos resultados indican que el p53+39 y 1 permiten el inicio de la traduccion CAP independiente ( dos sitios IRES )

Objetivo: comprobar que el inicio de la traduccin de la protena P53, se realiza mediante IRES, en el extremo 5 UTR. Material y mtodos: se utilizo plasmidos bicistronicos, con 2 genes reporteros Rluc y Fluc, promotor y secuencia P53 +1, P53 +39.

2da Hiptesis: descartar que las secuencias 5UTR P53, no se Realiza a travs de la lectura ribosomal Cap dependiente. 2do plasmido denominado PrDEp53(+39) y PrDEp53(+1), Se agrego secuencia regulatoria del virus de la encfalo miocarditis que inhibe la traduccin por CAP y un control interno con PrDEF

Luego se descarto la traduccin del 2do cistron, colocando el EMCV Rio arriba

resultado
La traduccin de P53 (+39) y P53(+1) se realizo a partir del IRES en la posicin 5UTR.

3ra hiptesis: descartar que la traduccin mediada por p53 (+39) es independiente de la mediada por p53 (+1). Material y mtodos: se utilizo plasmidos con construcciones Bicistrnicas, mutando a +1 ATG por AAG. Y un control WT p53 AAG

resultado
no se encontr cambios significativos de la actividad Fluc, comparada con WT. Ambos genes se traducen de manera independiente

objetivo

Descartar la posibilidad de que la actividad Fluc del ADN bicistrnico p53 (+39) sea debida a la presencia de sitios splice o promotores crpticos

Metodo

Tranfeccion: RNA celulas Hela transfectadas con plasmidos bicistronicos con ensayo con luciferasa Infeccion con virus vaccinia ( con promotor T7) en contrucciones eucarioticas sin promotor Sincronizacion: Despues de 24 hs , nocodazole G2/ M o Timidina en fase S

Metodo
RT-PCR dos primers P1 P2 P3 P4 3 RLUC 3 FLUC 5 RLUC 5 FLUC

Northern blot P-53 (+39 ) P-53 (-1 ) CVB3 IRES Control FLUC ARN

resultado

Observaron presencia de ARN bicistrnico completo y no pequeos ARN Demostraron que los cistrones eran parte de una transcripcin nica

Pero hay actividad Fluc posiblemente por pequeas cantidades de transcriptos monocistrnicos generados por el segundo cistrn , no detectados por estos anlisis de ARN

Metodo

Transfeccin de clulas Hela con plsmido bicistrnico pBS-Rp53(+39) que carece de promotor eucariota pero tiene promotor T7 Demuestra la ausencia de promotores crpticos en la secuencia 5UTR p53 que lleve a la transcripcin de ARN Fluc Infeccion con virus vaccinia ( T7 ARN polimerasa )

En presencia del virus vaccinia fue alta la actividad de Fluc y Rluc El control null negativo mostr actividad de Rluc pero es no activo sin este virus El cociente entre Fluc y Rluc del ARN bicistrnico capeado que contiene 5UTR de p53 (+39) y (-1) se incrementa comparado con el control de ARN bicistrnico que carece de secuencias de p53

El cociente entre Fluc y Rluc del ARN bicistrnico capeado que contiene 5UTR de p53 (+39) y (-1) se incrementa comparado con el control de ARN bicistrnico que carece de secuencias de p53

Se investig la actividad de los IRES que median la traduccin de N-p53 y de p53 completa en las diferentes fases del ciclo celular. Para ello se trasfectaron clulas HeLa con plsmidos bicistrnicos pRp53(+39)F (regula Np53) o pRp53(-1)F (regula p53 completa) Las clulas fueron detenidas en la transicin entre la fase G2 y M con Nocodazole.

REGULACIN DE IRES DE P53 DEPENDIENTE DE LA FASE DEL CICLO CELULAR

Se liber el bloqueo del ciclo celular Se evalu la actividad de luciferasa en diferentes tiempos para cada uno de los vectores Se evalu el ciclo celular en diferentes tiempos mediante citometra de flujo

RESULTADOS

La actividad de luciferasa de p53(+39)IRES (regula N-p53) fue mxima a las 24 hs. Coincide con el mayor nmero de clulas en fase S (citometra de flujo-24 hs) Sugiere que la actividad de p53(+39)IRES es mxima durante la progresin a fase S El nivel de la proteina N-p53 alcanza su punto mximo en fase S

RESULTADOS

La actividad de luciferasa de p53(-1)IRES (regula p53 completa) fue mxima a las 0 hs y a las 42 hs Coincide con el mayor nmero de clulas en la transicin entre G2 y M (citometra de flujo-0 hs y 42 hs) Sugiere que la actividad de p53(-1)IRES es mxima durante la transicin entre G2 yM

El experimento se repiti bloqueando el ciclo celular en G1 mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

Discusin

La traduccin mediada por IRES es un mecanismo alternativo de iniciacin de la traduccin del mRNA celular Constituye una forma de regulacin de la expresin gnica bajo diferentes condiciones fisiolgicas

Discusin

El gen p53 juega un rol fundamental en la progresin del ciclo celular Cumple funciones de checkpoint en G1/S y G2/M La isoforma (N-p53 se encuentra altamente expresada en el comienzo de la Fase S Puede facilitar la transicin G1-S por G1inhibicin de la actividad wild-type p53 wild-

Discusin

Este trabajo demostr que el incremento de la actividad del IRES en la transicin G1-S resulta en altos G1niveles de (N-p53 Esto provoca un efecto negativo sobre la actividad del gen completo de p53 La isoforma (N-p53 es resistente a la degradacin mediada por Mdm-2 Mdm-

Discusin

La traduccin del gen completo p53 mediada por IRES, muestra una alta actividad en la transicin G2-M G2Este es un mecanismo alternativo de sntesis de protenas Sera responsable de sntesis de niveles basales de p53

Discusin

La traduccin del gen completo p53 mediada por IRES es baja G2-M G2Pequeos aumentos en la sntesis del gen completo p53 seran degradados por MdmMdm-2 Este mecanismo permite la progresin a la siguiente fase del ciclo celular

Discusin

Este trabajo propone la existencia de dos IRES que mediaran en la traduccin de dos isoformas diferentes de la misma p53 Los autores no descartan la existencia de un solo IRES en p53 mRNA La iniciacin de la traduccin podra darse a nivel de dos codones diferentes

Discusin

La interaccin de diferentes ITAFs con IRES celulares, es un importante mecanismo de regulacin de la iniciacin de la traduccin Varias protenas, includa la misma p53 interactan con el extremo 5UTR de p53 mRNA

Discusin

La interaccin de p53 con 5UTR inhibe la traduccin de p53 mRNA Es una funcin de control autoregulatorio negativo

Discusin

La produccin de p53 mRNA es alta en G1G1-S, pero alcanza su pico mximo en la mitad de Fase S Esto sugiere que la proporcin relativa de p53 y (N-p53 puede ser decisiva en la regulacin de la traduccin de p53

Discusin

Altos niveles de (N-p53 producidos en la transicin G1-S por la actividad de G1(+39) IRES, puede prevenir la unin de fullfull-length p53 al extremo 5UTR De esta manera se permite la produccin de full-length p53 en medio de la Fase S full-

Discusin

La sntesis de niveles suficientes de fullfull-length p53 que interacta con 5UTR del mRNA: - Inhibe la traduccin - Genera un feedback negativo - Permite el ingreso a la fase G2/M del ciclo celular

Discusin

Este modelo sugiere una intrincada regulacin de la expresin del gen p53 por interacciones de la protena-RNA protenaEsto sucede para permitir la progresin normal del ciclo celular, mediante controles checkpoints de dicho ciclo ante un dao del DNA

Discusin

Recientemente, otras dos protenas, la protena ribosomal L26a y la Nucleolina demostraron interactuar con p53 5UTR, modulando as la traduccin Ambas protenas tambin interactan con IRESs virales

Conclusiones

Estudios futuros sobre el rol de stas y de otras protenas interactuantes p53p53IRES podrn proveer informacin sobre la regulacin de la expresin del gen p53 en condiciones fisiolgicas y de stress