Universidad de Oriente – Núcleo Anzoátegui

Escuela de Ciencias de la Salud

Trabajo de Grado

INFERENCIAS SOBRE LA RELACIÓN ESTRUCTURA

PRIMARIA–FUNCIÓN EN ESCORPIOTOXINAS ACTIVAS
SOBRE CANALES DE POTASIO, EMPLEANDO
HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS
Tutor: Tesis presentada por:
Prof. Stefano Bónoli Br. Koury Kachichian Krikor Alejandro
C.I: V-21.041.433

Barcelona, Noviembre de 2017

Introducción
 Las Escorpiotoxinas
• Los escorpiones abarcan
unas 1400-1500 especies
distribuidas en zonas
tropicales y subtropicales.
• Se estima que existen más
de 100.000
escorpiotoxinas diferentes
en todo el mundo, y solo
pocas han sido aisladas y
experimentadas.
Lourenco (2015), Possani y col. (1999)
 Las Escorpiotoxinas
• Las escorpiotoxinas son
fundamentalmente neurotoxinas
que actúan sobre canales
iónicos.
• Las toxinas activas sobre canales
de Na+ son las principales
responsables del efecto
neurotóxico en
envenenamiento, y las toxinas
activas sobre canales de K+
pueden tener efectos sinérgicos.

Possani y col.(1999), Rodríguez de la Vega y col. (2004),

 Las Escorpiotoxinas
• Las ScTxK son menos
abundantes que las que
actúan en canales de Na+, y
presentan potencial
farmacológico.
• Existe una gran brecha entre
el número probable de
escorpiotoxinas existentes, las
aisladas, las evaluadas
estructuralmente y
funcionalmente.

Soli y col. (2009), Yibao y col. (2009)

 Importancia de Estudiar la Estructura
Primaria
• La estructura primaria de una
molécula proteica es crítica
en la función que ésta
cumple.
• Una de las metas principales
de los análisis post-
genómicos es de caracterizar
propiedades de los genomas
y/o proteomas y descifrar su
conexión con características
biológicas conocidas.

Chen y col. (2013)

 Planteamiento del Problema
• El estudio de las
escorpiotoxinas es de
importancia en la clínica
del escorpionismo, como
fuente potencial de
fármacos y caracterización
de canales iónicos de K+.
• Conocer la función de las
toxinas es una actividad
lenta y costosa.

Matos (2010), Harvey y col, (1998), Brownell y col (2001), Possany (2007), Zhijian y col (2003)
 Planteamiento del Problema
• La bioinformática es el uso
de la tecnología de las
computadoras para la gestión
y análisis de datos biológicos.
• Recientemente se ha
incrementado el número de
ScTxK incorporadas en
Uniprot. Al 31/12/2016, 299
eran activas sobre canales de
K +.

Atwood y col (2002), Tan y col (2003, 2006)

Objetivos
 Objetivo General
• Inferir la función de ScTxK a partir de
algunos aspectos de su estructura
primaria empleando herramientas
bioinformáticas.
 Objetivos Específicos
• Comparar la composición aminoacídica de las
ScTxK con la de otros tipos de proteínas.
• Describir las secuencias de las diferentes
familias y subfamilias de ScTxK.
• Comparar la composición aminoacídica de las
diferentes familias y subfamilias de ScTxK
 Objetivos Específicos
• Determinar diversos parámetros
fisicoquímicos (punto isoeléctrico, índice de
inestabilidad, índice alifático, índice
hidropático global, volumen molecular) de las
familias y subfamilias de ScTxK.
• Establecer la dimensión fractal del perfil
hidrofóbico de las familias y subfamilias de
ScTxK.
Metodología
 Criterios de Inclusión
• Sólo se incluyeron en la muestra aquellas
toxinas reportadas en la base de datos
UniProt hasta el 31/12/2016.
 Minería de Datos
• Se accedió a la base de datos UniProt,
donde se seleccionaron bajo criterios de
búsqueda específicos, toxinas de
metazoarios.
• Se descargó una base de datos en formato
Excel que contuviese variables particulares
de cada toxina.
 Minería de Datos
• Solo se incluyeron en el estudio las
escorpiotoxinas que:
– Actuaran sobre canales de K+.
– Su función haya sido determinada
experimentalmente.
– No tuvieran errores o dudas en la secuencia de
la toxina madura.
– No tuvieran estructuras diméricas o carecieran
puentes disulfuro.
 Minería de Datos
• Se comparó la frecuencia de AA de las ScTxK con:
– La frec. teórica esperada de los codones del código
genético.
– La frec. de AA de todas las proteínas eucariotas.
– La frec. de AA de las toxinas de los venenos de otros
animales clasificados por orden (Araneae, Squamata
suborden Serpentes, Scorpiones, Sorbeoconcha).
• Se comparó la frec. de AA por grupos funcionales
de las ScTxK discriminadas por familias y
subfamilias.
 Minería de Datos
• Las secuencias de las diferentes familias y
subfamilias se alinearon empleando el
algoritmo MUSCLE del programa MEGA.
• Se generó la secuencia de consenso usando la
aplicación Simple Consensus Maker, y su
representación gráfica denominada logo.
 Minería de Datos
• Se utilizaron las herramientas bioinformáticas
ProtParam, ProtScale y un programa diseñado
por los autores para el cálculo de propiedades
fisicoquímicas de las ScTxK.
• Se hicieron análisis de inferencia estadística
para dos medias, mas de dos medias y
frecuencias absolutas y relativas.
Resultados y
Discusión
 Toxinas Seleccionadas
• Utilizando los parámetros de búsqueda descritos,
se arrojó un resultado de 12 413 secuencias
peptídicas de toxinas, de las cuales 6559 estaban
anotadas. Al depurar la B.D.D con los criterios ya
especificados, se contó con un total de 1758
canónicas.
• De las anteriores, sólo 316 en los venenos de
escorpiones, y 137 ScTxK
 Tabla 1. Comparación de frecuencia relativa de AA de
ScTxK con frecuencia teórica esperada por codones
Frecuencia Frecuencia
ScTxK teórica ScTxK teórica
Aminoácido (%) (%) p Aminoácido (%) (%) p
p<0,0001 p<0,001
Leu (L) 2,41 9,84 Phe (F) 2,31 3,28
Arg (R ) 4,62 9,84 p<0,0001 Gln (Q) 3,52 3,28 p=n.s.

Ser (S) 5,07 9,84 p<0,0001 Tyr (Y) 3,52 3,28 p=n.s.

Thr (T) 4,28 6,56 p<0,0001 Glu (E ) 3,66 3,28 p=n.s.

Val (V) 4,6 6,56 p<0,0001 Asp (D) 3,82 3,28 p=n.s.

Ala (A) 4,7 6,56 p<0,0001 Asn (N) 5,23 3,28 p<0,0001
p<0,0001 p<0,0001
Pro (P) 4,72 6,56 Lys (K) 12,94 3,28
Gly (G) 9,33 6,56 p<0,0001 Cys (C ) 17,25 3,28 p<0,0001

Ile (I) 3,5 4,92 p<0,0001 Trp (W) 0,5 1,64 p<0,0001
p<0,0001 p<0,05
His (H) 1,93 3,28 Met (M) 2,09 1,64
Frecuencia
absoluta a.a. 4975 - -

Significativamente mayor.
Leyenda Significativamente menor.
No significativa.
 Tabla 2. Comparación de frecuencia relativa de AA de ScTxK
con frecuencia de AA de todas las proteínas Eucariotas

ScTxK Eucariotas ScTxK Eucariotas

Aminoácido (%) (%) p Aminoácido (%) (%) p
9,29 p<0,0001 3,87 p<0,0001
Leu (L) 2,41 Phe (F) 2,31
Arg (R ) 4,62 5,71 p<0,005 Gln (Q) 3,52 4,21 p<0,05

Ser (S) 5,07 8,34 p<0,0001 Tyr (Y) 3,52 2,87 p<0,0005

Thr (T) 4,28 5,56 p<0,0005 Glu (E ) 3,66 6,42 p<0,0001

Val (V) 4,6 6,2 p<0,0005 Asp (D) 3,82 5,4 p<0,0005

Ala (A) 4,7 7,63 p<0,0001 Asn (N) 5,23 4,28 p<0,005
5,41 p<0,05 5,64 p<0,0001
Pro (P) 4,72 Lys (K) 12,94
Gly (G) 9,33 6,33 p<0,0001 Cys (C ) 17,25 1,76 p<0,0001

Ile (I) 3,5 5,1 p<0,0001 Trp (W) 0,5 1,24 p<0,0005
2,44 p<0,05 2,25 p=n.s.
His (H) 1,93 Met (M) 2,09
Frecuencia
absoluta a.a. 4975

Significativamente mayor.
Leyenda Significativamente menor.
No significativa.
Tabla 3. Comparación de frecuencia relativa de aminoácidos de ScTxK con la
frecuencia de aminoácidos de toxinas de animales de otros órdenes
ScTxK Scorpiones Araneae
Aminoácido P P
(%) (%) (%)
Ala (A) 4,70 5,56 p<0,05 5,34 p<0,05
Cys (C ) 17,25 13,62 p<0,0001 12,03 p<0,0001
Asp (D) 3,82 5,08 p<0,0001 5,61 p<0,0001
Glu (E ) 3,66 4,27 p<0,05 5,21 p<0,0005 Leyenda
Phe (F) 2,31 2,26 p=n.s. 3,56 p<0,0005
Gly (G) 9,33 10,59 p<0,005 8,44 p<0,05
Significativamente mayor.
His (H) 1,93 1,64 p=n.s. 1,79 p=n.s.
Significativamente menor.
Ile (I) 3,50 3,78 p=n.s. 3,98 p=n.s.
Lys (K) 12,94 10,63 p<0,0001 11,43 p<0,005
No significativa.
Leu (L) 2,41 4,15 p<0,0001 5,63 p<0,0001
Met (M) 2,09 1,11 p<0,0001 1,71 p=n.s.
Asn (N) 5,23 5,67 p=n.s. 4,89 p=n.s.
Pro (P) 4,72 4,31 p=n.s. 3,66 p<0,0005
Gln (Q) 3,52 2,28 p<0,0001 2,40 p<0,0001
Arg (R ) 4,62 3,91 p<0,05 4,06 p=n.s.
Ser (S) 5,07 5,00 p=n.s. 5,82 p<0,05
Thr (T) 4,28 3,79 p=n.s. 3,88 p=n.s.
Val (V) 4,60 4,28 p=n.s. 4,22 p=n.s.
Trp (W) 0,5 2,32 p<0,0001 2,76 p<0,0001
Tyr (Y) 3,52 5,75 p<0,0001 3,57 p=n.s.
Frecuencia absoluta a.a. 4975 14 637 - 18 156 -
Tabla 3. (Cont.) Comparación de frecuencia relativa de aminoácidos de ScTxK
con la frecuencia de aminoácidos de toxinas de animales de otros órdenes
ScTxK Squamata Sorbeoconcha
Aminoácido p p
(%) (%) (%)
Ala (A) 4,70 5,44 p<0,05 4,66 p=n.s.
Cys (C ) 17,25 8,87 p<0,0001 17,62 p=n.s.
Asp (D) 3,82 6,26 p<0,0001 4,52 p<0,05 Leyenda
Glu (E ) 3,66 5,10 p<0,0001 3,95 p=n.s.
Phe (F) 2,31 3,49 p<0,0001 3,08 p<0,005
Significativamente mayor.
Gly (G) 9,33 7,62 p<0,0001 9,21 p=n.s.
Significativamente menor.
His (H) 1,93 2,29 p=n.s. 2,56 p<0,01 No significativa.
Ile (I) 3,50 4,60 p<0,0005 3,27 p=n.s.
Lys (K) 12,94 7,39 p<0,0001 4,59 p<0,0001
Leu (L) 2,41 5,51 p<0,0001 4,18 p<0,0001
Met (M) 2,09 1,76 p=n.s. 1,48 p<0,001
Asn (N) 5,23 5,80 p=n.s. 4,59 p<0,05
Pro (P) 4,72 5,17 p=n.s. 6,75 p<0,0001
Gln (Q) 3,52 3,26 p=n.s. 2,97 p<0,05
Arg (R ) 4,62 4,72 p=n.s. 5,53 p<0,01
Ser (S) 5,07 6,00 p<0,01 7,08 p<0,0001
Thr (T) 4,28 5,27 p<0,005 4,02 p=n.s.
Val (V) 4,60 4,76 p=n.s. 3,92 p<0,05
Trp (W) 0,5 1,77 p<0,0001 2,06 p<0,0001
Tyr (Y) 3,52 4,91 p<0,0001 3,95 p=n.s.
Frecuencia absoluta a.a. 4975 77 509 - 5818 -
Tabla 4. Frecuencias absolutas y relativas de ScTxK clasificadas por familias

Frecuencia Frecuencia
Familia ScTxK absoluta relativa
(f) (%)

Alfa (α) 108 78,8

Beta (β) 6 4,4
Gamma (γ) 8 5,8

Delta (δ) 2 1,5

Epsilon (ε) 2 1,5

Kappa (κ) 6 4,4

Lambda (λ) 0 0,0

Cl/K 2 1,5

Na/K 2 1,5

Ca/K 1 0,7

Total 137 100,0

 Tabla 5. Clasificación en familias y subfamilias de ScTxK y su disposición de
puentes disulfuro
Formato de Número
Longitud Número de puentes Tipo de combinación
Familia Subfamilia secuencias de de
cadena disulfuro de puentes disulfuro
aminoácidos toxinas
Alfa 1 4 1-2,3-6,4-7,5-8 C2C4C5C3C10C4C1C 1
Alfa 2 3 1-4,2-3,5-6 C4C3C9C4C1C 1
Alfa 3a 3 C2C3C5C4C1C 3
Alfa 3b 3 C2C3C8C3C1C 12
Alfa 3c 3 C3C3C9C4C1C 1
Alfa 3d 3 C4C3C10C4C1C 4
Alfa 3e 3 C4C3C10C8C1C 1
Alfa 3f 3 C4C3C8C3C1C 6
Corta Alfa Alfa 3g 3 1-4,2-5,3-6 C4C3C9C4C1C 8
Alfa 3h 3 C5C3C10C4C1C 24
Alfa 3i 3 C5C3C11C4C1C 13
Alfa 3j 3 C5C3C12C4C1C 1
Alfa 3k 3 C5C3C5C4C1C 3
Alfa 3l 3 C5C3C6C4C1C 1
Alfa 3m 3 C5C3C9C4C1C 15
Alfa 4 3 1-5,2-4,3-6 C4C3C8C3C1C 1
Alfa 5 4 1-5,2-6,3-4,7-8 C5C3C5C4C4C1C2C 12
Tabla 5. (Cont.) Clasificación en familias y subfamilias de ScTxK y su disposición de
puentes disulfuro

Número de
Longitud Tipo de combinación Formato de secuencias Número
Familia Subfamilia puentes
cadena de puentes disulfuro de aminoácidos de toxinas
disulfuro
Gamma 1 3 1-4,2-5,3-6 C5C3C10C4C1C 2
Gamma
Gamma 2 4 1-4,2-6,3-7,5-8 C5C8C2C0C9C4C1C 6
Épsilon Épsilon 4 1-4,2-8,3-6,5-7 C2C3C0C3C4C4C1C 2
Corta
Kappa Kappa 2 1-4,2-3 C3C8C3C 6
K/Cl K/Cl 4 1-4,2-6,3-7,5-8 C2C10C2C0C5C4C1C 2
K/Ca K/Ca 3 1-4,2-5,3-6 C6C5C0C5C8C 1
Larga Beta Beta 3 1-4,2-5,3-6 C6C3C8C4C1C 6
Delta Delta 3 1-5,2-3,4-6 C8C15C7C12C3C 2
K/Na K/Na 3 1-4,2-5,3-6 C8C3C9C4C1C 2
Tabla 6. Clasificación en familias y subfamilias de ScTxK . Frecuencias absolutas y
relativas de aminoácidos por su polaridad y carga

Composición aminoacídica
Longitud Número de Número de Polares
Familia Subfamilia Apolares Ácidos Básicos
cadena toxinas aminoácidos neutros
f; (%) f; (%) f; (%)
f; (%)
Alfa 1 1 44 21(47,8) 7(15,9) 9(20,5) 7(15,9)
Alfa 2 1 37 13(35,1) 8(21,6) 9(24,3) 7(18,9)
Alfa 3a 3 86 38(44,1) 8(9,3) 20(23,3) 20(23,3)
Alfa 3b 12 328 162(49,4) 38(11,6) 77(23,5) 51(15,4)
Alfa 3c 1 41 17(41,5) 5(12,2) 10(24,4) 9(22,0)
Alfa 3d 4 156 84(53,8) 24(15,4) 24(15,4) 24(15,4)
Alfa 3e 1 41 15(36,6) 7(17,1) 10(24,4) 9(22,0)
Alfa 3f 6 207 108(52,2) 25(12,1) 38(18,4) 36(17,4)
Corta Alfa Alfa 3g 8 290 126(43,4) 63(21,7) 60(20,7) 41(14,1)
Alfa 3h 24 950 427(44,9) 165(17,4) 189(19,9) 169(17,8)
Alfa 3i 13 583 276(47,3) 97(1,6) 108(18,5) 102(17,5)
Alfa 3j 1 37 19(51,3) 8(21,6) 6(16,2) 4(10,8)
Alfa 3k 3 98 48(49,0) 23(23,5) 16(16,3) 11(11,2)
Alfa 3l 1 30 15(50,0) 6(20,0) 6(20,0) 3(10,0)
Alfa 3m 15 678 318(46,9) 74(10,9) 153(22,6) 133(19,6)
Alfa 4 1 31 15(48,4) 5(16,1) 6(19,4) 5(16,1)
Alfa 5 12 530 230(43,4) 91(17,2) 109(20,6) 100(18,9)
Tabla 6. (Cont.) Clasificación en familias y subfamilias de ScTxK . Frecuencias
absolutas y relativas de aminoácidos por su polaridad y carga

Composición aminoacídica
Longitud Subfamili Número de Número de
Familia Polares
cadena a toxinas aminoácidos Apolares Ácidos Básicos
neutros
f; (%) f; (%) f; (%)
f; (%)
Gamma 1 2 50 14(28,0) 16(32,0) 12(24,0) 8(16,0)
Gamma Gamma 2
6 300 110(36,7) 57(19,0) 77(25,7) 56(18,7)

Épsilon Épsilon 2 63 33(52,4) 9(14,3) 11(17,5) 10(15,9)

Corta
Kappa Kappa 6 155 63(40,6) 27(17,4) 36(23,2) 29(18,7)

K/Cl K/Cl 2 79 43(54,5) 12(15,2) 14(17,7) 10(12,7)

K/Ca K/Ca 1 38 17(44,7) 6(15,8) 9(23,7) 6(15,8)

Larga Beta Beta 6 389 172(44,2) 66(17,0) 84(21,6) 67(17,2)

Delta Delta 2 137 57(41,6) 27(19,7) 28(20,4) 25(18,2)

K/Na K/Na 2 146 71(48,6) 30(20,5) 28(19,2) 17(11,6)

Gráficos 1, 2, 3. Logos de secuencia de ScTxK: subfamilias alfa 3f, alfa 3g y gamma 2

Subfamilia alfa 3f

Subfamilia alfa 3g

Subfamilia gamma 2
 Tabla 7. Parámetros fisicoquímicos deducibles de la secuencia primaria de ScTxK
discriminadas por familias y subfamilias

Punto Índice de Volumen Dimensión

Longitud Número de Índice alifático Índice
Familia Subfamilia isoeléctrico inestabilidad molecular (Å3) fractal perfil
cadena toxinas (x ̅±d.e.) GRAVY
(x ̅±d.e.) (x ̅±d.e.) (x ̅±d.e.) hidropático

Alfa 3b 33,68±6,26 3738,92±221,26 -0,63±0,30 1,62±0,04

12 5,66±1,36 53,42±13,33

Alfa 3f 8,73±0,32 57,63±22,15 82,53±26,51 4005,67±313,24 0,09±0,29 1,65±0,01

6

Alfa 3g 6,67±2,37 38,40±13,45 29,12±8,25 4540,13±351,05 -0,65±0,32 1,60±0,03

8

Alfa 3h 9,14±0,33 35,62±12,80 40,12±16,94 4965,25±189,26 -0,50±0,39 1,64±0,02

Alfa 24

Corta Alfa 3i 9,26±0,06 39,41±11,67 58,01±11,25 5106,31±102,29 -0,33±0,23 1,66±0,01

13

Alfa 3m 9,32±0,12 35,26±17,88 43,23±8,23 4927,87±96,60 -0,49±0,12 1,66±0,01

15

9,01±0,20 39,30±22,59 26,09±12,16 4781,38±374,95 -0,66±0,30 1,62±0,02

Alfa 5 12

8,44±0,41 45,92±18,66 62,52±15,35 7653,33±1471,72 -0,40±0,29 1,66±0,02

Gamma Gamma 2 6

Kappa Kappa 6 8,57±0,33 38,55±8,95 16,14±4,76 5809,00±63,05 -0,87±0,13 1,60±0,02

5,96±2,03 78,31±21,40 28,63±28,32 3286,33±332,65 -1,05±0,60 1,59±0,02
Larga Beta Beta 6
Conclusiones
 Conclusiones
• En comparación con las toxinas de los metazoarios
seleccionados, las ScTxK tienen mayor carga
positiva y polaridad. En el caso de las conotoxinas,
tuvieron convergencia evolutiva funcional.
• No hubo diferencias significativas en la
composición funcional de aminoácidos de las
ScTxK.
• Hubo diferencias significativas en los parámetros
fisicoquímicos de las ScTxK.
Agradecimientos