AMELOGÉNESIS

IMPERFECTA (AI)
JUDITH PORTILLO
LINA DAZA
AMELOGÉNESIS
IMPERFECTA TIPO
IV: HIPOPLÁSICA
ES UNA ENFERMEDAD
GENÉTICA QUE AFECTA
LA CALIDAD Y CANTIDAD
DEL ESMALTE DENTAL.
 Hypoplastic A.l. with Highly Variable
Expressivity Caused by ENAM Mutation
AMELOGÉNESIS IMPERFECTA HIPOPLÁSICA CON ALTA
EXPRESIVIDAD VARIABLE, CAUSADA POR LA MUTACIÓN
ENAM
 OBJETIVO

Identificar las mutaciones ENAM en

dos familias con A.I. hípoplásica,
mediante secuenciación de exones.
POBLACIÓN

Dos familias
turcas

A.I Hipoplásica
 SECUENCIACIÓN DE LOS EXONES
Y ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO

Realizada con
muestras de ADN
Las lecturas de
de ambas familias. Las variantes
las secuencias
Los exones fueron registradas
El test Illumina fueron Las variantes en
capturados con el fueron filtradas
permitió que las comparadas con las secuencias
sistema Agilent con un valor
secuencias 101- referencias de fueron
SureSelect XT residual de 0,01
bp fueran genoma humano registradas con
Human All Exon por la menor
generadas. hg19, mediante dbSNP build 138
V5 con frecuencia de
Burrows-
enriquecimiento de alelos.
Wheeler Aligner.
los objetivos
 REACCIÓN EN CADENA DE
POLIMERASA (PCR) Y SECUENCIACIÓN
Confirmación de la variación en el gen ENAM
y su distribución entre los miembros de la • Secuenciación de Sanger
familia

• HiPi premix de polimerasa de ADN (Elpis Biotech,

Amplificación PCR Daejeon, Corea del Sur)

Ampliación de las • Kit de purificación PCR (Elpis Biotech,

muestras Daejeon, Corea del Sur)

Secuenciación Sanger

• Centro de secuenciación de ADN

(Macrogen).
 CORTE Y EMPALME DE PRUEBA IN
VITRO
La amplificación de PCR conHipi
Super DNA Polymerasa (Elpis
biotech) fue realizada con una muestra
de ADN (delantero primario: 5’-
GCCCCATCCATTTCCATACT-3’;
reverso primario: 5’-
TGTGAGAGGATAGGGGCAAT-3’)
Transferencia de vectores silvestres y
mutantes de los vectores pSPL3 a las
células COS-7 y el total ARN fue
aislado en 36h.
Selección de vectores silvestres y
Clonación del fragmento genómico de
mutantes, por secuenciación de
los exones 4, 5, y 6 de ENAM, por
plásmidos y subclonación en el vector
medio de pTopTA V2Vector.
pSPL3
La transcriptasa inversa PCR fue
llevada a cabo por medio del vector
Las bandas de amplificación fuero
primario y el exón específico 6 (SD6:
retiradas y caracterizadas en cuanto a
5’-TCTGAGTCACCTGGACAACC-
la secuencia de ADN.
3’; reverso primario: 5’-
GGGCCGTTCATAAAGTTGAA-3’)
RESULTADOS
 FAMILIA I
 Mujer de 19 años de un núcleo familiar no-consanguíneo.

Genealogía familiar:
+: Los familiares que participaron en el
estudio.
→: Paciente estudiado.
?: El estado de afección del individuo no
puede ser determinado, debido a prótesis
dentales.
 Fotografía clínica de la paciente (19 años)

 Presentaba hipoplasia
general en todos los
dientes.
 El esmalte era ligeramente
más concentrado en las
cúspides y zonas
periféricas de los dientes
posteriores.
 Se presentaban fisuras en
varios dientes,
especialmente en las
superficies bucales de los
premolares
 Delgadez del esmalte

El hermano de 11 años de la paciente presentaba los mismos rasgos clínicos a

excepción de las regiones defectuosas en la región labial de los incisivos
permanentes del maxilar central.
 1 2 3 4 5 6
Los resultados Las predicciones 3 relaciones La ampliación Codón de El mayor efecto
mostraron dos variantes para esta variante débiles en el más grande pero terminación de la mutación
en KLK4 y ENAM. La fueron: Puntaje vector de la más débil temprana de parece escapar
variación KLK4 Sift de 0,12, mutación. también incluía movimiento que del exón 4.
heterocigota fue una puntaje de la la secuencia sería degradado
mutación, prueba de entre los exones por NMDS.
NM_004917:exon5:c.6 mutacion de 1 4 y 5.
80C>T:p.(Pro227Leu), (polimorfismo),
con una frecuencia de y CADD 1,3 de
alelos de 0,0016 en la 10,91
base de datos
Aggregation
Consortium
(rs144350395)
 FAMILIA II
 Paciente de 9 años, tercera hija de un matrimonio consanguíneo

Genealogía familiar:
+: Los familiares que participaron en el
estudio.
→: Paciente estudiado.

El número en el símbolo del sujeto indica la

enumeración entre los hermanos.
Fotografías clínicas de la paciente (9 años)

 Esmalte delgado en
todos sus dientes
deciduos.
 Pigmentación oscura en
casi todos sus dientes.
 Sin esmalte en los dientes.
Panorámica de la paciente (9 años)
 La mutación en ENAM es
causada por una variante
homocigota de sustitución de La copia de ARN mutante
C-G que introduciría un codón escaparía a NMDS y se Los padres no presentaban
prematuro en el último exón transformaría en proteína daños dentales, ni presentaban
ENAM, NM_031889; ENAM, debido a su locación ningún tipo de fenómeno de
c.1842C>G, pTyr614)que en el ultimo exón. hipoplasia A.I.
truncaría las proteínas debido
a 500 aminoácidos.

La hermana de 19 años
El hermana de 22 años de la
presentaba una dentadura
normal, pero tenía defectos de paciente presentaba defectos
hipoplasia en las superficies en el esmalte también, sin
linguales de los dientes embargo, éstos eran leves.
anteriores de los maxilares y
mandibulares permanentes.
 CONCLUSIONES
Las mutaciones localizadas
en el último exón pueden
La producción de convertirse en proteína que se
esmalte dental puede acumule en la etapa de
estar determinada por secreción de esmalte; esta
factores ambientales mutación podría ser menos
como el fluoruro o la dañina que las C-término con
vitamina D. aminoácidos adicionales
Esto podría explicar el
fenotipo de los individuos
con mutación heterocigota,
en especial, las grietas
horizontales que se dan
solamente en la superficie
lingual de los dientes
anteriores.
 Candidate gene sequencing
reveals mutations causing
hypoplastic amelogenesis
imperfecta
SECUENCIACIÓN DE GENES CANDIDATOS REVELA MUTACIONES,
CAUSANDO HIPOPLASIA DE AMELOGÉNESIS IMPERFECTA
 OBJETIVO

Identificar la etiología genética de

la hipoplasia
POBLACIÓN

Tres familias
turcas

Amelogénesis
imperfecta

Se reunieron tres familias con
A.I.
Se llevaron a cabo análisis de
mutación, utilizando el enfoque
Los análisis identificaron
de genes candidatos, basado en
mutaciones subyacentes en
sus características clínicas y el
LAMB3 y FAM20A
análisis de la genealogía
familiar.
 REACCIÓN EN CADENA DE
POLIMERASA (PCR) Y SECUENCIACIÓN
El ADN fue separado de la sangre o la •Kit de purificación del ADN (Macherey-
saliva de los miembros de la familia Nagel GmbH &Co., Duren, Alemania
participantes

•HiPi premix de polimerasa de

Amplificación ADN (Elpis Biotech, Daejeon,
PCR Corea del Sur)

•Centro de secuenciación
Secuenciación ADN Macrogen, en
ADN Seúl, Corea del Sur
 CORTE Y EMPALME DE PRUEBA

Un fragmento genómico (988 bp) del

Las secuencias silvestres y con Los vectores clonados fueron
gen FAM20A (incluyendo exón 6 y 7)
mutaciones fueron subclonadas en el transferidos a las células COS-7 y el
fue ampliado con pTo Blunt V2 vector
vector pSPL3. ARN fue aislado después de 36 horas.
(Enzynomics, Seúl, Corea).

La transcriptasa inversa PCR fue

llevada a cabo por medio del vector
Las bandas de amplificación fueron
cebador (SD6: 5’-
retiradas y caracterizadas en cuanto a
TCTGAGTCACCTGGACAACC-3’;
la secuencia.
SA2: 5’-
ATCTCAGTGGTATTTGTGAGC-3’)
RESULTADOS
 FAMILIA I
 Mujer de 10 años en un núcleo familiar no-consanguíneo, con hipoplasia
irregular. La paciente presentaba grietas y hoyos en todos sus dientes
permanentes.

Genealogía familiar:
+: Los familiares que participaron en el estudio.
→: Paciente estudiado
 Sus molares deciduos presentaban dentina en las superficies oclusales debido a la
pérdida de esmalte (presunto desgaste)
 La radiografía panorámica reveló similitudes en sus dientes permanentes.
 Maxilar frontal y fotografías mandibulares del padre de la paciente (40 años)

 El padre tenía varias prótesis, pero reportó que sus dientes no estaban tan
deteriorados como los de su hija.
 Exámenes posteriores revelaron que el padre presentaba varias fisuras y hoyos en
sus dientes permanentes.
 El análisis mutacional
LAMB3 identificó una La mutación introduciría
mutación heterocigota una detención en el codón
(NM_000228.2; del último exón
c.3431C>A) causada por [NP_000219.2; p.
un cambio de sustitución (Ser1144*)].
de citoquina a adenina.
 FAMILIA II
 Mujer de 8 años, segunda hija de un matrimonio consanguíneo.

Genealogía familiar:
+: Los familiares que participaron en el
estudio.
→: Paciente estudiado.
Símbolos negros: individuos afectados

El número en el símbolo del sujeto indica

la enumeración entre los hermanos.
 Su esmalte dental presentaba hipoplasia uniforme, y su tejido gingival presentaba
hiperplasia.

Maxilar frontal y fotografías mandibulares de la paciente (8 años)

 Panorámica de la paciente (8 años)
 La paciente presentaba mordida abierta en el lado derecho.
 La radiografía panorámica mostró signos de alteraciones en la erupción de todos
los segundos molares permanentes.
 El análisis de la mutación de FAM20A
identificó una mutación homocigota de
supresión 2bp (NM_017565,3;
c.34_35delCT).

Esta mutación introduciría un

Esta copia con mutación con una
terminación temprana en el codón sería
degradada por NMDS, y la paciente no
tendría proteína FAM20A.
movimiento del codón cambiando la
leucina en el aminoácido (posición 12)
por alanina con una nueva secuencia de
aminoácido 66 [NP_060035.2; p.
(Leu12Alafs*67)].
 FAMILIA III
 Mujer de 17 años de una familia consanguínea

Genealogía familiar:
+: Los familiares que participaron en el
estudio.
→: Paciente estudiado.
Símbolos negros: individuos afectados

El número en el símbolo del sujeto indica la

enumeración entre los hermanos.
 Sus dientes presentaban hipoplasia en el esmalte y mordida abierta bilateral.
 Hipoplasia general en el esmalte y pigmentación oscura .
 Superficies esmaltadas ásperas que dificultaban la higiene oral.

Maxilar frontal y fotografías mandibulares de la paciente (17 años)

 Dientes deciduos (canino del maxilar derecho, segundo molar del maxilar izquierdo,
segundo molar del mandibular izquierdo) y múltiples dientes permanentes que no
erupcionaron en la cavidad oral.

Panorámica de la paciente (17 años)

 Foto clínica frontal del hermano afectado V:3 (12 años)

 El tercer hijo (hombre de 7 años) presentaba un fenotipo clínico similar, a

excepción de la conservación de los dientes deciduos.
 Panorámica del hermano afectado V:3 (12 años)
 Una radiografía panorámica mostró una calcificación severa y malformación en
las raíces dentales (especialmente en los molares).

Un análisis de mutación
FAM20A reveló una supresión
e inserción 5bp en intron7
(NM_017565.3;
c.1109+3_1109+7delinsTGGT
C), cambiando la secuencia de
GTGAGTT a GTTGGTC.
La muestra segmentada con un
volumen similar tuvo la
secuencia GTTG después del
exón 7.
El hermano afectado (V:3)
también presentaba una
mutación homocigota. Un
corte de prueba del vector
silvestre, mostró una sola
banda con división normal,
mientras que el vector mutante
presentaba divisiones
anormales.
La muestra segmentada más
fuerte del vector mutante tuvo
una supresión del exón 7 y
algunas muestras tuvieron
supresiones tanto del exón 6
como del exón 7.
La muestra más grande tuvo
un intrón adicional y la
secuencia del vector de
clonación después del exón 7.
Todas estas segmentaciones
por mutación introducirían una
terminación temprana del
codón, causando que estas
copias sean deterioradas por
NMDS
 DISCUSIÓN
En la familia I, la posición del
nucleótido después de la
mutación es G y este cambio
(c.3432A>G) es un polimorfismo
aislado del nucleótido
(rs1049607)con una frecuencia de
alelo menor de 0.463.
Ambas mutaciones homocigotas FAM20A
identificadas en este estudio
(c.34_35delCT en la familia I y
c.1109+3_1109+7delinsTGGTC en la
familia II) introducirían una terminación
temprana del codón y además sería
desintegrado por NMDS. Todos los
individuos afectados en ambas familias
presentaban el mismo fenotipo.
 CONCLUSIONES
Los análisis
Se reunieron tres identificaron
familias con A.I. y se satisfactoriamente las
realizaron análisis de mutaciones en LAMB y
mutaciones con el FAM20A que causan
enfoque con genes malformaciones en el
candidatos, basados en esmalte, con o sin
fenotipos clínicos y síntomas clínicos.
patrones hereditarios.
El enfoque de genes
candidatos es una
herramienta valiosa para
identificar la etiología
genética de las familias
con A.I. y posibles
correlaciones entre
fenotipo y genotipo.
GRACIAS