Métodos de diagnostico en

Virologia
 ¿Por
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diagnostico
diagnostico
correcto?
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¿Es
¿Es necesario
necesarioel
el
diagnostico
diagnosticodede
laboratorio?
laboratorio?
Consideraciones en la toma de muestras
La posibilidad de aislar el virus es mayor durante el período inicial de la
enfermedad, cuando el título del virus es más alto y aún no ocurrió la
infección bacteriana secundaria.
La mejor muestra es la que proviene de un animal vivo o de uno
sacrificado recientemente.
Los virus dependen para su replicación de células vivas por lo tanto no
deben extraerse muestras de zonas necróticas, con exudado purulento, o
fuerte olor porque ello es debido a la infección bacteriana.
Las muestras deben conservarse a 4C o por
debajo de –40C (hielo seco o nitrógeno
líquido).
De ser posible las muestras deben remitirse
en un medio de transporte adecuado para el
diagnóstico virológico. Los medios para
bacteriología no sirven y los hisopos de
madera resultan tóxicos.
Utilice envases apropiados para recoger y
remitir muestras.
Procedimientos diagnósticos
Los procedimientos básicos para el diagnóstico de
laboratorio de virus son:
Aislamiento del virus
La demostración del virus o algún producto viral en las
muestras clínicas (método directo)
La detección y medición de los anticuerpos específicos
contra un virus (método indirecto).
Tiempo de espera para resultados
Aislamiento viral:
3 semanas
Diagnostico serológico:
Entre 24 y 48 horas
Diagnostico molecular:
6 -8 horas
Aislamiento viral
Durante la fase aguda de la enfermedad es el mejor
momento para demostrar y aislar virus.
A medida que la enfermedad avanza, se desarrollan los
anticuerpos, se reduce la excreción de virus y el virus es
despejado de los tejidos.
Las manifestaciones clínicas de la enfermedad
generalmente encausan la selección de la muestra clínica
apropiada:
Hisopos nasales y oculares en las infecciones de las vías
respiratorias altas
Heces de infecciones entéricas,
Sangre de infecciones sistémicas, etc.
Cultivos celulares
Los virus requieren de células vivas para poderse replicar.
En el laboratorio, se proporcionan células vivas como
cultivos celulares, cuyas células han sido obtenidas por
digestión enzimática de tejidos animales.
Las células son cultivadas en superficies de vidrio o plástico.
Cuando las muestras clínicas que contienen virus son
inoculadas en cultivos celulares susceptibles
El virus (si está viable) se replica y a menudo produce un
comportamiento característico de patología celular,
caracterizado por cambios en la apariencia celular, llamado
efecto citopático (CPE por sus siglas en ingles).
Efecto citopático
El efecto citopático son cambios degenerativos específicos
observados en una línea celular como consecuencia de la
replicación de un virus infectante. Éste puede aparecer
después de 3 ó 4 días.
A través de éstos cambios morfológicos celulares es posible
poner en evidencia la presencia de un virus en determinado
tipo de cultivo de células.
 Células HeLa

Células VERO
En algunos casos, el virus se replica sin ningún efecto
apreciable sobre las células
Debe ser demostrado mediante pruebas de tinciones
especiales que revelan cuerpos de inclusión viral o
anticuerpos fluorescentes (AF), para detectar antígenos
virales.
Inoculación de animales susceptibles
Aislamiento primero de algunos agentes etiológicos
Estudios de infectividad
Patogenia viral
Respuesta inmune
Oncogenesis viral
El método que se utiliza para inocular los virus a los animales
depende de la sensibilidad del huésped respecto al virus, así como de
la naturaleza de la prueba.
Intravenosa
Intracerebral
Intraperitoneal
Intranasal
Intratraqueal
Intradermica
 
Inoculación de embriones de pollo
Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus
durante mas de 70 años.
El cultivo de virus de influenza en huevo embrionado fue
empleado por primera vez por Burnet en 1935
El embrión de pollo es un medio muy sensible para el
aislamiento de estos virus, siendo además un medio estéril y
poco costoso.
Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades
del huevo fecundado, o en el propio embrión en desarrollo.
También se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar
ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de incubación
mas prolongado que el pollo
Sigue usándose huevo de gallina de 6 a 8 días de incubación
aproximadamente
Inoculación
de embriones
de pollo para
diagnostico
de influenza
aviar
Estructura y
puntos de
inoculación en
un embrión de
pollo
Diagnostico serológico
Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por
virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e
INDIRECTOS
Demostrar la presencia del virus o de alguno de sus
constituyentes (antígeno o genoma viral) o
La respuesta de anticuerpos específicos por parte del
huésped en el curso de la infección.
Sensibilidad y especificidad
Sensibilidad:
Se refiere a la cantidad mínima de anticuerpos o
antígenos o material nucleico que es necesaria para que
una prueba sea positiva
Especificidad:
Entre mas alto sea este valor (en %), disminuye la
probabilidad de una reacción cruzada
Inmunofluorescencia directa
Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas
sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar.
Luego se agregan anticuerpos específicos marcados con
isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la
membrana celular y se combinan con los antígenos víricos
en el interior de las células.
El advenimiento de los anticuerpos monoclonales, ha
incrementado la especificidad y en algunos casos la
sensibilidad de estos ensayos.
Esta técnica requiere sólo 2-4hs, y se ha reportado una
sensibilidad del 70-80 % comparada con cultivos celulares
para la identificación de virus Herpes Simple, 80-95% para
VRS y 71% para Influenza A.
Prueba de ELISA (Inmunoensayo ligado a enzima)
En la técnica ELISA el anticuerpo se marca con una enzima:
Fosfatasa alcalina (FA)
Peroxidasa de rábano (PR)
Para revelar la reacción se coloca el sustrato específico para
la enzima que es modificado por ésta y produce un
compuesto coloreado.
ELISA en emparedado
Inhibición de la hemoaglutinacion Hemoaglutinacion
Muestra Positiva Muestra negativa

Eritrocitos
pollo

Anticuerpos

Partículas virales
No hay hemoaglutinación
Prueba positiva a IA
1) Liquido alantoideo
1) Liquido
+ alantoideo
15 minuto
minutos
Suero testigo +positivo IA
Suero testigo positivo IA
Se agrega una gota de
solución de
eritrocitos.

3) Liquido alantoideo
3) Liquido alantoideo
+
+SSF
1 2 3 SSF

2) Liquido alantoideo
2) Liquido alantoideo
+
Suero testigo+positivo virus ENC
Suero testigo positivo virus ENC
Western blot
Utilizada para confirmar muestras positivas a ELISA
Detección especifica de proteínas o fragmentos de proteínas
virales, por ejemplo, de la cápside
Muy especifica si se utilizan anticuerpos monoclonales
Ventajas de los métodos serológicos
Son relativamente rápidos
Su especificidad y sensibilidad son altas (mayores a 70%)
Son baratos
Permiten trabajar con muchas muestras al mismo tiempo
Desventajas de los métodos serológicos
Se requiere de personal experimentado
Requieren de infraestructura especial
Su especificidad y sensibilidad dependen de una buena
muestra
Diagnostico molecular
La posibilidad de analizar la presencia de los ácidos
nucleicos del agente infeccioso en la muestra clínica
mediante técnicas de diagnóstico molecular.
Este procedimiento permite, entre otras ventajas, detectar
de una forma rápida microorganismos difícilmente
cultivables, como muchos virus (VIH, hepatitis B)
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Permite incrementar el numero de moléculas de l DNA
blanco de las muestras
Tiene una sensibilidad tan alta (99.999%) que puede
amplificar una única molécula de DNA y una sola copia de
genes puede ser extraída, de mezclas complejas de
secuencias genómicas (especificidad del 99.99%)
La PCR es, por tanto, una amplificación de secuencias
específicas del DNA.
Se basa en la utilización de secuencias cortas de
nucleótidos sintéticos llamados primers o cebadores, que se
hibridan de forma especifica con cada una de las cadenas de
DNA llamadas moldes o templados.
Consiste en 3 pasos:
1º Desnaturalización del ADN doble cadena
2º Acoplamiento de los cebadores (primers) sintéticos
3º Elongación del cebador usando una ADN polimerasa.
 BITACORA PARA REGISTRO DE ELECTROFORESIS

MÉTODO: PCR ENFERMEDAD – ESPECIE: LARINGOTRAQUEITIS-ILTV

FECHA: 15/04/2008 FOTO: 005
RESPONSABLE: Luz Dary Rodriguez-Claudia Calderón

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Concentración del gel: 1,50% 80v, 60 min, 8uL

MW: trackit 100bp INVITROGEN
NUMERO DEL CÓDIGO
CARRIL RESULTADO Observaciones
CASO INTERNO
1 C- AGUA OK
2 CE 005 OK
3 1326-11771G1 904 POSITIVO 1ER PCR
4 1326-11771G2 905 NEGATIVO
5 IVAX C+ OK
6 MPM NA NA
7 C- AGUA OK
8 CE 005 OK
9 1326-11771G1 904 POSITIVO 2DA PCR
10 1326-11771G2 905 POSITIVO
11 IVAX C+ OK
 RFLP: Polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción

00 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 HaeIII Sau96I NciI HaeIII Sau96I NciI

Producto amplificado de 1300 pb gen TK 1ra PCR

650 pb 350 pb 300 pb

Cepa vacunal o
campo baja
Sau96I Cepa virulenta virulencia
Sau96I
Ventajas de los métodos moleculares
La unión entre ácidos nucleicos es más fuerte que la avidez
del anticuerpo por el antígeno. También los ácidos nucleicos
son mucho más estables que las proteínas a alta
temperatura, alto pH, solventes orgánicos y otros
compuestos.
Los agentes infecciosos involucrados en la patogénesis de
una enfermedad pueden ser cuantificados aun cuando estén
presentes en cantidades de subpicogramos o como
infecciones latentes.
Son rápidos para identificar a las partícula viral, en tiempo
de 4 a 8 horas(PCR).
Permite detectar cantidades muy pequeñas de virus.
Presenta una sensibilidad y especificidad alta.
Desventajas de los métodos moleculares
Son caros, tienen un alto costo.
La necesidad de cebadores específicos para encontrar determinado
microorganismo , lo que implica un conocimiento adecuado de la
secuencia de nucleótidos del agente.
La aplicación de estas técnicas exige una infraestructura y entrenamientos
adecuados.
La prueba se tiene que efectuar en condiciones adecuadas de astringencia
es decir, a una temperatura, pH y concentración de cebadores y
nucleótidos adecuados.
Detección de Ac específicos
Las métodos indirectos a comparación de las pruebas directas son
aquellas en las que se demuestra, un contacto del huésped con el agente
viral, mediante la determinación de anticuerpos específicos contra el
virus.
Estos métodos o técnicas serológicas son las que se usan con mas
frecuencia para descubrir anticuerpos contra un determinado agente viral,
teniendo en cuenta que la exposición al agente viral produce una
respuesta por parte del sistema inmune del huésped.
Fijación de complemento
Prueba semicuantitativa
Se basa en la activación de la vía clásica del complemento
por la unión de un Ac con un Ag
Induce la formación del MAC, capaz de romper la
membrana celular
Prueba que sirve como “estandar de oro”
 Se dejan reaccionar
Eritrocito

Suero de cobayo
Ag

Comple

Ac
Ac

Suero problema
Sistema indicador
No hay lisis del sistema indicador: positiva
 Se dejan reaccionar
Eritrocito

Suero de cobayo
Ag

Comple

Ac

Suero problema: sin Ac

Sistema indicador

Lisis del eritrocito del sistema indicador: negativa

Inmunofluorescencia indirecta
Es un método rápido y confiable que permite la detección
de anticuerpos o antivirales en el suero de paciente.
Se basa en la unión de anticuerpos antivirales presentes en
el suero del paciente a los antígenos virales expresadas en la
superficie de células infectadas.
ELISA indirecta