Seminario 1

Técnicas en biología celular y molecular

Estefanía Neira Ospina
Maestría en Ingeniería Biomédica

2020
 OBJETIVO

Desarrollar un ensayo de PCR en

tiempo real basado en TaqMan para
identificar los patógenos del torrente
sanguíneo en pocas horas.
 METODOLOGÍA

Extracción de ADN 10 minutos

MÉTODO DE
MÉTODO DE LISIS
PURIFICACIÓN

Lisis química Perlas magnéticas

Buffer de elusión Solución de lavado

3 veces

Tomado de: https://www.immunology.org/magnetic-beads-1977

 METODOLOGÍA

Procedimiento q-PCR multiplex

Procedimiento q-PCR multiplex
desnaturalización inicial a 95°C
durante 10 minutos, seguida de una
desnaturalización a 95°C durante 5
segundos y, a continuación, 40
ciclos consistentes en 60°C durante
31 segundos.

Tomado de: https://www.iaea.org/es/enfermedades-infecciosas/deteccion-del-virus-de-la-covid-19-mediante-la-rt-pcr-en-tiempo-

real

Verificación q-PCR multiplex
Verificación con muestras de sangre conocidas
Muestras dobles de los 10
patógenos experimentales
METODOLOGÍA
• 12 mujeres y 8 hombres
• Rango de edad: 25 a 70 años
Infecciones partícipes
• Infección pulmonar (6)
• Infección intestinal (9)
• Infección del tracto urinario (2)
• Infección del tracto biliar (2)
• Absceso hepático (1)
20 pacientes
 METODOLOGÍA

Verificación q-PCR multiplex

Prueba de sensibilidad Prueba de especificidad

Rango de detección DNA extraído de las muestras estándar

Series de diluciones de 10 veces Se repitió 2 veces

Control negativo
105 UFC/mL a 101 UFC/mL

Para las cepas estándar Cada concentración

se evaluó 10 veces
 METODOLOGÍA

Verificación q-PCR multiplex

Prueba comparativa de la PCR en tiempo real Multiplex y el cultivo de
sangre en pequeñas muestras clínicas con sospecha de sepsis

Pacientes con síntomas de sepsis Consideraciones

30 muestras de sangre • Temperatura >38 o <36°C

• Frecuencia cardiaca >90/min
• Frecuencia respiratoria >20 respiraciones/min
• Recuento de glóbulos blancos >12 000 células/μL o <4000 células/μL

Cultivo Sanguíneo
q-PCR multiplex
RESULTADOS

La frecuencia media de positivos para la PCR en tiempo

real Multiplex en varias concentraciones. La frecuencia
media de positivos para la PCR Multiplex en tiempo real
fue del 96% a una concentración de 1×102 UFC/mL, y fue
del 100% a una concentración superior a 1×103 UFC/mL
RESULTADOS

Los 10 tipos de cepas estándar experimentales mostraron

resultados positivos al ser detectados por la PCR en tiempo real
Multiplex basada en TaqMan. Los valores de TC de ≤35 ciclos se
registraron como resultados positivos. No se detectaron
productos de PCR cuando se utilizó ADN de otras cinco
bacterias en el ensayo de PCR Multiplex en tiempo real. Los
valores de CT de ≤35 ciclos se registraron como resultados
positivos
RESULTADOS
 CONCLUSIÓN

La q-PCR Multiplex basada en TaqMan pudo

reportar un resultado positivo porque se
pudieron detectar tanto los microorganismos
muertos como los viables. Este sistema puede
tener una alta sensibilidad y especificidad