METODOLOGÍA

Control microbiológico de tres muestras de las aguas

del rio Rímac por el método del número más probable.

• Medir 10 mL de cada muestra y diluir con 90 ml de agua peptonada, contenida en una

frasco de 100mL N01.Repetir estos pasos para cada una de las tres muestras.
• Con una pipeta estéril se toma 10 ml de la solución obtenida y se coloca en un frasco de
100mL N02, que contiene 90 ml de agua pectonada, y se homogeniza el tubo agitando 25
veces.
• Así se obtiene las disoluciones siguientes:
- En el frasco de 100mL Nº1: disolución de 10-1
- En el frasco de 100mL Nº2: disolución de 10-2
- En el frasco de 100mL Nº3: disolución de 10-3
- En el frasco de 100mL Nº4: disolución de 10-4
- En el frasco de 100mL Nº5: disolución de 10-5
Siembra en tubos con caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) Prueba
presuntiva de coliformes

• 10mL de la dilución de 10-1se siembra por triplicado en tubos de 10mL

de CLSS doble concentración (2X). Con una misma pipeta.
• 10mL de cada dilución se siembra por triplicado en tubos de 10mL de
CLSS simple concentración (X). Con una pipeta diferente por cada
dilución.
• Se coloca en una rejilla los tubos de ensayo con los caldos sembrados
y se lleva a la incubadora por 24-48 horas A 35ºC.
Numeración de entero bacterias por el método de recuento en placa.

• De las diluciones obtenidas, colocar un 1mL de cada una en cada

placa Petri estéril.
• Se agrega agar TSA fundido y enfriado a 45ºC en las placas Petri
estriles.
• Se procede a homogenizar la muestra y el agar mediante rotación y
vaivén.
• Incubar las cajas Petri en posición invertida a 35ºC por 48 horas.
• Pasado el tiempo respectivo en la incubadora, se procede al
respectivo conteo de colonias.
Siembra de tubos positivos en caldo BRILA (verde brillante bilis
lactosa) y en caldo EC

• Sembrar con dos asadas los organismos que se tienen en los tubos
positivos seleccionados a cada tubo que contiene 10mL de caldo
BRILA 2% y 10mL de caldo EC en paralelo.
• Terminado las siembras, el caldo BRILA, colocar en la incubadora por
24-48 horas a 350C y colocar el caldo EC sembrado en baño María a
44.50Cpor 24 horas.
• Luego realizar la lectura de los tubos positivos obtenidos en los tubos
de caldo EC y BRILA por el método del número más probable por
100mL de muestra.
Aislamiento e identificación y cultivo de microrganismos
eficientes Bacillus polymyxa y Bacillus licheniformis
 
• Medir 10ml de la muestra y diluir con 90 ml de solución salina NaCl (0.9%) y homogenizar.
• Con una pipeta estéril se toma 1 ml de la solución obtenida y se coloca en un tubo de
ensayo N01, que contiene 9 ml de solución salina, y se homogeniza el tubo agitando.
• Con una pipeta estéril se toma 1 ml de la solución del tubo de ensayo N01 y se coloca en un
tubo de ensayo N02, que contiene 9 ml de solución salina, y se homogeniza el tubo
agitando.
• Así se obtiene las disoluciones siguientes:
- En el tubo de ensayo N01: disolución de 10-2
- En el tubo de ensayo N02: disolución de 10-3
- En el tubo de ensayo N03: disolución de 10-4
- En el tubo de ensayo N04: disolución de 10-5
• Luego coger el tubo N03 y N04 y llevarlo a shock térmico a 80ºC por
15minutos en baño María de agua.
• Luego se siembra con espátula de Drigalsky en placas con medio agar
nutritivo por el método por agotamiento y el método de diseminación
y llevar a incubar a 37ºC por 24-36 horas.
• Se toma una muestra representativa de cultivos en fase estacionaria
para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas, para
realizarle una tinción Wirtz-Conklin, que requiere dos colorantes:
Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.
Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.
• Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí
lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.
• Preparar los frotis bacterianos indicados y Teñir con verde malaquita. Con unas pinzas de
madera colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee
durante 5 min, evitar que la muestra hierva. Añadir más colorante si éste se evapora; es
importante que la muestra no se seque y lavar con abundante agua el exceso de colorante.
Teñir con safranina 1 minuto y lavar con abundante agua el exceso de colorante.
• Secar la preparación y observar la preparación al microscopio.
• La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un
carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género.