Universidad Nacional del Santa

Facultad de Ciencias
Departamento de Biología, Microbiología y Biotecnología

Replicación del
ADN

Blga. Pesq. Eliana Zelada Mázmela

Replicación del ADN
 Replicación del ADN

El dogma central establece que el ADN cumple dos

funciones:
a) Producir copias de sí mismo: Garantiza que el ADN
de la célula madre, de lugar a dos moléculas de ADN
hijas de idéntica secuencia

Flujo: Célula madre célula hija Replicación

b) Servir de molde para otras moléculas: Al modo en

que se consigue por el ADN el control de la síntesis
de polipéptidos, cuya estructura primaria está
inserta en él.

Flujo: Núcleo citoplasma Transcripción y

traducción
El significado genético de la
replicación es el de conservar la
información genética, de manera
que cuando una célula se divide, dé
lugar a una célula hija que contenga
la misma información genética.
 Característica de la Replicación
a) Se inicia en una unidad de la replicación: replicón
• 1 unidad: bacterias, virus, plásmidos, mitocondria,
cloroplastos Unifocal
• varias unidades: eucariotas, no funcionan
simultáneamente, están activados por período largo de
tiempo y se activan una vez por cada ciclo celular.

Replicón
Longitud del
fragmento de ADN
que se replica en
cada suceso de
replicación a partir
de un solo origen
b) Debe replicarse el genoma completo una vez por
cada ciclo celular
• La iniciación de la replicación compromete a la célula
a dividirse
• Si se inicia la replicación, la división celular no se
realiza hasta que no se haya completado la
replicación.

c) La nueva cadena crece en sentido 5’ 3’

d) Es semiconservativa
e) Es bidireccional: Burbuja de crecimiento con dos
horquillas: Jhon Cairns
Por qué la
dirección de la
replicación es en
sentido 5’ 3’?

Mecanismo eficiente
de corrección de
errores
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120073/micro03.swf
 Experiencia de A. Kornberg
 Descubrieron y aislaron en 1957 una
enzima capaz de polimerizar
nucleótidos, “in vitro”, a partir de
extractos de E. coli ADN pol I
 No necesita ser específica a priori de
un determinado tipo de ADN
Pol bacterias sintetiza ADN animal
 Debe de existir un extremo 3’
hidroxílico (OH) libre y un molde
 Se requiere 5’ desoxinucleótido
trifosforilado de A, T, C, G; DNA templete
polimerizado y Mg++
Delta G: -3.5 Kcal/mol

Delta G: -7.0Kcal/mol
 Semiconservadorismo

 Basado en el principio de apareamiento o

complementariedad
 Experiencia de Mattew Messelson y James Sthal
 Cuando el ADN se replica, la cadena madre
proporciona una hebra para cada una de las
moléculas hijas híbrido
Hipótesis de la replicación
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swf
Experiencia de
Taylor, Woods y
Hughes (1957):
Estudiaron el
semiconservadorismo
pero en cromosomas
de organismos
superiores,
trabajando con
autorradiografías:
Vicia faba
 La maquinaria de replicación del ADN
Problemas elementales de la replicación del DNA
 Las Dna pol no son capaces de disociar el dúplex
 Las DNA pol sólo pueden alargar la cadena de DNA
presente
 Las dos hebras del dúplex tienen polaridad química opuesta,
pero todas las DNA pol catalizan la adición de nucleótidos en
el extremo 3’, de modo que ésta sólo puede crecer en
sentido 5’ 3’
 Las hebras están superenrolladas ( procariotas)
Superenrollamiento positivo: Cuando el ADN se enrolla en el
mismo sentido que las vueltas intrínsecas del dúplex. Existen menos
nucleótidos que los propuestos por Watson y Crick
Superenrollamiento negativo: Cuando el ADN gira alrededor a
su eje en sentido contrario a las vueltas intrínsecas del dúplex.
Existen más nucleótidos que los propuestos por Watson y Crick
 Elementos que participan en la replicación
 DNA A

 DNA B-C helicasa

Primasa: Cataliza la síntesis de un ARN cebador. Es una

RNA pol.

 Topoisomerasas: Eliminan o añaden superenrrollamientos

 SSBP

 ADN pol III

 ADN pol I
Topoisomerasas de la clase II: Cortan ambas
cadenas. Está la Girasa. Cuando se separan las dos
hélices durante el avance de la horquilla de replicación
se producen superenrollamientos positivos en otras
regiones que relajan la tensión.

La Girasa se necesita para eliminar los

superenrollamientos positivos que se generan por
delante de la horquilla de replicación, introduciendo un
superenrollamiento negativo. En eucariotas relaja
superenrollamientos positivos pero sin incluir
superenrollamientos negativos

Lo logran al organizar los nucleosomas

 ADN pol III

A diferencia de lo que ocurre con la ADN Pol I, que

sólo debe añadir unos 5-10 nucleótidos una vez
eliminado el cebador, es importante que la ADN Pol
III sí sea muy procesiva, y por esa razón suele
formar parte de un complejo denominado holoenzima
ADN Pol III que le da una mayor procesividad.
Este complejo consta de diversas subunidades
polipeptídicas encargadas cada una de una función, y
que constituyen en su conjunto un dímero asimétrico:
una mitad se encarga de la síntesis de la hebra
adelantada y la otra mitad de la hebra rezagada.
La ADN Pol III y la ADN Pol I son las enzimas que
intervienen directamente en la replicación del ADN de E.
coli.
La ADN Pol I tiene un papel reparador, retira los
cebadores con su actividad exonucleasa 5' 3' y rellena
el hueco con su actividad polimerasa 5' 3'.
Está compuesta por 10 polipéptidos diferentes y posee
baja procesividad (está pobremente unida al DNA).
También puede tener actividad exonucleasa 3’ 5’,
sólo si el nucleótido está mal apareado

A la ADN Pol II se la asigna exclusivamente una función

reparadora, pero muchas de sus características y el
papel que juega en la replicación del ADN, si es que juega
alguno, son desconocidas.
La ADN Pol III es la enzima que realiza la mayoría de la
replicación del ADN

 Corazón catalítico: O núcleo polimérico, formada por:

- a: Contiene el sitio activo para la adición de nucleótidos
- E: Es una exonucleasa 3’-----5’, extrae los nucleótidos mal
agregados

El resto hace que el núcleo permita que la enzima pase de ser

distributiva (10 a 50), a procesiva (5 x 105 nucleótidos sin
separarse de la plantilla)
La clave en ésto lo tiene el péptido B que es capaz de formar
un dímero en forma de rosca alrededor del ADN
abrazadera , que se asocia luego al núcleo y lo mantiene cerca
del extremo 3’ de la hebra en crecimiento y no se separe del
ADN
Sujeta la ADN Pol III
al ADN

Aumentan
Actividad
procesividad
correctora

Mantiene estructura
dimérica
 Iniciación de la replicación:
Participa una CHON A (20 subunidades proteicas) codificada
por el gene dnaA, que es capaz de unirse a OriC. 245 pb
Reconoce las secuencias ricas AT formando un complejo
inicial. Necesita de ATP para cortar los enlaces y formar un
complejo abierto.
Para que se inicie la replicación se necesita que el dúplex
presente un superenrollamiento negativo (son más fáciles de
disociar localmente), papel cumplido por la topoisomerasas

La DnaB
Es una helicasa que se ubica una en cada hebra cortada,
avanza cortando los enlaces H del dúplex, utilizando ATP, pero
inducen la aparición de superenrollamientos positivos. Las
cadenas separadas están impedidas de reasociarse debido a
que se unen a CHON SSB.
Las dos cadenas de la plantilla se copian conforme crece la
burbuja de replicación. Cada extremo de ella representa una
horquilla o punto de crecimiento.
En una horquilla de crecimiento, una cadena, la conductora, se
sintetiza de manera continua y la otra discontinua o
atrasada. Se mueve alrededor de 1000 pn.sec y 100 in
man
Cómo se sintetiza la hebra conductora?

 Requiere de un
extremo 3´OH
 La ADN pol no
puede colocar el
primer nuc
 Necesita de la
primasa
 Coloca de 5 – 15
ribonucleótidos
 Síntesis de los fragmentos de Okasaki

Aparentemente la maquinaria replicativa se desplaza hacia

atrás, yendo la horquilla hacia delante.
El molde de la hebra atrasada se encuentra formando un
bucle, que hace que esa distancia corta esté orientado en
la misma polaridad que el molde de la hebra conductora,
por lo que la maquinaria replicativa podrá avanzar en la
misma dirección de la horquilla sintetizando ambas
cadenas
A medida que el bucle se agranda, la maquinaria se
encontrará con el extremo 5’ del RNA de un fragmento
sintetizado, lo que determina que la ADN pol III se separe
Luego actúa la ADN pol I, retirando los cebadores con su
actividad exonucleasa 5'- 3' y rellenando el hueco con su
actividad polimerasa 5'- 3'. La unión de los fragmentos lo
hace una ligasa con ATP
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swf
La ligasa acopla la hidrólisis del ATP para hacer más favorable la
reacción de unión del P con el OH libre

(Alberts et al., 2015)

 Inicio de la síntesis de ADN

La síntesis del ADN se inicia en un sitio especializado

conocido como origen de replicación (OR). Esta es una zona
normalmente rica en A-T.

La proteína A reconoce el OR y luego ingresa la

desestabilizadora de la hélice (helicasa) desenrollando
OR

3’OH 5’P

5’P 3’OH

Un fragmento de ADN que posee un origen de replicación

es un replicón
 Síntesis de ADN en la horquilla

Helicasas:
Abren la doble hebra
consumiendo energía

3’OH 5’P

5’P 3’OH

ATP ADP + PP
Proteínas de unión a
ADN de una hebra: Topoisomerasa:
Impiden que las hebras se Hacen cortes transitorios
vuelvan a unir. en el ADN para relajar la
doble hebra
 Síntesis de ADN en la horquilla

3’OH 3’OH 5’P

5’P 3’OH 3’OH

Una enzima especializada (Primasa), agrega un corto segmento de RNA

partiendo del origen de replicación. Esto genera un extremo 3’OH para
que pueda actuar la ADN polimerasa (ADN pol)
 En una de las hebras (hebra líder), la síntesis
transcurre en dirección 5’ a 3’,

ora Hebr
gui d a líd er
se o
He bra

5’P 3’OH
3’OH 5’P

5’P 3’OH 3’OH

5’P
5’P

Hebr ora
a líd er gu i d
o a se
He br

mientras que la otra queda en sentido inverso al de

polimerización de los nucleótido (hebra seguidora o retardada) , y
por ello la síntesis es más lenta
 Replicación en la horquilla

ARN polimerasa
(Primasa)
ADN polimerasa
o (DNAPol)
Hebra líder

5’P 3’OH

Extremo cebador 5’P

Fragmento de
Partidor de ARN Okazaki
Melladura (nic) ADN 3’OH

3’OH
Ligasa 3’OH

5’P

o Hebra seguidora (retardada)

Adenina Timina Guanina Citocina

La proteína Tus
se une al DNA
en la región
Ter. Es una
contrahelicasa
que evita que
se desenrolle
el DNA e
inhibe la
actividad
helicasa de la
proteína
DnaB.
Corrección de prueba

Se ve como retira la adenina

en la dirección 3’ 5’
(Alberts et al., 2015)
 Experiencia
de Cairns
en 1957

. Circular

. Origen
. Semiconservadora
. Un solo punto de
crecimiento (error)

Girasa: ADN
concatenado
Replicación en Eucariotas
La velocidad de replicación es 100 nc/sec, que es aprox la
décima parte de la velocidad en bacterias
Ciclo celular
En células
animales en
cultivo, la S
demora 8 horas
de un ciclo de 24.
Puede demorar el
ciclo hasta 200
horas.
En levaduras, el
ciclo demora 1-4
horas
TIENEN QUE
COORDINAR
SINTESIS CON
DIVISION
 Origen no bien caracterizado en eucariotas
superiores. Posiblemente tengan decenas o centenas
de nuc. En levaduras secuencias consenso rica A-T
 La replicación del DNA ocurre en múltiples orígenes
de replicación (replicones), que se distribuyen a lo
largo de cada cromosoma. Aproximadamente 400
replicones distribuidos en 16 cromosomas de
levaduras. En humanos se estima que hay miles de
horquillas distribuidos en los 23 pares. 25000 en
mamíferos
 No todos se activan simultáneamente: grupos de 20 a
80 adyacentes, de manera secuencial unidades de
replicación.
 Distancia entre origen y origen: 30000 a 250 000 pb
La iniciación requiere:
-Una proteína de reconocimiento del origen: ORC
-Un tramo de ADN rico en AT
-ORC siempre está unido al origen en todo el cc, sólo se
desprende cuando el origen será replicado
-Está controlado por dos proteínas cargadoras de helicasa:
Cdc6p y Cdt1p que reclutan un complejo proteico de seis
proteínas: Mcm donde se encuentra helicasa
-Todo esto forma un complejo prereplicativo G1
- Se sintetiza ciclina A desencadena la fase S
degradación e inhibición de Cdc6p y Cdt1p. Fosforila ORC

 La topoisomerasa I relaja superenrollamientos + y -

 La topoisomerasa II puede relajar superenrollamientos +, pero
no puede introducir superenrollamientos -.
Ciclina A
La fosforilación lo marca para
degradación
El origen ingresa en un período refractario que
corresponde a la metilación de las A en su secuencia
CHON RPA actúan como SSBP Tres unidades

La DNA pol δ (delta) es la que polimeriza en ambas hebras

La ADN pola, se asocia a una primasa se une a cada hebra

plantilla desenrollada. La primasa forma el cebador ARN y
la pol δ alarga las cadenas que se desplazan en sentidos
opuestos y constituyen la primera parte en ambas cadenas.
Pol δ es estimulada por RFC, luego se separa de la plantilla.
Igual es para la atrasada.

La pol δ se une a PCNA (antígeno nuclear de célula

proliferante) y aumenta la procesividad de la adelantada
Los nucleosomas tienen que ser desplazados o evitados,
pero se vuelven a organizar detrás de la horquilla.
La replicación de los extremos
de los cromosomas
eucarióticos supone un
problema, ya que los
cromátidas son moléculas de
ADN doble hélice lineal y se
irían acortando en las
sucesivas replicaciones al
quitarse el cebador
Los telómeros tienen
secuencias repetidas en los
extremos, (5' TTGGGG 3').
Además tienen extremos 3'
monocatenarios que pueden
autoaparearse y suministrar
un extremo 3' para replicar
los extremos cromosómicos
08000|09000|10000|11000|12000|13000|14000|15000|16000|17000|18000http://bcs.whfreeman.com/lodish5e/pages/bcs-
main.asp?v=category&s=00010&n=04000&i=04010.06&o=|00510|00610|00520|00530|00540|00560|00570|00590|00600|
00700|00710|00010|00020|00030|00040|00050|01000|02000|03000|04000|05000|06000|07000||19000|20000|21000|22000|23000|
99000|&ns=260
 D N ,
e l A
d e r e l a
t en n t r
En nte e l a
e
pu ímica y
u , e s
Q g í a
io l o r l o
B ir a
a d m
Ahora las declaraciones
de Watson y Crick
sobre el ADN. Esto es
para mí la prueba
verdadera de la
existencia de Dios.
Salvador Dalí