TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS PARA LA

DETECCIÓN DE ANTÍGENOS VIRALES:

“INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA” ELISA.
INMUNOHISTOQUÍMICA E
INMUNOCITOQUÍMICA, SERONEUTRALIZACIÓN.
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA.

La muestra que presuntamente contiene antígenos virales es

puesta en contacto con un anticuerpo conjugado con fluoresceína
dirigido contra dicho antígeno.

Si el antígeno esperado está presente se formará un complejo

antígeno-anticuerpo. Luego de los lavados, solo quedarán
presentes estos complejos y la reacción positiva emitirá
fluorescencia que puede verse con la ayuda de un microscopio de
fluorescencia.

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 ELISA.
Al actuar la enzima sobre el
sustrato producirá un color,
observable a simple vista
(cualitativo) o cuantificable
mediante el uso de un
espectrofotómetro,
expresándose como
densidad óptica
(cuantitativo).

En cada placa se colocan

controles positivos y negativos
de absorbancia conocida.
En la primera línea se observa el suero control positivo y en la
segunda el negativo. Los sueros problema por duplicado han
sido colocados en el resto de la placa, se observan positivos
(azul) y negativos (sin color).

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 ELISA.
En general, uno de los
componentes (antígeno o
anticuerpo) se adsorbe sobre
un soporte
(inmunoadsorbente) y se
agregan antígenos o
anticuerpos marcados con una
enzima.

La reacción antígeno-
anticuerpo quedará
inmovilizada y, por lo tanto,
será fácilmente revelada
mediante la adición de un
sustrato específico.

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BASADA EN EL MARCAJE
DE UN ANTIGENO O UN
ANTICUERPO CON UNA
ENZIMA PARA SU
POSTERIOR DETECCIÓN
Los más utilizados para la detección de Antígeno
son:

ELISA indirecto: Método más utilizado para

la determinación de anticuerpos, consiste
en la inmovilización a la placa de ELISA del
antígeno (en los Kits ya viene fijado) del
que queremos conocer si en el suero
problema existen anticuerpos específicos.
Útil en antígenos, proteínas virales o
bacterianas.

 Los pasos siguientes serian la adición del

suero problema, incubación y lavado,
adición del conjugado, incubación y
lavado, finalizando con la adición del
sustrato, el frenado de la reacción y la
lectura.

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ELISA SANDWICH o de
captura: la placa suele ya
venir con un anticuerpo fijado
(monoclonal ó policlonal)
frente al antígeno problema,
sobre el que se añadirá el
macerado del órgano
sospechoso, que en caso de
reaccionar con el anticuerpo
de la placa, será puesto en
evidencia tras la adición del
segundo anticuerpo marcado
con la enzima.  Por último, se
añade el substrato para
revelar la reacción.
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 ELISA DE COMPETICIÓN: util para la
detección de anticuerpos específicos.
Se parte de un anticuerpo
(monoclonal o policlonal), frente a un
antígeno conocido, que previamente
ha sido inmovilizado en la placa. Se
denomina de competición ya que el
suero problema es incubado
previamente con el antígeno, antes de
incubarlo con el antisuero fijado en la
placa, y por tanto compite con él

Los pasos siguientes es la adición e

incubación del conjugado, lavado y
gfinalización con el sustrato y lectura

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 INMUNOHISTOQUÍMICA E
INMUNOCITOQUÍMICA.
La inmunohistoquímica permite evidenciar la presencia de un Ag específico
sobre un corte de tejido determinado y ubicar en qué estructuras del mismo
se encuentra.

Para la detección de antígenos, el único Ac a utilizar se encuentra conjugado

con la enzima reconociéndose la unión del mismo con el antígeno tras el
agregado del sustrato cromógeno.

La inmunocitoquímica permite evidenciar la presencia de un Ag específico

sobre células mediante un procedimiento similar.

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 SERONEUTRALIZACIÓN
Se fundamenta en la detección de
anticuerpos neutralizantes en el
suero problema.

Se colocan los sueros, diluidos en

medio de cultivo con el virus a
neutralizar, en placas previamente
sembradas con células.

Luego se incuban las diluciones

seriadas en una estufa a 37°C y se
determina si hay o no presencia de
ECP en un microscopio invertido.

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Al realizar diluciones del suero
es posible determinar la
concentración o título de
anticuerpos neutralizantes
presentes en la muestra.

El título de anticuerpos se
determina como la dilución
más alta que presenta
inhibición completa del ECP
después de 72 horas de
incubación.
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 LECTURA
• ¿Qué es la prueba de ELISA y cual es su aplicación?
• ¿Qué indica las siglas ELISA?
• ¿Cuáles son las teorías en las cuales se basa la técnica de ELISA?
• ¿Qué es el ensayo de ELISA no competitivo?
• ¿Cúál es el principio de la Técnicas de ensayo inmunológico por
multiplicación enzimática?
• ¿Cuáles son las combinaciones de enzima y sustrato que se emplean
en los diversos métodos ELISA?
• ¿Qué se basa el ensayo de ELISA competitivo?

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MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCÍÓN…