Detección de carbapenemasas en

Enterobacteriaceae : un desafío para los

laboratorios microbiológicos de diagnóstico
“Detection of carbapenemases in Enterobacteriaceae: a challenge for diagnostic
microbiological laboratories”

Yazmín Sanhueza
Javier Sanzana
Angel Torres
Ignacio Velasquez
Introducción
● En el entorno de servicios como cirugía, neonatología , hemato-oncología y unidades de cuidados
intensivos, en los cuales se encuentran pacientes inmunodeprimidos y que son sometidos a
procedimientos invasivos, las infecciones nosocomiales se han convertido y son un grave
problema, producen efectos decisivos sobre las tasas de mortalidad y afectan directamente los
resultados de tratamiento frente a antimicrobianos.

● Las enterobacterales son parte de la flora intestinal humana y se propagan fácilmente, mediante
transporte manual por objetos inanimados, alimentos, agua contaminada, y la más importante, a
través de las manos lo que desencadena las infecciones intrahospitalarias.

● Además, se conocen como el grupo de patógenos más común que causa infecciones tanto
adquiridas en la comunidad como a nivel intrahospitalario.
● Los Enterobacterales multirresistentes productoras de BLEE y cefalosporinasas de tipo AmpC
adquiridas, ya se han extendido por todo el mundo. Un ejemplo alarmante ha sido la exitosa
propagación mundial de E. coli ST131 que produce CTX-M-15.
● Actualmente también hay una distribución mundial de Enterobacterales productoras de
carbapenemasa (EPC).
● Las infecciones causadas por EPC se asocian con una mortalidad significativa. Las tasas de
mortalidad reveladas en pequeños estudios clínicos oscilaron entre el 22% y el 72%
● La transmisión horizontal de genes de carbapenemasas mediada por elementos genéticos móviles
llevan elementos de resistencia adicionales lo que confiere resistencia a varios grupos de
antibióticos.
● La producción de carbapenemasas adquiridas hace que la elección del tratamiento antibiótico de
las infecciones sea muy limitada.
● La susceptibilidad in vitro al colistin, tigeciclina y aminoglucósidos se conserva en su mayor parte,
pero el impacto de estos antibióticos in vivo todavía es incierto.
● Algunos estudios han sugerido que la terapia combinada podría asociarse con un mejor resultado
que la monoterapia.
● Los datos de Israel han demostrado que las infecciones nosocomiales causadas por
Enterobacterales resistentes a los carbapenémicos pueden controlarse mediante una estricta
intervención epidemiológica.
● Sin embargo, para una intervención tan exitosa, existe una necesidad urgente de que los
laboratorios de diagnóstico introduzcan metodologías rápidas y sensibles para la detección de
bacterias productoras de carbapenemasas, las cuales serán explicadas en esta presentación.
Screening para productores de carbapenemasas

Susceptibilidad de EPC y antibióticos indicadores

● Identificación de cepas productoras de carbapenemasas: Selección de cepas sospechosas con
susceptibilidad reducida o resistentes a carbapenémicos. Las cepas de Enterobacterales que
muestran incluso una pequeña reducción en la susceptibilidad también deben ser examinadas para
determinar la producción de carbapenemasas.
● El subcomité de detección de mecanismos de resistencia y resistencias específicas de importancia
clínica y / o epidemiológica (EUCAST) publicó una recomendación para la detección de EPC en la
cual se propusieron valores de corte de detección para carbapenémicos.
● Además, se propuso meropenem como el antibiótico indicador con el mejor equilibrio de
sensibilidad y especificidad.
● Para las bacterias productoras de β-lactamasas de tipo OXA-48 , se propuso la temoclina como un
antibiótico indicador con alta sensibilidad.
● Se propusieron nuevos valores de corte para temocilina, <12 mm y piperacilina-tazobactam, <16
mm.
● Recientemente, Hartl et al. propuso la determinación de las CMI para temocilina (corte de ≥128
mg / L) combinada con la prueba de sinergia de doble disco de meropenem (DDST) como un
algoritmo para laboratorios de diagnóstico en identificación de la producción de carbapenemasas.
● Otro antibiótico carbapenémico Screening es el Faropenem , propuesto por Day et al. en para
probar este indicador se utilizaron 166 cepas de Enterobacterales productoras de carbapenemasas
y 82 no productoras de carbapenemasas. Como resultado no hubo zonas de inhibición alrededor
del disco de Faropenem (10 µg) en las cepas productoras de carbapenemasas.
● Para los productores de OXA-48, los diámetros de la zona de inhibición variaron de 6 mm a 12
mm. en algunas de ellas se observó un gran número de colonias que crecían dentro del halo.
● Las CIM de Faropenem fueron ≥64 mg / L para todas las cepas productoras de VIM, productoras
de IMP y productoras de KPC y del 99% de las cepas productoras de NDM-1.
● Las CIM de Faropenem de las cepas productoras de OXA-48 variaron de 2 mg / L a 32 mg / L.
● Los autores de este estudio plantearon la hipótesis de que la prueba de difusión en disco de
Faropenem presenta una sensibilidad de 99% y especificidad 94% para bacterias productoras de
carbapenemasas.
● Encontrar antibióticos indicadores específicos y sensibles que sean similares a la cefoxitina para la
detección de Staphylococcus aureus meticilinoresistente es un desafío para el diagnóstico de
bacterias productoras de carbapenemasas. Debido a la gran diversidad de carbapenemasas, con
diferentes propiedades bioquímicas.
Medios de cultivo de Screening
● Las muestras recomendadas para el Screening de EPC son hisopos rectales, ya que los
portadores gastrointestinales representan la fuente más importante de transmisión cruzada en el
ámbito hospitalario.
● Debe diseñarse un medio de detección para todas las clases de carbapenemasas con una alta
sensibilidad y especificidad. Un medio cromogénico podría lograr resultados más rápidos. Sin
embargo, no hay ningún medio apropiado disponible en este momento .
● Se debe prestar atención al precio y la frecuencia Screening en cada laboratorio, así como al
creciente número de muestras analizadas.
● Adler y col. han comparado tres medios para la detección directa de EPC en hisopados rectales:
CHROMagar-KPC, agar MacConkey suplementado con imipenem a 1 mg / L y placas MacConkey
con imipenem , discos de meropenem y ertapenem.
● La mayor sensibilidad (85%) y especificidad (94,3%) la tiene el agar MacConkey suplementado con
imipenem. Sin embargo, solo se detectaron productores de KPC.
● En un estudio comparativo, Nordmann et al. sugirió que un medio de cultivo diseñado para el
Screening de BLEE (ChromID ESBL; bioMérieux) podría lograr una mayor sensibilidad que un
medio diseñado para seleccionar productores de carbapenemasas (CHROMagar KPC). Sin
embargo, posee una baja especificidad.
● Se probó un medio de Screening cromogénico prototipo, ChromID CARBA (bioMérieux), diseñado
para la detección de EPC, frente a un grupo de 200 frotis rectales (133 presunto EPC; 92
confirmados por pruebas fenotípicas y genotípicas). El cual mostró una sensibilidad de 92,4% y
especificidad de 96,9%.
● Ninguno de los medios mencionados anteriormente es adecuado para detectar productores de
carbapenemasas de tipo OXA-48, porque estas cepas suelen ser susceptibles a las cefalosporinas
y, a menudo, muestran un nivel bajo de resistencia a los carbapenémicos.
● Un cultivo en caldo suplementado con ertapenem, seguido de cultivo en medio de agar Drigalski,
con pruebas de ertapenem e imipenem , fue sugerido como la metodología preferible para la
selección de productores de OXA-48 por Ruppe et al.
● Se comparó la eficacia de la siembra directa en placas en dos medios selectivos diferentes con un
ensayo de PCR en tiempo real para genes de KPC.
● La PCR demostró una mayor sensibilidad (97,0%) que el cultivo con medios de detección
selectivos (77,3%), con un tiempo de respuesta significativamente más corto.
● Estos resultados indican que el Screening de EPC basado en PCR es el procedimiento más eficaz.
● Sin embargo, el alto costo de los ensayos de PCR y las numerosas muestras examinadas, hacen
necesario desarrollar un medio de detección para la siembra directa con sensibilidad comparable.
● Recientemente, Nordmann et al. hablan de un medio que se basa en agar Drigalski suplementado
con ertapenem, sulfato de zinc y cloxacilina, el cual muestra una sensibilidad muy alta (96,5%)
para detectar también cepas productoras de OXA-48. El medio llamado SUPERCARBA tiene una
sensibilidad superior a otros medios disponibles comercialmente (CHROMagar KPC y Brilliance
CRE).
Pruebas fenotípicas

Test de Hodge
Detección de la producción de penicilinasa en S. aureus, Neisseria gonorrhoeae y otros microorganismos

La placa se inocula con una cepa susceptible de S. aureus, se coloca un disco de penicilina (10 U) en el
centro de la placa y los aislados probados se siembran hacia afuera del disco. La producción de β-lactamasa
era una distorsión de la zona de inhibición.

Test de Hodge Modificado

Detección de la producción de carbapenemasa en especies de Pseudomonas y especies de Acinetobacter.

En la prueba Hodge modificada, S. aureus sensible a la penicilina fue reemplazado por E. coli ATCC 25922, y
un disco de penicilina de 10U con un disco imipenem de 10 μg.
Test de Hodge Modificado
● Alta frecuencia de resultados falsos positivos en Enterobacterales resistentes al carbapenem que producen ESBL
(CTX-M) o β-lactamasas AmpC con deficiencia de porina en sus paredes celulares
● Rendimiento de la prueba Hodge modificada con discos de ertapenem entregó una mejor sensibilidad a los
productores de MBL, debido a la mayor liberación de β-lactamasas de las células
● Sensibilidad muy baja especialmente en bacterias productoras de NDM-1
● Los resultados falsos negativos se minimizaron después de la adición de sulfato de zinc al agar Mueller-Hinton;
sin embargo, la prueba siguió siendo negativa para algunos productores de NDM (la sensibilidad aumentó del
77,4% al 94,0%)

Desventajas

● El ensayo lleva mucho tiempo y requiere de 24 a 48 h para los primeros resultados después del aislamiento de
una presunta cepa productora de carbapenamasa
● No puede distinguir el tipo de carbapenemasa.

CLSI propuso esta prueba para la confirmación de los supuestos productores de carbapenemasa.

Sin embargo, sobre la base de los resultados revisados, la prueba Hodge modificada no debe utilizarse para la
confirmación final de la producción de carbapenemasa.
Detección de MBLs basada en la inhibición por agentes quelantes

● Las pruebas se basan en la sinergia entre los inhibidores de MBL, más comúnmente EDTA y una
oxiiminocefalosporina o un carbapenem.
● Varias pruebas utilizan otros agentes quelantes, como el ácido dipicolínico, la 1,10-fenantrolina y los
compuestos de tiol, o el uso de una combinación de quelantes.
● Estos compuestos inactivan los MBL que actúan contra los β-lactámicos, privándolos de cationes
divalentes Zn+ hidrolíticamente esenciales.
● La prueba de sinergia de doble disco y la prueba de disco combinada son los formatos más utilizados
de ensayos de detección MBL.
Prueba de sinergia de doble disco

● Utiliza un disco β-lactámico colocado cerca de un disco con una cantidad dada de un inhibidor de MBL
● Formación de un patrón de sinergia es indicativa de la producción de MBL

Prueba de disco combinada

● Disco β-lactámico se potencia con un inhibidor, y el diámetro de su zona de inhibición se compara con
el del disco β-lactámico sin inhibidor
● Aumento en el diámetro de la zona de inhibición por encima de un valor de corte predefinido indica
actividad de MBL.

Ambos formatos de prueba de detección MBL muestran una alta sensibilidad incluso con aislados con
bajos niveles de resistencia al carbapenem
Los investigadores han propuesto varias técnicas para las pruebas de detección basadas en EDTA,
principalmente para la prueba de sinergia de doble disco

● Recientemente, expertos de EUCAST y la Sociedad Europea de Microbiología Clínica y Enfermedades

Infecciosas (ESCMID) realizaron una recomendación para la detección de enzimas de clase A y B en
Enterobacterales.
● En los procedimientos recomendados, se sospecha la producción de enzimas de clase B cuando se
observa una diferencia de ≥5 mm en el diámetro de la zona entre meropenem (10 μg) y meropenem
más EDTA (0,25 M)
● En la actualidad hay disponibles tiras epsilométricas que contiene imepenem e imepenem+EDTA o
meropenem y meropenem+EDTA, con alta sensibilidad y especificidad para la caracterización inicial de
Enterobacterales productoras de MBL.
Detección de KPC basada en la inhibición por ácidos borónicos

La detección fenotípica de la producción de KPC se basa en los efectos inhibitorios del ácido borónico y sus
derivados (el ácido fenilborónico y ácido 3-aminofenilborónico)

Los boronatos inhiben preferentemente las β-lactamasas de tipo KPC.

De los indicadores β-lactámicos probados imipenem o meropenem, muestran una alta sensibilidad y
especificidad para la identificación de aislados que producen KPC o cualquier otro miembro de las
carbapenemasas de clase A

Pueden surgir problemas de especificidad con aislados que muestran una susceptibilidad reducida a los
carbapenems, debido a la expresión de alto nivel de β-lactamasas (cefalosporinasas) de tipo AmpC y la
deficiencia de porinas.
Test de disco combinados se ha utilizado más y se ha evaluado como mejor que el test de sinergia de doble
disco

Uso de un corte ≥7 mm para discos de meropenem, con y sin 400 μg de PBA, demuestra ser excelente para
identificar cepas de K. pneumoniae productoras de KPC

También se ha desarrollado un método que evalúa CMI de carbapenems en ausencia y presencia de 0,3
mg/ml de ácido 3-aminofenilborónico. Se ha propuesto una reducción ≥3 veces en los CMI de imipenem como
punto de corte para diferenciar las bacterias productoras de carbapenemasa de clase A de las bacterias no
productoras de carbapenemasa
Diferenciación de MBL y/o KPC basadas en métodos de disco combinados

● Aparición de cepas de K. pneumoniae que coproducen KPC y β-lactamasas VIM

● La propagación de los productores de carbapenemasa doble ha comprometido el rendimiento de las
pruebas a base de quelantes y boronato
● Kit KPC/MBL contiene cuatro comprimidos: meropenem (10 μg), meropenem más PBA (600 μg),
meropenem más DPA (1000 μg) y meropenem más cloxacilina (75 μg)
Algoritmo propuesto por Miriagou et al. para la interpretación de los resultados obtenidos con el Método B
basado en la confirmación KPB/MBL.
Clase D
Ninguna de las pruebas de detección revisadas anteriormente es adecuada para la identificación de aislados
que producen β-lactamasas hidrolización de carbapenem de tipo OXA adquiridas de clase D

Las propiedades enzimáticas de las carbapenemasas de tipo OXA, no son inhibidas por el ácido clavulánico,
el tazobactam, el sulbactam o cualquier quelante de zinc, impidieron el desarrollo de pruebas fenotípicas
específicas para su detección.

La resistencia de alto nivel a temocilina como a piperacilina-tazobactam en Enterobacterales que además

muestre una susceptibilidad o resistencia reducidas a un carbapenem, puede ser predictivo de la producción
de OXA-48

La confirmación definitiva de tales aislados requiere técnicas moleculares

Técnicas moleculares y genéticas
Son el estándar de referencia para la identificación de los genes implicados en la
resistencia.

Se basan en la técnica de PCR, y por lo tanto permiten reducir los tiempos de

identificación y a su vez eliminar aquellos errores presentados en las pruebas de
detección fenotípica.

Pueden observarse resultados en un periodo de tiempo de 4-6 horas con excelente

especificidad y sensibilidad.

Tecnologías actualmente utilizadas son la PCR simple y múltiple, RT-PCR y

Microarrays.
PCR simple y múltiple.

Cuando se sospecha de la presencia de carbapenemasas, la PCR es la forma

más rápida de determinar qué tipo de betalactamasa se encuentra presente.

Se puede utilizar un partidor específico para un gen o bien partidores o

cebadores que pueden detectar múltiples genes implicados para cada grupo de
carbapenemasa.

Es decir para una cepa de Escherichia coli productora de una

metalobetalactamasa con PCR múltiple podríamos identificar los genes
NDM,SPM,GIM,SIM, IMP, VIM, etc; mientras que para PCR simple solo uno de
los genes implicados.
RT-PCR
Paralelamente a la amplificación tiene lugar,la detección de los amplicones sintetizados gracias a
la emisión de fluorescencia, que se relaciona de manera directa con la cantidad de ADN
amplificado en cada ciclo, lo que permite establecer y registrar continuamente la cinética de la
reacción. De este modo, la PCR en tiempo real permite obtener resultados en pocas horas.

.
Microarrays

Son tecnicas de hibridacion que permiten identificar secuencias de ADN de forma

simultánea.

Es una técnica de muy alta sensibilidad y especificidad.

Las betalactamasas pueden ser detectadas directamente de muestras de

hemocultivo, sin embargo, no está validado su uso en otro tipo de muestras clínicas.

La sensibilidad de la técnica puede verse influenciada de acuerdo al método de

extracción de ADN.

Su principal desventaja es el costo.

Métodos directos para la detección de la actividad carbapenemasa

● Ensayos Colorimétricos.

Capaces de detectar la hidrolisis de los grupos amida de las b-lactamicos, según cambios de
color.
● Técnicas Específicas.

Utilizan un b- lactámico cromógeno (Test de nitrocefin).

● No Especificas.

Se basan en interacciones no específicas con moléculas hidrolizadas de betalactámicos o en

la detección de cambios de pH.
Métodos Colorimétricos.
Rojo fenol.
● Técnica utilizada para la detección de bacterias productoras de b- lactamasas
como H.influenzae, S. aureus, entre otros.
● La presencia de estas b- lactamasas produce un viraje de color de rojo a
amarillo.
● Posteriormente, el test de rojo fenol fue modificado y adaptado para la
detección de carbapenemasas en Enterobacterales y BNF, test conocido como
Carba NP.
Carba NP
● En 2013, Tijet et al. validó la técnica con una colección de
244 aislaciones de enterobacterales y P. aureginosa.
● Reportando:
- Especificidad 100%
- Sensibilidad 72,5 % (100% en Enterobacterales / 94,4%
para P. aureginosa)
● Se han identificado falsos negativos en aislaciones de
cepas mucosas, como también en enterobacterales
productores de OXA-48. ( baja expresión de
carbapenemasas -> Aumentar la concentración bacteriana
aumentó a un 80% la sensibilidad de la técnica.
● Dortet et al. Validó la técnica para la búsqueda de
productores de carbapenemasas en sangre.
Espectrometría de masas.
● En el 2011, se presentan las primeras publicaciones asociadas a metodología de detección de cepas
productoras de carbapenemasas por MS.
● El cultivo fresco es mezclado con una solución con un carbapenémico (Meropenem/ Ertapenem), la
solución debe ser incubada de 2 a 4 horas a 35±2°C. La reacción es centrifugada, se debe extraer el
sobrenadante y se realiza la medición.
● Método permite la detección real del resultado de la hidrólisis de la carbapenemasa, logrando
disminuir los resultados falsos positivos.
● Se han observado casos de falsos negativos en aislaciones productoras de OXA-48. Técnica de
preferencia para el estudio de OXA en Acinetobacter baumanii.
● Una modificación propuesta por Carvalhaes y Col. asoció la Cromatografía líquida unida a MS, esta

fue utilizada en aislaciones productoras de enzimas: IMP, NDM, VIM. GIM, KPC y GES. al medir el
sobrenadante se percataron de que la sensibilidad y la especificidad aumentó en un 100% .
● Limitante, el equipo no se encuentra en todos los laboratorios.
Flujo de trabajo en laboratorios de diagnóstico de rutina

Se hace necesario introducir

métodos para detección de EPC en
todos los laboratorios de diagnóstico
clínico.

Para este propósito, se recomienda

el siguiente flujo de trabajo
Conclusión
Se han desarrollado métodos nuevos y fiables para la detección de carbapenemasas.

Estos métodos necesitan personal de laboratorio especializado. Por lo tanto la confirmación final de la
producción de carbapenemasas se debe realizar en laboratorios de referencia.

Para mejorar el diagnóstico de EPC el personal del laboratorio debe estar capacitado en el diagnóstico y
además se debe contar con controles de calidad externos.

La investigación sobre métodos de diagnóstico deberá centrarse en el desarrollo de nuevos métodos

para la detección directa de colonias de EPC en medios de cultivo selectivos.