Proteasas Parasitarias

Proteasas
Definición
• Se trata de enzimas capaces de
hidrolizar los enlaces peptídicos
(subclase E.C 3.4)

• Proteólisis limitada: limitado número

de enlaces hidrolizables

• Proteólisis ilimitada: proteasoma,

lisosomas
 Enlace Peptídico
Características
Plano
Rígido
Polar
Restringe
conformación de la
cadena polipeptídica
El Problema Químico
 Proteasas
Nomenclatura
 Proteasas
Nomenclatura de Schercher y Berger
 Proteasas
Clasificación según mecanismo
de acción
• Serina proteasas
• Cisteína proteasas
• Metaloproteasas
• Aspártico proteasas
• Treonina proteasas
• Glutámico proteasas
 Proteasas
Clasificación

• Familia: homología significativa a nivel de

secuencia de amino ácidos en la porción
catalítica.
• Clan: Grupos de familias que han
evolucionado a partir de una proteína
ancestral. Similitud a nivel de estructura
tridimensional
Proteasas en los Genomas
Eucariotas
 Serina proteasas
Generalidades
• Familia de
Qumiotripsina:
Tripsina, elastasa,
factores de la
coagulación XIIa,
XIa, IXa, plasmina
• Familia Subtilisina,
enzimas bacterianas
• Tríada catalítica
 Serina Proteasas
Mecanismo de Acción Catalítica

Tríada Catalítica: His57,

Asp102 y Ser195
-Formación de acil
intermediario entre el
substrato y la Ser
Formación de este
intermediario covalente se
produce a través de un
intermediario tetrahédrico
de transición cargado
negativamente
Se cliva el enlace peptítico
 Serina Proteasas
Mecanismo de Acción Catalítica (cont.)

Fase de deacilación
El intermediario acil-
enzima se hidroliza
por una molécula de
agua liberado el
péptido y
restaurando el
hidroxilo en Ser
La His provee una
base y acepta el OH
de la Ser reactiva
 Cisteína Proteasas
Generalidades
Papaína, catepsinas
lisosomales B, H y L
Calpaínas citosólicas
• Díada catalítica:
Cis25, His159 juegan
los mismos roles que
Ser e His en serina
proteasas
 Cisteína Proteasas
Mecanismo de Acción Catalítica
La catálisis también se produce
a través de la formación de un
intermediario covalente e
involucra a Cys e His
El nucleófilo es en este caso un
ion tiolato en lugar de un grupo
hidroxilo
El tiolatio se estabiliza por la
formación de un par iónico con
el imidazol vecino en la His
El ataque nuclefílico es en este
caso el par iónico tiolato-
imidazol en ambos pasos, por
tanto no se requiere una
molécula de H2O2
 Metaloproteasas
Generalidades

• Amplias
differencias en
secuencias y
estructura
• La gran mayoría
contienen Zn en
sitio activo
• Ej: Termolisina,
metaloproteasas de
la matriz
extracelular
(MMPs), algunas
Sito activo de la termolisina
aminopeptidasas mostrando Zn, HIS142, HIS146 and
GLU166.
 Metaloproteasas
Mecanismo de Acción
El mecanismo catalítico lleva a la
formación de un intermediario
tetrahédrico no covalente luego del
ataque de la molécula de H2O unida al
Zn sobre el grupo carbonilo del enlace
peptídico.
El intermediario se descompone por la
transferencia del protón del ácido
glutámico al grupo NH
 Aspártico Proteasas
Generalidades
• Ejemplos: Familia de la Pepsina:catepsina D, renina
• Familia de proteasas del HIV (retropepsina). Son
monoméricas, por lo que la dimerización se requiere
para formar la enzima activa
• Se trata de enzimas bilobuladas donde el sitio activo
está entre dos lóbulos homólogos. Cada lóbulo
contribuye con un aspartato
• El pH óptimo es ácido para la mayoría de las aspártico
proteasas, donde un protón está compartido por los
dos aspartatos del sitio activo
• El agua es activada por los aspartatos para realizar el
ataque nucleofílico
 Aspártico Proteasas
Mecanismo de Acción
Los 2 residuos aspartil tienen una gran
proximidad geométrica en la molécula
Un aspartato se ioniza mientras que el segundo
no lo está al rango de pH óptimo de 2-3
La catálisis de las aspártico proteasas no
involucra la gneración de un intermediario
covalente si bien existe un intermediario
tetrahédrico.
El ataque nucleofílico se consigue por 2
transferencias simultáneas de protones: una
desde el H2O2 a la díada de dos carboxilos y
otra desde la diáda al oxígeno carbonilo del
substrato con el consiguiente clivaje CO-NH
En términos generales es una catálisis ácido-
base.
 Inhibidores de Proteasas
Bajo Peso Molecular

• Cisteína: E-64, Leupeptin

• Serina: Di isopropilfluorofosfato (DFP),
PMSF, Benzamidina,
Dicloroisocumarina
• Metalo: EDTA, EGTA, Fenantrolina,
Bestatina
• Aspártico: Pepstatina
 Inhibidores de Proteasas
Inhibidores Naturales

• Mas de 100 compuestos naturales

identificados
• Desde bacterias a animales y plantas
• Reversibles o seudo-irreversibles
• Impiden acceso al sitio activo
• Proteicos, de 50 a 400 aa
• Clase específicos excepto familia de α-
Macroglobulina
• Inhibidores de Serina y Cisteína proteasas
son los mejor caracterizados. Ej. α-1
antitripsina y cistatinas
 Metodología de Estudio
Substratos Cromogénicos

Estos substratos, al
clivarse generan un
compuesto
cromogénico. La tasa de
hidrólisis se mide en Los
más utilizados son
péptidos 4-nitroanilides
pNA) y péptidos
thioesteres
 Metodología de Estudio
Sustratos Fluorgénicos
Generan un compuesto
fluorogénico al
producirse el clivaje.

La tasa de hidrólisis se
cuantifica por medio de
un espectrofluorómetro
o fluorómetro en forma
continua o ensayos
puntuales.

Los sustratos más

usados son los que
tienen acoplado AMC
(peptidyl 4-metil-7
cumarilamidas).
 Metodología de Estudio
Sustratos con Quenching intramolecular
En estos substratos, la
secuencia peptídica separa
un grupo fluorescente dador
de un grupo aceptor que
actúa como mitigador
(quencher) de fluorescencia.
El fenómeno se llama
transferencia de energía
resonante. El clivaje del
enlace peptídico lleva a
separación del par dador-
aceptor produciendo un
incremento de la
fluorescencia. Existen
varios pares de dador-
aceptor reportadoss, por ej.
o-aminobenzoic acid (Abz)
como dador y 2, 4
dinitrophenyl (Dnp) como
aceptor.
 Substratos sintéticos
Ejemplos
• Cathepsin B Bz-Arg-pNA
Pyr-Phe-Leu-pNA
Z-Arg-Arg-pNA
Z-Phe-Arg-pNA Z-Arg-Arg-MCA
Z-Phe-Arg-MCA

• Cathepsin G MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA
Suc-Ala-Val-Pro-Phe-pNA
Suc-Phe-Leu-Phe-pNA –

• Cathepsin H H-Arg-pNA
Bz-Arg-pNA H-Arg-MCA

• Cathepsin L Z-Phe-Arg-pNA
» Z-Phe-Arg-AMC
 Geles de gelatina-SDS-PAGE

CL1 gelatinolytic activity

CL2
29 kDa
CL1
CL2 gelatinolytic activity
27,5 kDa
 SDS-PAGE acoplado a
Substratos Fluorogénicos
 Acciones de las Proteasas
Parasitarias en el Contexto
del Parasitismo
• Invasión
• Migración
• Nutrición
• Evasión de la respuesta inmune
• Inmunomodulación
 Invasión y Migración
Membranas Basales y Matríz
Extracelular
 Nutrición

• Hemoblobina

• Proteínas del suero

• Proteínas intracelulares

• Proteínas extracelulares (MEC)

 Evasión de la Respuesta
Inmune
• Degradación de
Igs (IgG, IgM, IgE,
IgA)
• Degradación de
componentes del
Complemento
• Clivaje de
moléculas de
superificie de
células del sistema
inmune (Ej. CD4)
 Inmunomodulación
La cisteína
proteasa CPB2.8
de Leishmania
mexicana induce
una fuerte
respuesta de tipo
Th2 asociada a la
progresión de la
enfermedad
 Enfermedad de Chagas
• Causada por el
flagelado Trypanosoma
cruzi
• Parásito heteroxeno
• 3 formas: Forma
replicativa intracelular
obligatoria amastigote,
forma tripomastigote
circulante y forma
epimastigota replicativa
en el insecto vector
Proteasas de Trypanosoma
cruzi
Cisteína proteasas

– Cruzipaína (cruzaína, GP57/51)

– Catepsina B-like proteinasas

– CAAX Prenyl proteasa

Proteasas de Trypanosoma
cruzi
Serina proteasas

– Oligopeptidasa B

– Prolil Endopeptidasa Tc80 (colagenasa)

– Serina carboxipeptidasa
 Proteasas de
Trypanosoma cruzi
Metaloproteasas

– Genes pertenecientes a la familia gp63 de

Leishmania, una metaloproteasa asociada
a membrana celular han sido descritos en
T. cruzi.
 Cruzipaína
Responsable de la actividad cisteína
proteasa más promienente de T. Cruzi
Se expresa en todos los estadíos
parasitarios
La mayoría tiene localización
lisosomal, pero hay isoformas
asociadas a membrana plasmática y
habría alguna secretada
Endoproteasa, digiere proteínas como
caseína, SAP, hemoglobina y sustratos
sintéticos a pH 7-9.
Prefiere Arg o Lys en P1 y un
hidrofóbico o con carga + en P2
(Leu>Tyr>Phe>Val)
 Cruzipaína
Especificidad intermediaria
entre Catepsinas L y B en
función de AA en P2

Inhibida por
organomercuriales, E-64,
leupeptin, TLCK, cistatina, Z-Phe-Ala-fluorometilketona
stefina, chagasina y
derivados peptidil
fluorometanos

Peptidos con secuencia

YHNGAA del pro-dominio
también la inhiben
E-64
 Cruzipaína
Corte de subclases de IgG
 Cruzipaína
Corte de subclases de IgG
 Cruzipaína
Corte de subclases de IgG
 Malaria
• Causada por
protozoarios
apicomplexa del género
Plasmodium

• 300 millones de
infectados, más de un
millón de muertes
anuales

• Ciclo complejo,
transmitidos por vector
invertebrado (mosquito
Anopheles)
 Proteasas de Plasmodium
en la Digestión de la
Hemoglobina
Se desarrolla en la vacuola alimenticia
Consume el 75% de la Hb
Se producen pequeños péptidos pero no AA
por lo que existirían transportadores
Las Plasmepsinas I - IV son aspártico
proteasas implicadas en la primera fase de la
digestión
Las Falcipaínas I y II son cisteína proteasas
que degradan los polipéptidos grandes
generados
La Falcilysina, una metaloproteasa de la
familia M16, degrada los pequeños péptidos
Una aminopeptidasa citosólica completaría el
proceso produciendo AA libres
 Plasmepsinas
Nutrición

• Degradación inicial
de Hb nativa
(plasmepsina I)

• Clivan enlace
Leu203-His204 en
región bisagra de
cadena α
 Plasmepsinas
Invasión
•Clivaje de
espectrinas (CH3)
del esqueleto de la
membrana
plasmática del GR
 Amebiasis
• Infección intestinal o
extraintestinal causada
por Entamoeba
histolytica
• 50 millones de
infectados y 110 mil
muertes anuales
• 2 especies reconocidas
• Entamoeba histolytica –
patógena
• Entamoeba dispar –
comensal (10%
población mundial)
 Cisteina Proteasas de
Entamoeba histolytica y E. dispar
Proteasas en la Patogenia de la
Amebiasis
 Proteasas como Blancos
Terapéuticos –Inhibidores de
CP
• Peptidil diazometanos
basados en la
secuencias LVG de las
cistatinas
 , , epoxi ketonas - >
potencia que E-64c
• Bis-arylacylhydrazidas y
aril ureas-reversibles
• Mercaptoetilketonas,
algunas con Ki de 1nM
 Proteasas como Blancos
Terapéuticos –Inhibidores de
CP
• La actividad de los inhibidores de CP contra T. Cruzi en cultivos o
modelos animales correlaciona con la inhibición directa de la CP.

• No se pueden descartar otras acciones.

• En su mayoría los inhibidores también actúan sobre las

catepsinas de mamíferos.

• Las células no se ven afectadas por las concentraciones que

matan los parásitos. Redundancia?.

• Los parásitos resistentes a los inhibidores de CP no se mostraron

resistente a drogas establecidas como nifurtimox indicando
mecanismos diferentes