ENZIMAS

Dr. Ronald Navarro Oviedo Magister en Bioqumica Area de Qumica Biolgica Departamento de Biologa Universidad Nacional de San Agustn

ASPECTOS GENERALES
Prcticamente todas las reacciones qumicas que tienen lugar en los seres vivos estn catalizadas por enzimas.  Los enzimas son catalizadores especficos: cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. La sustancia sobre la que acta el enzima se llama sustrato. El sustrato se une a una regin concreta del enzima, llamada centro activo. El centro activo comprende: a)un sitio de unin formado por los aminocidos que estn en contacto directo con el sustrato y b)un sitio cataltico, formado por los aminocidos directamente implicados en el mecanismo de la reaccin Una vez formados los productos, la enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reaccin

El sustrato (un poliptido o protena) se fija al sitio activo de la Quimotripsina

El sustrato, 2-fosfoglicerato (2PGA) en el sitio activo de la enolasa

Catalizadores biolgicos
Xenoenzimas: Catalizadores proteicos creados en el laboratorio Abzimas: Anticuerpos monoclonales con actividad enzimtica Ribozimas: RNAs capaces de catalizar reacciones qumicas (1981). Participan en la eliminacin de intrones y empalme de exones. La parte cataltica de los RNA son los intrones donde se halla el centro cataltico y la secuendcia que reconcoe el lugar de corte (autocatlisis).

Naturaleza qumica de las enzimas

Son protenas producidas por la las clulas con la finalidad de catalizar las reacciones qumicas que ocurren en ellas Ribonucleasa-P: Presenta una pequea subunidad proteica de 14 kDa y un RNA de 377 nt. El sustrato son los precursores de los tRNA Peptidiltransferasa: RNA enzimtico o ribozima de la subunidad ribosmica 50S Telomerasa: Adems de la parte proteica, contiene una molcula de RNA que sirve como molde para la incorporacin de nucletidos

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS

A. PROPIEDADES GENERALES COMO CATALIZADORES
1. Actan en cantidades muy pequeas. Presentes en concentraciones muy bajas Durante la reaccin pueden sufrir alguna transformacin fsica o qumica transitoria reversible. La molcula enzimtica participa en la reaccin, pero al final de la reaccin, la enzima est qumicamente inalterada, lista para ser usada nuevamente

2.

3. No modifican la constante de equilibrio de la reaccin. Las enzimas al acelerar una reaccin hacen que se alcance el equilibrio en menor tiempo, pero las concentraciones de los reactantes y productos no se modifican. Ejm se aade la enzima -galactosidasa a la siguiente reaccin: Lactato Glucosa + Galactosa.

4.

Disminuyen la energa de activacin de la reaccin. Las enzimas aumentan la velocidad de la reaccin disminuyendo la energa de activacin, pero no afectan los aspectos termidinmicos de las reacciones. La energa de activacin es la cantidad de energa necesaria para convertir todas las molculas de un mol de sustancia reaccionante de su estado inicial a su estado de transicin

B. PROPIEDADES PARTICULARES DE LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES BIOLOGICOS

5. Las enzimas son catalizadores muy poderosos y eficientes en cantidades muy pequeas.

 Aumenta la velocidad de reaccin  No vara (G de la reaccin  Facilita la reaccin en condiciones no extremas  No se consume durante la reaccin

6. Las enzimas pueden ser desnaturalizadas. Cuando esto ocurre cesa su funcin como catalizador. Pueden ser desnaturalizadas por pH extremos, temperatura extrema, metales pesados, solventes orgnicos, soluciones salinas concentradas, etc. 7. Las enzimas son altamente especficas. Permiten la coexistencia de diferentes vas metablicas. a) Especificidad absoluta o de sustrato

b) Especificidad de reaccin c) Especificidad geomtrica o estereoespecificidad

Fig. Enzyme Specificity

(A) Trypsin cleaves on the carboxyl side of arginine and lysine residues.

(B) Thrombin cleaves ArgGly bonds in particular sequences specifically

8. Una enzima puede existir en dos o ms formas moleculares diferentes (Isoenzimas o isozimas): Catalizan la misma reaccin pero se desplazan de forma diferente en la electroforesis.

9. Algunas enzimas son producidas en forma de precursor inactivo (proenzima o zimgeno): son principalmente enzimas proteolticas

10. Muchas enzimas requieren un cofactor para su funcin. Los cofactores son sustancias termoestables que intervienen el mecanismo ntimo de la catlisis, se diferencian del sustrato porque: a) No se modifican despus de la reaccin, o b) Sufren alguna modificacin transitoria pero son regenerados por una reaccin acoplada.

Algunas coenzimas que actan como portadores transitorios de tomos o de grupos funcionales especficos

Algunos elementos inorgnicos que actan como cofactores enzimticos

11. Las enzimas transforman diferentes clases de energa

Fig. 8.2. An Energy-Transforming Enzyme. Ca2+ ATPase uses the energy of ATP hydrolysis to transport Ca2+ across the membrane, generating a Ca2+ gradient.

12. Todas las enzimas son protenas globulares 13. Las molculas de cada enzima tienen una conformacin caracterstica

CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS

 Para evitar confusiones, la Unin Internacional de

Bioqumica, a travs de la Comisin de Enzimas (1961) dio un nuevo sistema preciso y muy descriptivo. El nombre consta de dos partes: 1a. Nombre del sustrato o sustratos; 2a. Terminada en asa, indica el tipo de reaccin catalizada.  Seguido del nombre, puede ir entre ( ) informacin adicional, que puede ser el nombre antiguo. Ejm. enzima mlica:
L-Malato + NAD+ Piruvato + CO2 + NADH + H+

L-malato:NAD oxidoreductasa (descarboxilante) (EC 1.1.1.39)

CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS

 De acuerdo al nmero de la Comisin de Enzimas (Enzyme Commission number)  Primer #: tipo de reaccin catalizada.  Segundo #: indica la subclase; dice el tipo de sustrato o el enlace que se rompe en forma mas precisa.  Tercer #: indica la sub-subclase; nos dice el tipo de aceptador de electrones (oxidoreductasas) o el tipo de grupo que se remueve (liasas), etc.  Cuarto #: indica el nmero de serie de la enzima en su sub-subclase.

CINETICA ENZIMATICA

Se estudia cintica qumica para:

a) Determinar experimentalmente la velocidad de una reaccin y su dependencia de parmetros como [S], [E], temperatura, pH, m, D, etc. b) Deducir el mecanismo cintico de una reaccin: - Orden en el que entran los sustratos - Orden en el que s liberan los Productos - Tipos de complejos ES - Tipos de complejos EP - Arquitectura del sitio activo - Determinacin de constantes cinticas para deducir las concentraciones intracelulares de Ss y Ps - Escribir la ecuacin cintica de una reaccin - Nmero de etapas

EFECTO DEL pH DEL MEDIO

El sitio activo de la enzima esta frecuentemente compuesto de grupos ionizables que deben estar en la forma inica adecuada para mantener la conformacin, unir los sustratos o catalizar la reaccin. La actividad de la enzima debe ser medida a pH ptimo

Efecto de la Temperatura

Grfica de Arrhenius
A

Q10 = vt + 10C/ vtC = 2

Pend = -Ea/R log k

ln k = ln A - Ea/RT

1/T

Inhibidores competitivos

Succinato deshidrogenasa
COOCH2 CH2 COOSuccinato
SDH

COOCH2 COOMalonato
-

FAD

FADH2

COOCH CH COO

COOC O CH2 COOOxalacetato

Fumarato

 Pendiente aumenta

Inhibidores no competitivos
a) Reactivos que se combinan reversiblemente con los grupos SH (cistena): Ag++, Hg++, Pb++, Cu++, Iodoacetato (ICH2COO-) E E SH + Mn+ SH + ICH2COOE S E Mn+ + H+ S CH2COO- + HI

b) Sustancias que se unen a iones metlicos esenciales para la actividad de la enzima: CN- (Fe++, Fe+++), EDTA (Mg++)

Inhibicin Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo qumico de la enzima, modificndola covalentemente - Su accin no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una constante de velocidad ki:

E+I

- A diferencia de la inhibicin reversible, el efecto de los

inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacin del inhibidor. - Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente txicos.

GLIFOSATO
Es un cido orgnico dbil formado por una molcula de glicina y otra de fosfonometilo ( N- fosfometilglicina).

Mecanismo de accin:  Potente inhibidor de la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa o EPSPS, que cataliza la formacin de EPSP en la ruta metablica del shikimato que conlleva a la formacin de cido corsmico, que es el precursor de: aminocidos aromticos, alcaloides, flavonoides, ligninas, fitoalexinas, carotenoides y clorofila.  Es un inhibidor competitivo con respecto a PEP y no competitivo con respecto al shikimato-3-P.  Aumenta el consumo de oxgeno, aumenta la actividad de la ATP-asa y disminuye el nivel heptico de citocromo P-450, ocasionando desacople de la fosforilacin oxidativa, tanto en animales como en vegetales. Pese a ser un compuesto con fsforo, no tiene actividad inhibitoria de las colinesterasas.

Efectos del glifosato en la slaud humana

 Las clulas de la placenta humana son muy sensibles al Roundup

(nombre comercial del Glifosato patentado por Monsanto), en concentraciones por debajo de las utilizadas por los agricultores. Lo que explicara los abortos y nacimientos prematuros en trabajadoras rurales de los Estados Unidos. (Environmental Health Perspectives. Volume 113, Number 6, June 2005)  El herbicida acta alterando el sistema endocrino (hormonal), especficamente a la enzima aromatasa , responsable de mantener la relacin normal tanto de la hormona femenina como masculina. El glifosato altera esta enzima causando un desequilibrio hormonal en la persona en especial en los varones.  La enzima aromatasa est involucrada en la sntesis del estrgeno (hormona femenina), por tanto en las funciones psicolgicas femeninas, tambin en la gametognesis masculina (formacin de espermatozoides), la reproduccin y la diferenciacin del sexo. Gilles-Eric Seralini cientfico en Francia de la Universidad de Caen, (Environmental Health Perspectives. Volume 113, Number 6, June 2005)

CINETICA DE LAS REACCIONES CON DOS SUSTRATOS O MAS Esquema global para una reaccin con dos sustratos: A + B P + Q
Ejemplo: La reaccin C2H5OH + NAD+ CH2CHO + NADH + H+

Es catalizada por la alcohol deshidrogenasa, la cual se une tanto al NAD+ como al sustrato que va ser oxidado Nomenclatura (Cleland) Los sustratos se designan por las letras A, B, C y D en el orden en que se adicionen a la enzima. Los productos por las letras P, Q, R y S en el orden en que abandonen la enzima. Los inhibidores son designados por las letras I y J Las formas enzimticas estables se designan por las letras E, F y G, siendo E el ltimo complejo o enzima libre .

Las reacciones enzimticas con dos o mas sustratos son de dos tipos:

Mecanismos Secuenciales:  Mecanismo secuencial ordenado  Mecanismo secuencial al azar

Mecanismo ping-pong

Mecanismo secuencial ordenado

Lactato deshidrogenasa

Mecanismo secuencial al azar

Creatina quinasa

Mecanismo ping-pong (doble desplazamiento)

Aspartato aminotransferasa

Mecanismo ping-pong Concentraciones constantes de sustrato

Las pendientes constantes Independiente de la concentracin de sustrato fijo

Mecanismo secuencial Concentraciones constantes de sustrato

Las pendientes aumentan Los puntos de corte (1/v) disminuyen segn la concentracin del sustrato fijo

MECANISMO DE LA CATLISIS ENZIMTICA

1. Aumento de la velocidad y especifIcidad para el sustrato Las enzimas son iguales a los dems catalizadores, se diferencian por la especificidad. La energa de enlace entre los grupos complementarios de un S y un centro activo se utiliza para proporcionar la Ea de la reaccin y por tanto se incrementa la velocidad 2. Encaje inducido y catlisis enzimtica Cambios conformacionales; un encaje inducido incrementa la velocidad de algunas reacciones pero el incremento es pequeo comparado con otros mecanismos. Ejm. Carboxipeptidasa A, lisozima 3. Aproximacin Una reaccin bimolecular es transformada en reaccin monomolecular, por ello se incrementa la concentracin efectiva de los reactantes, comparado con una solucin diluida 4. Desestabilizacin El ataque especfico con la superficie de una enzima induce tensin, deformacin o desestabilizacin de los enlaces que han de romperse.

5. Catlisis nucleoflica Grupo nuclefilo (grupo bsico), cede electrones al S Imidazol (Histidina) pK = 6.0 7.0 OH (Serina) pK = 13.6 -NH2 (Lisina) pK = 7.6 10.6 SH (Cisteina) pK = 8.0 9.0 COOH (Asprtico) pK = 3.9 Coenzimas: piridoxal-P, TPP 6.Catlisis electroflica Grupo elctrfilo (grupo cido), acepta electrones del S Mn++, Mg++, Fe+++, -NH3 (Lisina) 7. Catlisis general cida o bsica
COOH: Ac. Glutmico, Ac. Asprtico Imidazol (histidina) -NH2 (Lisina) Hidroxibenceno (Tirosina) SH (Cistena) Protonados funcionan como catalizadores cidos Desprotonados funcionan como catalizadores bsicos

REGULACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

1. Regulacin alostrica

Accin de las enzimas alostricas

a) Modelo simtrico o concertado Monod-Wyman-Changeaux (1965)  La enzima existe en equilibrio entre dos conformaciones o estados: relajado (R) o tenso (T).  En el estado R se enlaza el sustrato y el activador.  En el estado T se enlaza el inhibidor.

b) Modelo secuencial
 Kosland-Nemethy-Filmer (1966)

S
 TT

S RT RR

 La enzima puede presentar una subunidad en estado T (de baja afinidad para el substrato) y la otra en estado R (de alta afinidad para el substrato).  La unin del substrato al sitio activo cambia el estado conformacional de la subunidad, la cual pasa del estado T (tenso) al estado R (relajado), pero la otra u otras subunidades permanecen en el estado T.  Cooperatividad positiva: Si la forma RT tiene una afinidad mas alta que la forma TT .  Cooperatividad negativa: Si la forma RT tiene una baja afinidad por el susbstrato

2. Modificacin covalente

3. Protelisis limitada

4. Compartimentalizacin 5. Induccin y represin enzimtica Enzimas constitutivas: siempre presentes en concentraciones constantes. Ejm. Gliclisis Enzimas iducibles: Ausente o solo en pequeas cantidades; inductor = substrato 6. Disponibilidad de substratos y cofactores

VITAMINAS Y COENZIMAS
VITAMINAS: Sustancias orgnicas de estructura qumica muy variada, presentes en los alimentos naturales, que no pueden ser sintetizadas por los animales y que se requieren en pequeas cantidades para el normal funcionamiento de las clulas. Por ello deben ser suministrados en los alimentos. PROVITAMINAS: Precursores en animales IMPORTANCIA BIOLOGICA: Precursores de algunas coenzimas: riboflavina, cido pantotnico, piridoxina (B6), etc. Funciones especializadas: vitaminas A, D, E, K Desde el punto de vista nutricional son importantes porque son complementos nutritivos esenciales para la conservacin de la salud. Avitaminosis: ausencia de una vitamina en la dieta

CLASIFICACION DE LAS VITAMINAS Segn la solubilidad: Liposolubles: A, D, E, y K Hidrosolubles: B y C Funcionalmente: Vitaminas con funcin de coenzima Vitaminas sin funcin de coenzima VITAMINAS CON FUNCION DE COENZIMA: PROPIEDADES Se unen de modo especfico a la enzima (dbilmente o covalentemente) Se comportan como catalizadores Se hallan en las clulas en pequeas cantidades Fisiolgicamenmte son: transportadores de electrones o transportadores de grupos funcionales

A. VITAMINAS Y COENZIMAS QUE PARTICPAN EN TRANSFERENCIA DE GRUPOS 1. PIRIDOXINA (Vitamina B6) Transaminacin, desaminacin y racemizacin de aminocidos, descarboxilacin, sntesis del grupo hemo Piridoxal (- INH3+), piridoxina, piridoxamina

2. COENZIMA A Acido pantotnico (B5): factor de crecimiento Adenosina P-P-Acido pantoico-F-alanina- F-mercaptoetilamina-SH Acido pantotnico Transporta grupos acilo (acetilo, malonilo, succinilo o restios de cidos grasos). Coenzima de acetilacin

3. TPP Vitamina B1, cocarboxilasa, vitamina antiberiberi 2 anillos: a) Pirimidnico: metilado en C2 y aminado en C6 y b) tiazlico: metilado en C4, con cadena de etanol en C5. C2 es funcional Participa en reacciones de descarboxilacin

4. BIOTINA Anillo bicclico: anilllo imidazol + resto de urea + Acido valrico unido a C2 Participa en reacciones de carboxilacin (transporta O2) Ejemplos; Acetil CoA carboxilasa, piruvatio carboxilasa, F-metil crotonil-CoA carboxilasa, propionil CoA carboxilasa.

5. TETRAHIDROFOLATO (FH4) Reacciones: transferencia de grupos con un solo C: -CH3, =CH2, -CHO, -CH=NH

B. COENZIMAS QUE APARTICIPAN EN REACCIONES DE OXIDOREDUCCION

1. NUCLEOTIDOS DE NICOTINAMIDA: NAD y NADP Reaccin: deshidrogenasas; transfieren ion hidruro (2e-s y 1H+)

2. NUCLEOTIDOS DE FLAVINA: FAD y FMN Reaccin: deshidrogenasas; transfieren 2e y 2H+

3. COENZIMA Q (CoQ)