Characterization of Seeding Conditions for Studies

on Differentiation Patterns of Subventricular Zone

Derived Neurospheres

Front Cell Neurosci. 2016 Mar 7;10:55

Introducció n
• Para el estudio de la diferenciación, la supervivencia, la
maduración y la migración de células progenitoras, la unión a
compuestos de recubrimiento sintéticos es necesaria para el
éxito de estos experimentos.

• Poli-D-lisina (PDL) y Poliornitina (PornT) son factores de unión

no específicos que promueven la adhesión celular a sustratos
sólidos.

• Cadenas de aminoácidos resistentes a la degradación

enzimática.

• Estudio de las características y los procesos celulares.

• Los marcadores celulares permiten estudiar los mecanismos de diferenciación
en las neuroesferas.

• Nestina → Proteína de filamento intermedio que se expresa en células en división. Su

expresión va desapareciendo durante la transición de la neurosfera a la neurona.

• GFAP→ Astrocitos

• Estados de transición pueden investigarse por sus mecanismos moleculares.

• Akt, GSK3-β y sus dos formas fosforiladas desempeñan papeles importantes en la

proliferación celular, el crecimiento celular y la síntesis de proteínas en las
neuronas.

Objetivo
Investigar qué compuesto de recubrimiento (PDL vs. PornT) y qué concentración es
más adecuada para inducir la diferenciación celular adecuada y la posible
influencia del recubrimiento en la respuesta a las intervenciones químicas.
 Material y métodos
Animales
Ratones C57BL/6
• Días postnatales 3–6
• Ciclo 12 h luz / 12 h oscuridad
• Acceso libre a agua y alimentos

Preparación de células progenitoras neurales

• Los cerebros se incubaron en medio de disección [1% penicilina / estreptomicina (P / S) y 99% de solución salina
equilibrada de Hank (HBSS)].
• Zona subventricular (SVZ) se incubó con tripsina al 0,05% 10 minutos a 37 ° C.
• Medios de cultivo (DMEM / F-12 + GlutaMAX +B27 al 2%, P / S al 1%, EGF 10 ng / ml, FGF-2 5 g / ml)
• Pase →cuando alcanzaron un diámetro de aproximadamente 0.05–0.1 mm.

Cultivo celular y condiciones de recubrimiento

• Las placas P24 se recubrieron durante la noche con PDL o PornT a concentraciones de 10, 50 y 100 μg / ml .
• Los grupos mixtos contenían 5 μg / ml de PDL y 5 μg / ml de PornT (“5 + 5”) o 10 μg / ml de PDL y 10 μg / ml de PornT
(“10 + 10”).
• Las neuroesferas se sembraron 50 esferas / pocillo.
• Para los ensayos de inmunocitoquímica y migración, las neuroesferas se colocaron sobre cubreobjetos de vidrio,
mientras que para los experimentos de extracción de proteínas, las neuroesferas se sembraron directamente en placas
P24.
• Tiempo de diferenciación →24 h.
 Western Blot

Anticuerpos primarios:
• Anti-nestina de conejo (1: 500)
• Anti-β-actina de conejo (1: 2,000)
• Anti-GFAP de rata (1 : 1000)
• Conejo anti-p-AKT (1: 2,000)
• Conejo anti-Akt (1: 2,000)
• Anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano anti-rata o anti-conejo

Inmunocitoquímica

Anticuerpos primarios: Anticuerpos secundarios:

Anti-nestina conejo (1: 1,000) Anti-conejo burro 488
Anti-rata burro 594
Anti-GFAP rata (1: 1,000) Núcleos
DAPI

Análisis de imagen
• Microscopio vertical Olympus BX51
• ImageJ
• NeuronJ
Ensayo de migración a la neuroesfera

Las neuroesferas de 100 a 200 μm se sembraron en cubreobjetos recubiertos a

concentraciones de 50 μg / ml de PDL o PornT.
Estimulación→ 500 ng / μl de factor-1alpha derivado de células estromales o 50 UI /
ml de rhEpo .
La expansión se siguió durante 8 h en un microscopio invertido Zeiss.
Se tomaron imágenes cada 10 minutos con un objetivo 10x.
10 neuroesferas en un total de 3 a 4 experimentos por condición.

rA = fA/ iA
rA → relación del área de la esfera
fA→ es el área al final de la grabación
iA→ es el área al comienzo de la grabación.

Estadística

• Sigma-Plot software
• Media ± DE
• ANOVA de una vía -corrección de Bonferroni.
• Mann-Whitney
• P ≤ 0,05
 Resultados
Efectos del aumento de las concentraciones de Poli-D-lisina en la maduración
de las neuroesferas después de 24 h.
Efectos del aumento de las concentraciones de Poliornitina en la
maduración de las neuroesferas después de 24 h.
Expresión de proteínas intracelulares después de 24 h de cultivo de
neuroesferas en diferentes concentraciones de recubrimiento de poli-D-lisina.
Expresión de proteínas intracelulares después de 24 h de cultivo de
neuroesferas en diferentes concentraciones de recubrimiento de Poliornitina.
Efectos de las concentraciones mixtas de Poli-D-lisina y Poliornitina en la
maduración de las neuroesferas después de 24 h.
Expresión de proteínas intracelulares después de 24 h de cultivo de
neuroesferas en diferentes concentraciones de recubrimiento de Poli-D-lisina
+ Poliornitina.
El aumento del área de la neurosfera es independiente de la condición del
recubrimiento.
Las neuroesferas responden de manera similar a las intervenciones químicas
independientemente de la condición del recubrimiento.
Discusió n
• PDL y PornT pueden usarse para cultivar células progenitoras,
ya que ambos materiales de recubrimiento logran resultados
equivalentes.
• El patrón de diferenciación de las neuroesferas se altera
significativamente cuando solo se usan 5 μg / ml de un
compuesto.
• No hay diferencias con respecto a las vías moleculares de la
neurogénesis y la diferenciación según las condiciones de
recubrimiento.
• Las proteínas involucradas en las vías apoptóticas aún deben
investigarse.