REQUERIMIENTOS PARA LA REPLICACIN

DNA molde (DNA template) dNTP: dATP, dGTP, dCTP y dTTP Enzimas : DNA polimerasa, RNA polimerasa (primasa), Topoisomerasas, Helicasas Protena Rep Protenas de unin la DNA (SSB = protena de unin al DNA de hebra simple) Primer (o cebador) Magnesio -

Procedimiento

3'

RNA polimerasa (PRIMASA) 10-20 ribonucleotidos Primer o cebador

DNA polimerasa 5' 3'

5' 3'

5' 3'

Fragmentos de OKASAKI lazo o asa (loop, bucle)

5'

3'

5' 3'
Fragmentos de OKASAKI

5'

DNA ligasa

Cada DNA hijo tiene el 50% del DNA padre (estos hechos fueron dilucidados por Meselson y Sthal)

REPLICACIN EN EUCARIONTES Ocurre de manera similar en organismos procariotas y eucariotas, existen algunas diferencias, dada la mayor complejidad y tamao del genoma eucaritico. Velocidad de alargamiento: En el cromosoma de E.coli la velocidad de alargamiento es de 1000 nt/sg, en eucariotas como levaduras es de aproximadamente 60 nt/sg, en Drosophila de 40 nt/sg y en ratn de 30 nt/sg. Origen de replicacin: Debido a la existencia de mltiples replicones en el genoma eucaritico existen tantos orgenes como replicones hay. Ejemplo, en levadura existen 500 replicones, en Drosophila 3500, en ratn 25000 y en plantas 35000. Replicacin tiene lugar durante la fase S del ciclo celular. Los fragmentos de Okazaki son mas cortos. Los cebadores estn compuestos por RNA (aproximadamente 10 bases) y DNA (iDNA, aproximadamente 20-30 bases). Enzimas involucradas en el proceso En eucariotas se han encontrado diez clases de polimerasas, algunas participan en la replicacin del DNA (las polimerasas a, d, e nucleares, g mitocondrial) y otras estn involucradas en mecanismos de reparacin del material gentico (polimerasas b, h,i,z y k)

CONTROL DE LA REPLICACIN EN EUCARIOTAS El control de la replicacin esta intimamente ligado al ciclo celular, ya que cada clula hija ha de tener la misma cantidad de DNA que la madre. Existen diferentes niveles de control ya que la replicacin solo se da en la fase S y puede tener duracin variable en diferentes clulas. Por tanto debe haber un acoplamiento entre replicacin y divisin celular de manera que solo puede iniciarse una ronda de replicacin por divisin celular. Deben existir controles para que: Solo ocurra replicacin en la fase S Determinar cuantos orgenes estn activados a la misma vez Los orgenes de replicacin que se estn activando lo hagan siguiendo un patrn determinado para cada tipo de clula (primero se activan unos, luego otros, pero siempre son los mismos los que se activan primero y despus). La mayor parte de las clulas eucariticas se dividen por mitosis y la replicacin del DNA se lleva a cabo solo en la fase S. Antes de esta se encuentra G1 y despus G2. Si existen condiciones adversas para el buen funcionamiento de la clula como la falta de nutrientes, el ciclo se para en G0 y la clula entra en estado de quiescencia o reposo. En la fase G1 se comprueba que las condiciones ambientales son favorables y le permiten continuar a fase S. En G2 es donde se comprueba que la clula esta bien, que el DNA se ha replicado completa y correctamente y la clula entra en mitosis. La clula no se divide hasta que se asegura que la descendencia va a estar en condiciones adecuadas. Existen tres puntos claves de regulacin: Control G1, Start: punto de no retorno que hace que la clula entre en fase S. Control G2: hace que la clula entre en mitosis. Final de la fase M, que hace que la clula entre en G1. Los dos primeros estn regulados por una pareja de protenas: Ciclina (subunidad reguladora) Quinasa (subunidad catalitica) Esta pareja de protenas es la que dispara la fase S o la M. Por ejemplo, en levaduras la quinasa se une a diferentes ciclinas para ser activa, de ah su nombre Cdk (kinasa dependiente de ciclina). Cuando la quinasa esta activa fosforila una serie de sustratos que disparan determinados mecanismos que estan relacionados con el comienzo de la fase S o M. Los niveles de ciclinas, como su nombre lo indica, varan a lo largo del ciclo celular, las ciclinas G1 aumentan a lo largo de la fase G1 hasta que alcanzan un mximo (punto Start), momento que da lugar irreversiblemente al inicio de la fase S, o sea, es un punto sin retorno; durante la fase S disminuyen los niveles de ciclinas G1 y aumentan los de ciclinas mitticas; cuando las ciclinas mitticas llegan a su mximo se dispara la fase M.

TELOMEROS
cromosomas eucariticos son molculas de DNA lineales, con extremos especializados llamados telmeros, estructuras que confieren estabilidad al cromosoma. Los telomeros estan formados por secuencias repetidas en tandem (una de las cadenas contiene la secuencia Cn(A/T)m donde n>1 y m=1-4, la otra tiene un extremo protuberante en 3Gn(T/A)m). Las polimerasas conocidas extienden la cadena de DNA en direccin 5---3 y para iniciar la sntesis se requiere un cebador. La sntesis de la cadena lder se completa hasta el final, PERO, la cadena discontinua se ira acortando en cada ronda de replicacin debido la discontinuidad de su sntesis. los organismos eucariotas han desarrollado mecanismos para evitar el acortamiento de las cromtidas hijas en cada ciclo celular. La enzima que evita este acortamiento es una transcriptasa reversa modificada llamada telomerasa. Existen evidencias de que el acortamiento de los telmeros constituye un reloj que indica la vejez de las clulas. El telmero se va acortando segn la clula se divide de manera que su longitud podra determinar cuantas divisiones celulares podran tener lugar; no se ha visto relacin directa entre la longitud de los telmeros y longevidad. En las clulas germinales la telomerasa esta activa por lo que la longitud del telmero permanece constante en cada divisin celular. En clulas somticas la longitud de los telomeros disminuye y cuando se llega a una longitud mnima la clula entra en crisis y muere. La mayora de las clulas tumorales escapan a esta regulacin, de manera que al tener la telomerasa activa la longitud de los telmeros se mantiene constante. No obstante, cuando es inhibida la actividad de esta enzima, el desarrollo del tumor tiene lugar. La actividad de la telomerasa puede tener un uso prctico como diagnostico precoz de algunos tumores de colon, vejiga y tiroides donde la actividad de esta enzima se puede medir y relacionar con el grado de avance de la enfermedad. Los mecanismos que regulan la actividad de la telomerasa permanecen desconocidos.

REPARACIN POR APAREAMIENTO INCORRECTO

Ocurre cuando se copia el DNA Ejm una C frente a una A o la polimerasa podra deslizarse o detenerse o insertar de 2 a 5 bases adicionales sin pareja

3' 5'

GATC
X

GATC
Protenas que reconocen y metilan CH3

5' DNA molde 3' DNA recin

sintetizado

CH3

3' 5'

GATC
X

GATC

5' DNA molde 3' DNA recin

sintetizado

CH3

Endonuclesasa GATC que cortan CH3

3' 5'

GATC
X

GATC

5' DNA molde 3' DNA recin

sintetizado

CH3

Accin de exonucleasas CH3

3' 5'

GATC

GATC

5' DNA molde 3' DNA recin

sintetizado

Accin de la DNA polimerasa y DNA Ligasa CH3 CH3

3' 5'

GATC

GATC

5' DNA molde 3' DNA recin

sintetizado

Mut S, Mut C y Mut H reconocen y cortan en E. coli En Eucariontes existen 6 enzimas - En Cancer de colon sin polipos se ha visto alteracin de hMSH2 - y hMLH1 en otros tipos de cancer

REPARACIN POR ESCISIN DE BASE (BER) - En procesos de despurinacin (labil enlace glicosidico), ocurre de 5000 a 10000 por clula por dia a 37 C - Enzimas reconocen y sustituyen la purina adecuada en forma directa - Expontaneamente: Citosina, Adenina y Guanina forman Uracilo, Hipoxantina y Xantina - N glicosilasas las reconocen y eliminan

A G C T C G C G T C G A G C G C

A G C T U G C G T C G A G C G C
Uracilo DNA glucosilasa elimina la base alterada

A G C T

G C G

T C G A G C G C
Endonucleasas que cortan una base mas a cada lado

A G C T

G C G

T C G A G C G C

A G C

C G

T C G A G C G C
DNA polimerasa y DNA ligasa

A G C T C G C G T C G A G C G C

REPARACIN POR ESCISIN DE NUCLETIDOS (NER) - El dao al DNA se produce por la radiacin UV al ocasionar la formacin de dmeros de pirimidinas T=T o C=C (ciclobutano) - El tabaquismo, radiaciones ionizantes, quimioterapeuticos para el cancer

5' 3'

T=T
XPA Reconocimiento TFIIH (XPB, XPD, otras) y separacin

3' 5'

5' 3' XPF/ERRC1 5' 3' Eliminacin de 30 bases 5' 3' Resintesis 5' 3' DNA polimerasa DNA ligasa Corte XPG

3' 5'

3' 5'

3' 5'

3' 5'