Células madre pluripotentes inducidas

(iPSC) Organoides pulmonares humanos 3D

derivados de diferentes etnias para
comprender el porcentaje de severidad /
infectividad del SARS-CoV2
04/06/2020
Ivonne Landeros Alcibar
De hecho, la pandemia de SARS-CoV2 ha encogido de
hombros al mundo entero, cambiando el estilo de vida y la
interacción social de las personas al mínimo. A pesar de las
estrictas medidas, la pandemia sigue cobrando muchas vidas
a nivel mundial en la mayoría de los países. Sin embargo, el
hecho interesante es la diferencia en las tasas de mortalidad
basadas en etnias. Por lo tanto, una mejor comprensión del
porcentaje de gravedad / infectividad de las infecciones por
SARS-CoV2 es la necesidad actual, ya que las infecciones
graves afectan el tracto respiratorio inferior y a menudo
conducen a la muerte.
Por lo tanto, proponemos una mejor comprensión in vitro de
la enfermedad utilizando un modelo organoide pulmonar 3D
derivado de células madre pluripotentes inducidas basadas
en la etnia y las células progenitoras pulmonares, es decir,
las células epiteliales transitorias bronquiales que son más
atacadas por el SARS-CoV2.
Entonces, Es importante comprender por qué hay una
diferencia en las tasas de mortalidad en poblaciones de
diferentes etnias en todo el mundo. En consecuencia,
proponemos una estrategia in vitro para comprender la
diferencia en las tasas de muerte en diferentes etnias debido
a las infecciones por COVID-19.
Organoides de pulmón humano
derivados de iPSC de diversas
etnias para comprender el
porcentaje de severidad /
infectividad del SARS-CoV2
Hasta la fecha, los sistemas in vitro más utilizados para
comprender el comportamiento y las respuestas a los fármacos
de varios coronavirus del síndrome de dificultad respiratoria
aguda grave (SARS) se basaban en líneas celulares cultivadas
en 2D. Tales líneas celulares son Vero y Vero6 + del mono
verde africano, HEK-293 derivado de riñón fetal humano,
HEPG2 y Huh7, ambas líneas celulares de carcinoma
hepatocelular y la línea celular de carcinoma pulmonar A549
[ 1]. Sin embargo, debido al origen no pulmonar de la mayoría
de las líneas celulares, a excepción de la línea celular A549, y
dos de estas de origen mono, nuestra búsqueda para
comprender el porcentaje de severidad / infectividad del SARS-
CoV2 usando tales sistemas modelo puede no ser lo más
apropiado.
En segundo lugar, la línea celular A549, que proviene
del carcinoma de pulmón, tampoco puede imitar un
pulmón normal que está infectado por el SARS-CoV2.
Lo que es más importante, debido a la diferencia en el
porcentaje de gravedad / infectividad de la pandemia
actual de COVID-19 en varias poblaciones étnicas,
proponemos el uso de sistemas de modelos de
organoides pulmonares humanos (HLO) 3D derivados
de iPSC de diferentes etnias. En nuestra opinión, estos
modelos 3D-HLO serán los mejores imitadores del
tejido pulmonar humano normal.
Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) se
pueden diferenciar en el tejido pulmonar endodérmico en
condiciones 2D. Los pasos de diferenciación in vitro
siguen la organogénesis pulmonar in vivo mediante la
modulación de diversas vías de señalización celular
utilizando diversas citocinas. Los organoides pulmonares
humanos 3D, como contrapartes del tejido pulmonar fetal
humano, también se han desarrollado a partir de iPSC
secuencialmente obteniendo primero esferoides del
intestino anterior ventral anterior, que tras la expansión
han dado como resultado la formación de organoides
pulmonares humanos 3D (HLO).
Tal HLO 3D es principalmente una combinación de
múltiples tipos de células y compartimentos que se
asemeja a un pulmón fetal. Una vez más, debido a las
infecciones por SARS-CoV2, las tasas de mortalidad
entre los niños fueron bajas; por lo tanto, un HLO 3D que
se asemeje al tejido pulmonar fetal puede no tener mucha
importancia. Por lo tanto, se requeriría una imitación en
3D del pulmón humano adulto. Se han desarrollado
modelos tridimensionales HLO de vías respiratorias de
adultos mediante la incorporación de ciertos
biomateriales, a saber, andamios de poli (lactida-co-
glicólido) (PLG) o policaprolactona (PCL) durante el
proceso de diferenciación.
Por tanto, el protocolo actual de Dye et al. (2020) para
obtener HLO 3D que se asemeje a las vías respiratorias de
los adultos puede considerarse el más apropiado [ 3 ].
Para conocer la fuente de las iPSC específicas de la etnia,
primero se debe verificar la base de datos para ver la
elección de las líneas de iPSC. De hecho, los grandes
repositorios de iPSC han hecho y han estado haciendo un
gran trabajo para criopreservar una gran colección de líneas
de iPSC de diversas etnias como chinos, indios, caucásicos,
japoneses, africanos y malasios, etc. El banco europeo de
células madre pluripotentes inducidas (EBiPSC-
( https://ebisc.org/ ) tiene un stock de 894 líneas celulares
hasta la fecha y se abrió al público en 2016.
Este depósito recibe líneas celulares de varios depositantes y
las somete a un control de calidad antes de su
almacenamiento y distribución. Los detalles como el origen
étnico, la edad y las especificidades de la enfermedad de
todos los disponibles con las EBiPSC se registran en el
Registro de células madre pluripotentes humanas (hPSCreg)
( https://hpscreg.eu/ . Del mismo modo, la fundación de células
madre de Nueva York (NYSCF) ) ( https://nyscf.org/research-
institute/repository-stem-cell-search/ ) también tiene una
colección de iPSC de diferentes etnias.
En la Figura 1 se ha resumido una representación esquemática
para comprender el porcentaje de gravedad / infectividad del
SARS-CoV2 de diferentes etnias . Como ejemplo de
comprensión del porcentaje de gravedad / infectividad del
SARS-CoV2, en caucásicos / italianos, se puede tomar la línea
hiPSC CSSi001-A ( https://hpscreg.eu/cell-line/CSSi001-A) para
derivar 3D HLO. El material de partida de esta línea celular fue
el fibroblasto dérmico de un varón italiano sano portador de una
enfermedad llamada síndrome de Joubert. Se espera que los
organoides pulmonares 3D diferenciados de esta línea celular
produzcan tejido pulmonar normal, ya que el síndrome de
Joubert está asociado con defectos del desarrollo en el
cerebro.
Además, el donante de tejido de esta línea celular había sido un
portador sano de la enfermedad. Recientemente, un tipo de
células progenitoras pulmonares, a saber, las células epiteliales
transitorias bronquiales (BTEC), son más atacadas por el SARS-
CoV2 [ 5], en comparación con otros tipos de células. Por lo tanto,
las iPSC de diferentes etnias se pueden diferenciar en esferoides
3D-BTEC para una lectura posiblemente mejor de los
experimentos (Figura-1). Finalmente, para las evaluaciones in
vitro del porcentaje de severidad / infectividad del SARS-CoV2, se
pueden optimizar varios parámetros como la dosis viral y el
tiempo para infecciones leves, moderadas y severas, seguidas de
la cuantificación de proteínas virales (Figura-1).
En conjunto, considerando la especulación de
una segunda ola más grande de pandemia de
SARS-CoV2, la detección de drogas para
modelos 3D in vitro basados ​en etnias puede
dar algo de esperanza.
Perfil de activación inmunitaria diferencial de la
infección por SARS-CoV-2 y SARS-CoV en células
pulmonares e intestinales humanas: implicaciones para
el tratamiento con IFN-ß e inductor de IFN

1-10/10/2020
El cribado de las muestras clínicas de pacientes con COVID-19
mostró grandes cantidades de diseminación viral en las
secreciones respiratorias y las heces, lo que indica que el tracto
respiratorio e intestinal eran los principales órganos diana de
la infección por SARS-CoV-2. Sin embargo, falta una
caracterización detallada de la interacción virus-huésped en el
pulmón humano infectado y en las células epiteliales
intestinales. Por lo tanto, utilizamos ensayos de
inmunofluorescencia, citometría de flujo y RT-qPCR para
delinear las características virológicas y la respuesta inmune
innata de las células huésped contra la infección por SARS-
CoV-2 en dos prototipos de líneas celulares humanas que
representan el pulmón humano (Calu3) y el intestino.
(Caco2) epitelio en comparación con el SARS-CoV. Es importante
destacar que Calu3 fue 100 veces más susceptible a la infección por
SARS-CoV-2 que el SARS-CoV. Por el contrario, Caco2 admitió una
infección sólida de ambos virus. A diferencia de la infección por SARS-
CoV de Calu3, que indujo la regulación positiva de nueve de trece
(69,23%) citocinas / quimiocinas proinflamatorias y genes estimulados
por IFN (ISG) probados, el SARS-CoV-2 solo aumentó la expresión de
IP-10, lo que indica que el SARS-CoV-2 suprime eficazmente la
respuesta inmune e inflamatoria innata. Curiosamente, la replicación del
SARS-CoV-2 fue más susceptible que el SARS-CoV a la supresión
mediante el tratamiento previo con IFNβ o su inductor, ácido
poliinosínico-policitidílico, lo que sugiere que la vía del IFN tipo I es una
respuesta antiviral clave del huésped y debe considerarse en la terapia o
profilaxis. contra COVID-19. lo que indica que el SARS-CoV-2 suprime
eficazmente la respuesta inmune e inflamatoria innata.
Curiosamente, la replicación del SARS-CoV-2 fue más susceptible
que el SARS-CoV a la supresión mediante el pretratamiento con
IFNβ o su inductor, ácido poliinosínico-policitidílico, lo que
sugiere que la vía del IFN tipo I es una respuesta antiviral clave
del huésped y debe considerarse en la terapia o profilaxis. contra
COVID-19. lo que indica que el SARS-CoV-2 suprime
eficazmente la respuesta inmune e inflamatoria innata.
Curiosamente, la replicación del SARS-CoV-2 fue más susceptible
que el SARS-CoV a la supresión mediante el tratamiento previo
con IFNβ o su inductor, ácido poliinosínico-policitidílico, lo que
sugiere que la vía del IFN tipo I es una respuesta antiviral clave
del huésped y debe considerarse en la terapia o profilaxis. contra
COVID-19.
Introducción
El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2)
se informó por primera vez desde Wuhan en diciembre de 2019.1,2Se
propagó rápidamente y ha causado más de 3,5 millones de casos
confirmados por laboratorio con más de 0,25 millones de muertes en
todo el mundo en menos de 6 meses. El SARS-CoV-2 es el séptimo
coronavirus humano y pertenece al Betacoronavirus , el mismo género
que los otros dos coronavirus humanos altamente patógenos, el
coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) y el
coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-
CoV).3,4 Una característica destacada del SARS-CoV-2 es su
transmisibilidad inusualmente alta entre contactos cercanos en la
familia, centro de enfermería, crucero y también en el entorno
hospitalario.2,5, 6, 7, 8El número reproductivo básico estimado (R 0 )
de SARS-CoV-2 varía de 1.4 a 6.49 (mediana 2.79),9 que es más alta
que la del SARS-CoV.10
Los síntomas clínicos de COVID-19 generalmente se parecen a los
observados en el SARS, que van desde una enfermedad similar a un
resfriado común relativamente leve, como tos, fiebre, mialgia y fatiga,
hasta disnea severa, dolor en el pecho, neumonía multifocal periférica de
vidrio esmerilado, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y
síndrome de disfunción multiorgánica.11,12 A diferencia del SARS-
CoV, una proporción significativa de casos de COVID-19 fueron
levemente sintomáticos o asintomáticos.5,13 Además, se detectó una
excreción viral prolongada con títulos altos en los frotis nasofaríngeos y
orofaríngeos de los individuos asintomáticos.6 lo que podría haber
facilitado la transmisión eficiente del SARS-CoV-2 en la población
inmuno naïve en todo el mundo
Además de la infección en la mucosa de las vías respiratorias y los alvéolos
pulmonares, el tracto gastrointestinal también es susceptible a los
coronavirus humanos altamente patógenos, incluidos el SARS-CoV y
MERS-CoV.14,15 Además, el ARN viral también podría detectarse en los
tejidos intestinales de hámsteres infectados con SARS-CoV-2.dieciséis
Curiosamente, el SARS-CoV-2 pareció replicarse de manera más eficiente
en el bronquio humano.17 y pulmón18que el del SARS-CoV. Por el
contrario, si bien la diarrea fue la manifestación clínica extrapulmonar más
común del SARS y se informó en hasta 130 (20%) de 647 pacientes con
SARS,19 fue poco común en COVID-19 (42/1099, 3.8%),12lo que sugiere
una menor participación entérica del SARS-CoV-2 que del SARS-CoV. A
pesar de estas observaciones virológicas y clínicas diferenciales entre el
SARS y el COVID-19, los mecanismos subyacentes de estas diferencias
permanecen en gran parte sin explorar.
Anteriormente informamos que Calu3 y Caco2 apoyaron la replicación
robusta de SARS-CoV-2 entre nueve líneas celulares humanas
probadas.20En este estudio, investigamos más a fondo la eficacia de la
respuesta infecciosa, inmunitaria innata e inflamatoria inducida por el
SARS-CoV-2 en Calu3 y Caco2 como líneas celulares prototipo que
imitan la infección por virus en el pulmón humano y el tracto intestinal,
respectivamente. Usando el SARS-CoV como control, nuestros
resultados revelaron diferencias sustanciales en la infección y la
respuesta inmune innata del huésped entre estos dos coronavirus
humanos altamente patógenos, proporcionando así una base científica
para el tratamiento terapéutico o profiláctico para los pacientes con
COVID-19.
material y métodos
Virus y células
Se aisló SARS-CoV-2 HKU-001a (número de acceso de GenBank: MT230940) de la
muestra de aspirado nasofaríngeo de un paciente clínico con COVID-19 confirmado
en laboratorio, como describimos anteriormente.20El SARS-CoV GZ50 (número de
acceso de GenBank: AY304495) fue un aislado de 2003 archivado en el Departamento
de Microbiología de la Universidad de Hong Kong. Ambas cepas se propagaron en
células VeroE6. Los títulos virales de los sobrenadantes se evaluaron en VeroE6 con
ensayos de placa. Los experimentos con virus vivos se realizaron en un laboratorio
acreditado de nivel 3 de bioseguridad (BSL-3). VeroE6 y Caco2 (ATCC) se cultivaron
con el medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 1% de P / S y 10% o 20% de
suero bovino fetal (FBS), respectivamente. Calu3 se cultivó con medio esencial
mínimo de Dulbecco F12 (DMEM / F12) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al
20%, penicilina / estreptomicina al 1% (P / S). En el momento de la inoculación del
virus, se eliminó el FBS del medio de cultivo. Todas las líneas celulares utilizadas en
este estudio resultaron negativas para la contaminación por micoplasma
Extracción de ARN y reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR)
Las células infectadas y los sobrenadantes se lisaron a las 2, 24, 48, 72
y 120 h después de la infección (hpi) y se extrajeron con el mini kit de
ARN viral QIAamp (QIAGEN) o el mini kit QIARneasy (QIAGEN) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para los ensayos de cinética
de replicación del virus, el ARN extraído se cuantificó con el kit
QuantiNova Probe RT-PCR de un solo paso (QIAGEN). Para perfilar
los genes del huésped, el ARN extraído se transcribió de forma inversa
con el Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). La
expresión génica se cuantificó mediante qPCR con LightCycler 480
SYBR Green I Master (Roche) y se normalizó a controles infectados de
forma simulada o expresión génica GAPDH como se describió
anteriormente.21, 22, 23 Las secuencias de cebadores utilizadas en
este estudio se enumeraron en la Tabla complementaria 1.
Ensayo de infectividad
Para determinar la infectividad de SARS-CoV-2 y SARS-CoV, se infectaron
células Calu3 y Caco2 con SARS-CoV-2 o SARS-CoV a 0,002, 0,02, 0,2, 2
y 20 MOI. Las células se fijaron con una solución de formalina tamponada
neutra al 10% a 24 hpi. para tinción por inmunofluorescencia para visualizar
la expresión del antígeno viral.
Tinción e imágenes por inmunofluorescencia
Las células se fijaron con solución de formalina tamponada neutra al 10% en
los puntos de tiempo designados. La expresión del antígeno viral se detectó
con un antisuero de conejo policlonal interno contra la proteína de la
nucleocápside del SARS-CoV, pero también reaccionó de forma cruzada con
la del SARS-CoV-2.20El anticuerpo anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488
se obtuvo de ThermoFisher Scientific. Los núcleos se tiñeron con un
colorante antidesvanecimiento Prolong con DAPI (ThermoFisher Scientific).
Las imágenes se obtuvieron con el microscopio de fluorescencia Olympus
BX53. Las unidades de fluorescencia relativa de las imágenes de
fluorescencia se cuantificaron con ImageJ.
Citometría de flujo
Para comparar cuantitativamente la cantidad de expresión de
antígeno en células infectadas por SARS-CoV-2 y SARS-CoV,
se realizó citometría de flujo con Calu3 y Caco2 infectados a
0.1, 1 y 10 MOI como se describió previamente con ligeras
modificaciones.24,25Brevemente, las células se separaron con
EDTA-tripsina, se fijaron con una solución de formalina al
10% tamponada neutra, se permeabilizaron con Triton-X-100
al 0,1% en PBS y la proteína de la nucleocápsida se
inmunomarcó para el análisis de citometría de flujo con un
analizador LSR Fortessa (BD). Los datos obtenidos se
analizaron con el software FlowJo 7.6 Alias ​(FlowJo LLC.).
Ensayo de pretratamiento inductor de IFN e IFN
Para investigar la sensibilidad del SARS-CoV-2 al IFN y al inductor
de IFN, las células Calu3 y Caco2 se pretrataron con 0, 10, 50, 100,
500 o 1000 U / mL IFN-α (R&D Systems), -β (Abcam ) o -γ
(Abcam) y ácido poliinosínico-policitidílico (poli (I: C)) (Invivogen)
durante 18 h antes de la infección. Después del pretratamiento, las
células se inocularon con SARS-CoV-2 a una MOI de 2 y se fijaron
con una solución de formalina tamponada neutra al 10% a 24 hpi
para la tinción por inmunofluorescencia. Los lisados ​celulares y los
sobrenadantes se recolectaron a las 24 y 48 hpi para la
cuantificación de la carga viral con RT-qPCR de un solo paso. Se
recolectaron lisados ​de células infectadas de forma simulada para el
análisis de RT-qPCR en el punto de infección para determinar los
niveles de expresión de los factores del huésped relacionados con la
entrada de ISG y del SARS-CoV-2.
análisis estadístico

Todos los datos obtenidos se analizaron con el software

GraphPad Prism 7.0. Los análisis estadísticos para dos
grupos se determinaron utilizando la prueba t de Student
para datos no apareados . Los análisis estadísticos entre
tres o más grupos se calcularon con ANOVA de una vía o
de dos vías. El valor de p de dos colas <0,05 se consideró
estadísticamente significativo.
Figura complementaria 1. Cinética de replicación de SARS-
CoV-2 y SARS-CoV.
Las células Calu3 y Caco2 se infectaron con SARS-CoV-2 o
SARS-CoV a 2 MOI. Los lisados ​celulares y los
sobrenadantes se recogieron a 2, 24, 48, 72 y 120 hpi. Los
títulos virales en los lisados ​celulares (A y C) y los
sobrenadantes (B y D) se cuantificaron con RT-qPCR y
ensayos de placa, respectivamente. Los resultados
representaron la desviación estándar y media de tres
experimentos independientes. La significancia estadística
entre dos virus en cada punto de tiempo se realizó con la
prueba t de Student para datos no apareados. ** y ***
representaron un valor de p <0,01 y <0,001,
respectivamente.
En particular, Calu3 infectado con 20 MOI de SARS-CoV tiene un
nivel de expresión de proteína de la nucleocápside similar al de
los infectados con solo 0,2 MOI de SARS-CoV-2, lo que equivale
a aproximadamente 100 veces la diferencia en la expresión de
proteínas entre los dos virus en esta célula. tipo ( Fig. 1 y Fig. S2).
Dado que se informó que ACE2 y TMPRSS2 eran esenciales para
la entrada al SARS-CoV-2,26perfilamos la expresión de estos dos
genes en Calu3 y Caco2. En general, la expresión de ACE2 en
Calu3 fue alrededor de 1 a 4 veces mayor que la de Caco2
mientras que la expresión de TMPRSS2 fue aproximadamente de
4 a 64 veces más abundante en Caco2 que en Calu3 (Fig. S3).
Figura complementaria 2. Cuantificación de unidades de
fluorescencia relativa.
Calu3 y Caco2 se infectaron con SARS-CoV-2 o SARS-CoV a 0.002,
0.02, 0.2, 2 y 20 MOI. La expresión del antígeno viral se visualizó
mediante tinción de inmunofluorescencia con antisuero de conejo
policlonal generado internamente contra la proteína N del SARS-
CoV que también reacciona de forma cruzada con la del SARS-CoV-
2. Imágenes obtenidas con microscopio de inmunofluorescencia
Olympus BX53. Las unidades de fluorescencia relativa (RFU) de las
imágenes se cuantificaron con ImageJ. Cuantificación de RFU de (A)
Calu3 y (B) Caco2 infectados con SARS-CoV-2 y SARS-CoV.
Figura complementaria 3. Expresión génica de ACE2 y TMPRSS2
tras la infección por SARS-CoV-2 y SARS-CoV.
Las células (A y B) Calu3 y (C y D) Caco2 se infectaron de forma
simulada o se infectaron con SARS-CoV-2 o SARS-CoV a 2 MOI y
se recolectaron para la extracción de ARN a 2, 24, 48, 72 y 120 hpi.
La expresión génica de ACE2 y TMPRSS2 se determinó mediante
RT-qPCR y se normalizó al gen interno GAPDH. Los resultados
representaron la desviación estándar y media de tres experimentos
independientes. La significación estadística en diferentes puntos de
tiempo se realizó mediante ANOVA de una vía. *, ** y ***
representaron un valor de p <0.05, <0.01 y <0.001,
respectivamente.
A continuación, investigamos cuantitativamente adicionalmente la infección
diferencial de SARS-CoV-2 y SARS-CoV en Calu3 y Caco2 con citometría de
flujo. De manera similar, el SARS-CoV-2 infectó a Calu3 significativamente
más eficientemente que el SARS-CoV, como lo indican los porcentajes
consistentemente más altos de células N positivas en tres MOI diferentes
examinadas ( Fig.2 A y 2 C, células positivas para nucleocápside 1.32% vs
0.75% ; 2,06% frente a 0,81%; 4,65% frente a 1,08%) así como las
intensidades medias de fluorescencia significativamente más altas ( Fig.2RE).
En las células Caco2, la infección por SARS-CoV fue más eficiente que el
SARS-CoV-2 a 0.1 MOI (células positivas a la nucleocápside 8.98% vs 5.83%,
p <0.05) pero la diferencia en la tasa de infección disminuyó a medida que las
MOI aumentaron a 1 o más ( Fig.2 B, E y F). En general, nuestros datos
sugirieron que el SARS-CoV-2 infectó las células epiteliales del pulmón humano
de manera más eficiente que el SARS-CoV, mientras que el SARS-CoV infectó
las células intestinales humanas de manera más eficiente que el SARS-CoV-2.
El SARS-CoV-2 lanzó un IFN atenuado y una respuesta
proinflamatoria
A continuación, preguntamos si el SARS-CoV-2 y el SARS-CoV
activarían el IFN y la respuesta proinflamatoria en las células Calu3
y Caco2. Para ello, evaluamos la expresión de cinco citocinas /
quimiocinas proinflamatorias y un panel de ocho genes asociados con
la respuesta al IFN tipo I o tipo II. Para nuestra sorpresa, a pesar de
la replicación robusta del SARS-CoV-2 en Caco2, solo IP-10 se
regularizó significativamente entre las cinco citocinas / quimiocinas
probadas ( Fig. 3 B, p <0.01). Además, el SARS-CoV también
incrementó sólo IP-10 a una magnitud similar a la inducida por el
SARS-CoV-2 en Caco2 ( Fig.3 B, p.<0,01). Sin embargo, se
observaron diferencias drásticas en el perfil de expresión de las
citocinas / quimiocinas proinflamatorias en Calu3 entre los dos virus.
A diferencia del SARS-CoV, que aumentó significativamente la expresión de TNFα, IL-8,
IP-10 y RANTES, ninguno de estos genes proinflamatorios fue inducido sustancialmente
por la infección del SARS-CoV-2 en Calu3 en cinco puntos de tiempo examinados ( Fig.3
A ). De acuerdo con los perfiles de expresión de las citocinas / quimiocinas
proinflamatorias, los ocho genes probados para la respuesta al IFN de tipo I y tipo II no
se activaron significativamente por el SARS-CoV-2 o el SARS-CoV en Caco2.
Curiosamente, la infección por SARS-CoV indujo la regulación al alza del 62,5% (cinco
de ocho) de los IFN o ISG probados en Calu3, incluidos IFNα e IFNβ (IFN tipo I), IFNγ
(IFN tipo II), IFIT1 e IFITM3 (Figura 4 A). Por el contrario, la respuesta al IFN de
tipo I y de tipo II se atenuó con la infección por SARS-CoV-2 en Calu3 ( Fig. 4 A). En
resumen, nuestros resultados demostraron que la respuesta inmune innata inducida por
virus disminuyó en gran medida en las células epiteliales intestinales tras la infección
tanto del SARS-CoV-2 como del SARS-CoV. Sin embargo, se observaron diferencias
sustanciales entre las dos líneas celulares. Es importante destacar que el SARS-CoV-2
indujo una respuesta inmune innata significativamente atenuada en las células epiteliales
del pulmón en comparación con el SARS-CoV a pesar de una infección y propagación del
virus más robusta.
El SARS-CoV-2 fue más sensible al IFN-β y al inductor de IFN que el
SARS-CoV
Dado que la respuesta al IFN de tipo I, que se informó que es
fundamental para la defensa del huésped contra varias infecciones
virales,27, 28, 29no se activaron significativamente por el SARS-
CoV-2, planteamos la hipótesis de que la preactivación de la vía de
señalización del IFN para cebar la respuesta antiviral del huésped
podría ser muy beneficiosa para restringir la infección del SARS-CoV-
2. Probamos esta hipótesis pretratando líneas celulares Calu3 y
Caco2 con IFNβ (IFN tipo I) a concentraciones crecientes de 0, 100,
500 y 1000 U / mL. Primero verificamos la potencia de IFNβ
examinando los niveles de expresión de cinco genes estimulados por
IFN (ISG) representativos. Como era de esperar, los cinco ISG se
regularon positivamente de manera eficiente mediante el
pretratamiento con IFNβ (Fig. S4).
A continuación, investigamos la potencia antiviral de IFNβ y descubrimos
que una dosis única de 100 U / mL de pretratamiento de IFNβ antes de
la infección por SARS-CoV-2 redujo alrededor del 70% de la producción
de virus en Calu3 y el efecto inhibidor duró al menos hasta 48 hpi
( Figura 5A y 5 B). Bajo el mismo pretratamiento con IFNβ, observamos
una reducción de menos del 25% en la producción de virus en Calu3
infectado con SARS-CoV ( Fig. 5 A y 5 B). Consistentemente, el
pretratamiento con IFNβ fue más potente contra el SARS-CoV-2 que el
SARS-CoV en Caco2 ( Fig. 5 C y 5 D). Además, redujimos la dosis del
pretratamiento con IFNβ a niveles más fisiológicamente factibles y los
resultados mostraron que el pretratamiento con IFNβ suprimió
eficazmente la expresión del antígeno viral a una concentración tan baja
como 10 U / ml ( Fig. 5 E).
ACE2 fue identificado recientemente como un potencial ISG,30lo que podría
comprometer la eficacia del tratamiento con IFNβ. Al evaluar la expresión
de ACE2 tras el tratamiento con IFNβ, nuestros datos mostraron que el
tratamiento con IFNβ no regulaba positivamente la expresión de ACE2 en
células Calu3 y Caco2 ( Fig. 5 F, 5 G y S5). Como estrategia alternativa al
pretratamiento con IFNβ, pretratamos las células con poli (I: C), un
estimulador de la respuesta inmune innata del huésped mediante la
activación de los receptores de reconocimiento de patrones celulares. En este
contexto, el SARS-CoV-2 fue igualmente sensible a la respuesta inmune
antiviral preinducida ( Fig. 5 H- 5 K). Curiosamente, el SARS-CoV-2
también demostró una mayor sensibilidad al pretratamiento con poli (I: C)
que la del SARS-CoV en las células Calu3 ( Fig.5 H y 5YO). Estos
resultados destacaron el potencial de activar la vía de señalización de IFN
como estrategia antiviral contra el SARS-CoV-2.
Discusión
A pesar de las observaciones virológicas y clínicas diferenciales
específicas de tejido entre el SARS y el COVID-19, los
mecanismos subyacentes de las diferencias permanecen en gran
parte sin explorar. Usando Calu3 y Caco2 como dos líneas
celulares prototipo para imitar la infección por SARS-CoV-2 del
pulmón humano y el epitelio intestinal, demostramos varias
diferencias clave entre el SARS-CoV-2 y el SARS-CoV en la
eficiencia de la infección, la respuesta inmune innata del huésped,
como así como la sensibilidad al pretratamiento con IFN. Primero,
mostramos que la infectividad del SARS-CoV-2 era más robusta
que el SARS-CoV en Calu3. Dado que una de las características
más destacadas del SARS-CoV-2 es su alta transmisibilidad e
infectabilidad de persona a persona,2,6,8
Nuestros hallazgos proporcionaron posibles explicaciones al abordar la
importante cuestión de si la infectividad del SARS-CoV-2 difiere de la
del SARS-CoV en las células epiteliales del pulmón humano. Por el
contrario, el SARS-CoV infectó las células epiteliales intestinales de
manera más eficiente, lo que fue particularmente apreciable en MOI más
bajas. Nuestros hallazgos corroboraron con las observaciones clínicas de
que, aunque tanto los pacientes con COVID-19 como con SARS podrían
eliminar el ARN viral a través del tracto gastrointestinal,31,32 la
diarrea se observó cinco veces más en los pacientes con SARS (20%)
que en los pacientes con COVID-19 (3,8%).
Los virus pueden emplear una variedad de mecanismos para inhibir el
sistema inmunológico innato del huésped,33, 34, 35evitando así
respuestas antivirales cruciales, como las vías de señalización del IFN,
para facilitar la propagación y diseminación del virus.
Aquí, nuestro estudio demostró que la infección por SARS-CoV-2
indujo citocinas / quimiocinas proinflamatorias atenuadas y
respuestas de IFN en células Calu3 y Caco2, a pesar de la infección
y propagación del virus robusto. Es importante destacar que estas
respuestas atenuadas del huésped en presencia de una replicación
robusta del virus en los sitios de infección primaria pueden contribuir
a la alta proporción de infecciones leves sintomáticas o asintomáticas
en pacientes con COVID-19, y explicar el curso leve e insidioso de
COVID-19 hasta el deterioro tardío. .
Se sabe que la respuesta al IFN de tipo I es importante para
restringir la replicación del virus antes de que se desarrolle una
inmunidad adaptativa adecuada.
Para facilitar la propagación eficaz del virus, los coronavirus codifican
múltiples proteínas virales estructurales y no estructurales.37, 38,
39para antagonizar la vía de señalización de IFN tras la infección.
Nuestros datos mostraron que el SARS-CoV-2 lanzó una respuesta
inmune innata atenuada a pesar de la replicación eficaz del virus, lo que
sugiere que el virus también puede modular eficazmente la señalización
de IFN. La administración temprana de IFN de tipo I se asoció con una
eliminación eficaz del virus y alivió la gravedad de la enfermedad en
ratones infectados con SARS-CoV y pacientes con SARS.40, 41,
42Por lo tanto, investigamos el potencial terapéutico del IFN de tipo I
cebando al huésped con un pretratamiento de IFNβ y poli (I: C) como un
estimulador aguas arriba. Nuestros resultados demostraron que, en
comparación con el SARS-CoV, el SARS-CoV-2 fue más sensible al
pretratamiento con IFNβ y poli (I: C), lo que indica que el tratamiento
con IFNβ en pacientes con COVID-19 podría ser más efectivo y
beneficioso que en pacientes con SARS.
Por lo tanto, investigamos el potencial terapéutico del IFN de tipo I
cebando al huésped con un pretratamiento de IFNβ y poli (I: C) como
un estimulador aguas arriba. Nuestros resultados demostraron que, en
comparación con el SARS-CoV, el SARS-CoV-2 fue más sensible al
pretratamiento con IFNβ y poli (I: C), lo que indica que el tratamiento
con IFNβ en pacientes con COVID-19 podría ser más efectivo y
beneficioso que en pacientes con SARS. Es importante destacar que
varias líneas de evidencia sugirieron el uso potencial de IFNβ como
estrategia de tratamiento para la infección por COVID-19. En primer
lugar, el tratamiento con IFNβ o su inductor puede reactivar el sistema
inmune del huésped, ya que la respuesta inmune innata por IFN y las
citocinas proinflamatorias son marcadamente suprimidas por el SARS-
CoV-2 en ambas líneas celulares modelo y en explantes de tejido
pulmonar humano ex vivo
En segundo lugar, el IFNβ no aumentó la expresión del receptor ACE2 del
SARS-CoV-2 en nuestras líneas celulares modelo de pulmón e intestino, que
recientemente se sugirió que era un gen estimulado por IFN.30 En tercer
lugar, se demostró que el IFNβ disminuye la fibrosis pulmonar inducida por
virus en un modelo de ratón, lo que podría mejorar los resultados de los
pacientes con COVID-19 complicado por el síndrome de dificultad
respiratoria aguda.43 En cuarto lugar, se informaron efectos sinérgicos para
el IFNα leucocítico con ribavirina y el IFNβ con ribavirina.44 Finalmente, el
IFNβ exhibió una potente actividad antiviral in vitro y / o in vivo contra el
SARS-CoV y MERS-CoV.45,46 Estos hallazgos formaron la base de un
ensayo clínico aleatorizado reciente de tratamiento que mostró que la triple
combinación de terapia antiviral con IFNβ-1b, lopinavir-ritonavir y
ribavirina es segura y altamente efectiva para acortar la duración de la
diseminación del virus, disminuir las respuestas de las citocinas, aliviar
síntomas y facilitando el alta de pacientes con COVID-19 leve a moderado.
Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. Primero, los hallazgos
se basan en líneas celulares humanas y no en explantes de tejido
humano ex vivo . Pero este último es muy difícil de mantener y los
explantes de tejido se deterioran rápidamente en 72 h. En
segundo lugar, los hallazgos aún no se han validado en modelos
animales adecuados. Sin embargo, nuestro hallazgo sobre la
importancia del IFNβ fue verificado en parte por un ensayo clínico
reciente que utilizó IFNβ − 1b en humanos, que fue acelerado por
la rápida progresión de esta pandemia. Se justifican más estudios
sobre el papel de la primera línea de defensa del huésped contra
este furtivo SARS-CoV-2.
Tanto el tracto respiratorio como el
gastrointestinal son órganos diana
primarios de SARS-CoV-2 infección . Sin
embargo, falta una caracterización
detallada de la interacción huésped- virus
en el pulmón humano infectado y en las
células epiteliales intestinales .
Se han utilizado ensayos de inmunofluorescencia ,
citometría de flujo y RT-qPCR para delinear las
características virológicas y la respuesta inmune
innata de las células huésped contra la infección por
SARS-CoV-2 en dos prototipos de líneas celulares
humanas que representan el pulmón humano (Calu3)
y el intestinal (Caco2 ) epitelio en comparación con el
SARS-CoV .
Las células epiteliales pulmonares fueron significativamente
más susceptibles al SARS-CoV-2 en comparación con el
SARS-CoV . Sin embargo, la infección por SARS-CoV-2
indujo una inducción de citocinas / quimiocinas
proinflamatorias atenuada y respuestas de IFN tipo I y tipo
II. Una dosis única de 10 A ?? U / ml de interferón -SS
(IFNß) pretratamiento protegida potentemente tanto Calu3
y Caco2 contra SARS-CoV-2 infección . Curiosamente, el
SARS-CoV-2 fue más sensible al tratamiento previo con el
inductor de IFNß e IFN que el SARS-CoV en Calu3.
A pesar de una fuerte infección tanto en el pulmón
humano como en las células epiteliales
intestinales , el SARS-CoV-2 podría atenuar la
respuesta proinflamatoria inducida por el virus y la
respuesta al IFN. Pre-activación del tipo I IFN vía
de señalización de ceba una respuesta antiviral
altamente eficiente en el huésped contra SARS-
CoV-2 infección , que podría servir como un
potencial terapéutico maniobra y profiláctico para
COVID-19 pacientes .
 Perfiles comparativos de replicación y
activación inmunitaria de SARS-CoV-2 y
SARS-CoV en pulmones humanos: un
estudio ex vivo con implicaciones para la
patogenia de COVID-19.
12/09/2020
El síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2
(SARS-CoV-2) es un coronavirus emergente que ha
provocado más de 2 000 000 de casos confirmados por
laboratorio, incluidas más de 145 000 muertes. Aunque el
SARS-CoV-2 y el SARS-CoV comparten una serie de
manifestaciones clínicas comunes, el SARS-CoV-2 parece
ser muy eficaz en la transmisión de persona a persona y
con frecuencia causa infecciones asintomáticas o
presintomáticas. Sin embargo, los mecanismos subyacentes
que confieren estas características virales de alta
transmisibilidad e infección asintomática siguen sin
conocerse por completo.
SARS-CoV-2 infectado y replicado en tejidos
pulmonares humanos de manera más eficiente que
el SARS-CoV. En el intervalo de 48 horas, el
SARS-CoV-2 generó 3,20 veces más partículas de
virus infecciosas que el SARS-CoV de los tejidos
pulmonares infectados (p <0,024). El SARS-CoV-
2 y el SARS-CoV fueron similares en el tropismo
celular, y ambos se dirigieron a neumocitos de tipo I
y II y macrófagos alveolares.
Es importante destacar que, a pesar de la replicación del
virus más eficiente, el SARS-CoV-2 no indujo
significativamente interferones de tipos I, II o III en los
tejidos pulmonares humanos infectados. Además,
mientras que la infección por SARS-CoV incrementó la
expresión de 11 de 13 (84,62%) citocinas / quimiocinas
proinflamatorias representativas, la infección por
SARS-CoV-2 solo incrementó 5 de estos 13 (38,46%)
mediadores inflamatorios clave a pesar de replicarse de
manera más eficiente.
Se investigo exhaustivamente la replicación, el tropismo
celular y el perfil de activación inmune de la infección por
SARS-CoV-2 en tejidos pulmonares humanos con el
SARS-CoV incluido como comparación. Por lo que está
investigación proporciona los primeros datos cuantitativos
sobre la capacidad de replicación comparativa y el perfil de
activación inmune de la infección por SARS-CoV-2 y
SARS-CoV en tejidos pulmonares humanos. Nuestros
resultados proporcionan información importante sobre la
patogénesis, la alta transmisibilidad y la infección
asintomática del SARS-CoV-2.
 30/09/2020
El SARS-CoV-2 induce una respuesta inmune
innata más robusta y se replica de manera
menos eficiente que el SARS-CoV en los
intestinos humanos: un estudio ex vivo con
implicaciones en la patogénesis de COVID-19.
Además de la afectación respiratoria
prominente, las manifestaciones
gastrointestinales se informan comúnmente en
pacientes con Enfermedad por Coronavirus
2019 (COVID-19). Comparamos la infección de
tejidos intestinales humanos ex vivo por SARS-
CoV-2 y SARS-CoV con respecto a su cinética
de replicación y perfil de activación inmune.
Se obtuvieron tejidos intestinales humanos de
pacientes sometidos a operaciones quirúrgicas en el
Hospital Queen Mary de Hong Kong. Tras la
extracción quirúrgica, los tejidos se procesaron e
infectaron inmediatamente con SARS-CoV-2 o
SARS-CoV. La cinética de replicación se determinó
con inmunohistoquímica, qRT-PCR y ensayos de
placa. La activación inmune en los tejidos intestinales
infectados se evaluó detectando la expresión génica
de interferones y citocinas y quimiocinas
proinflamatorias representativas.
Usando los tejidos intestinales humanos ex vivo como
modelo fisiológicamente relevante, nuestros datos indicaron
que el SARS-CoV-2 podría replicarse productivamente en
los intestinos humanos, lo que sugiere que el tracto
gastrointestinal podría servir como una ruta alternativa de
diseminación del virus. El SARS-CoV-2 se replicó de
manera menos eficiente e indujo menos citopatología que el
SARS-CoV de acuerdo con las observaciones clínicas
informadas para el SARS-2003 y COVID-19, que podrían
ser el resultado de una activación inmune más robusta por
el SARS-CoV-2 que SARS-CoV en el intestino humano.
 COVID-19 en personas que viven con el
VIH: implicaciones clínicas de la dinámica
de la respuesta inmune al SARS-CoV-2.
25/09/2020
Actualmente hay poca evidencia disponible sobre la
enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) en
personas que viven con el VIH (PLWH). Informamos
los datos clínicos y viroinmunológicos de todos los
pacientes VIH positivos ingresados ​en nuestro centro
con COVID-19 del 1 de marzo al 12 de mayo de
2020. En total, se incluyeron cinco pacientes, todos
con supresión virológica con tratamiento
antirretroviral y el recuento de CD4 + fue superior a
350 celda / mm3 en todos menos dos pacientes.
Aunque todos los pacientes tenían evidencia de
neumonía al ingreso, solo uno desarrolló insuficiencia
respiratoria. El ARN del coronavirus 2 (SARS-CoV-2)
del síndrome respiratorio agudo severo nunca se
detectó a partir de hisopos nasofaríngeos en dos
pacientes, mientras que en los otros, la eliminación
viral se produjo en un máximo de 43 días. La
producción de inmunoglobulina G se provocó en todos
los pacientes y los anticuerpos neutralizantes en todos
menos uno. La respuesta de células T específicas se
desarrolló en todos los pacientes, pero fue más fuerte
en aquellos con presentaciones más graves.
De manera similar, el nivel más alto de citocinas
proinflamatorias se encontró en el único paciente
que experimentó insuficiencia respiratoria. A
pesar de una presentación leve, los pacientes con
inmunosupresión más pronunciada mostraron
altos grados tanto de producción de citocinas
como de activación inmune. Nuestro estudio no
encontró un mayor riesgo y gravedad de COVID-
19 en PLWH.
La respuesta inmune celular adaptativa al SARS-CoV-2
pareció correlacionarse con la gravedad de la enfermedad.
El cuadro clínico leve mostrado en pacientes con VIH
avanzado, a pesar de una activación significativa de
células T y un perfil inflamatorio, sugiere un papel
potencial de la desregulación inmunológica impulsada por
el VIH para evitar los procesos inmunopatógenos. Sin
embargo, deben considerarse otras posibles explicaciones,
como un papel protector de ciertos medicamentos
antirretrovirales. Se necesitan más estudios más amplios
para aclarar mejor el impacto de la infección por VIH en
COVID-19.
ANEXO
Referencias

1.
Chan, JF, Chan, KH, Choi, GK, To, K. K, Tse, H., Cai, JP, Yeung, ML, Cheng, VC, Chen, H., Che, XY, Lau, SK, Woo, PC y Yuen,
KY (2013). Susceptibilidad diferencial de la línea celular al nuevo betacoronavirus humano emergente 2c EMC / 2012:
Implicaciones para la patogénesis de la enfermedad y la manifestación clínica. The Journal of Infectious Diseases, 207 ((11)), 1743-
1752. https://doi.org/10.1093/infdis/jit123 .

2.
Dye, BR, Hill, DR, Ferguson, MA, Tsai, YH, Nagy, MS, Dyal, R., Wells, JM, Mayhew, CN, Nattiv, R., Klein, OD, White, ES,
Deutsch, GH, Y Spence, JR (2015). Generación in vitro de organoides pulmonares derivados de células madre pluripotentes
humanas. eLife, 4 , e05098. https://doi.org/10.7554/eLife.05098 .

3.
Dye, BR, Youngblood, RL, Oakes, RS, Kasputis, T., Clough, DW, Spence, JR y Shea, LD (2020). Los organoides del pulmón
humano se desarrollan en estructuras adultas similares a las vías respiratorias dirigidas por propiedades de biomateriales físico-
químicos. Biomaterials, 234 , 119757. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.119757 .

4.
Turner, M., Leslie, S., Martin, NG, Peschanski, M., Rao, M., Taylor, CJ, Trounson, A., Turner, D., Yamanaka, S. y Wilmut, I.
(2013 ). Hacia el desarrollo de una biblioteca de células madre pluripotentes inducidas globalmente Cell stem cell, 13 (4), 382–384.
https://doi.org/10.1016/j.stem.2013.08.003 .

5.
Lukassen, S., Chua, RL, Trefzer, T., Kahn, NC, Schneider, MA, Muley, T., Winter, H., Meister, M., Veith, C., Boots, AW, Hennig,
BP, Kreuter, M., Conrad, C. y Eils, R. (2020). El receptor ACE2 y TMPRSS2 del SARS-CoV-2 se expresan principalmente en las
células secretoras transitorias bronquiales The EMBO journal, e105114. Publicación anticipada en línea.
/10.15252/embj.20105114 .
6.
Zhu N., Zhang D.Wang W.Li X.Yang B.Canción J.et al.Un nuevo coronavirus de pacientes con
neumonía en China, 2019.N Engl J Med. 2020; 382 : 727-733.
7.
Chan JF, Yuan S.Kok KH,Hacia KKChu H.Yang J.et al. Un grupo familiar de neumonía asociado con
el nuevo coronavirus de 2019 que indica transmisión de persona a persona: un estudio de un grupo
familiar.Lanceta. 2020; 395 : 514-523
8.
Chan JFKok KHZhu Z.Chu H.Hacia KK Yuan S.et al.Caracterización genómica del nuevo coronavirus
patógeno humano de 2019 aislado de un paciente con neumonía atípica después de visitar Wuhan.Los
microbios emergentes infectan. 2020; 9 : 221-236
9.
Chan JFLau SKHacia KKCheng VCWoo PCYuen KYSíndrome respiratorio de Oriente Medio
coronavirus: otro betacoronavirus zoonótico que causa una enfermedad similar al SARS.Clin Microbiol
Rev. 2015; 28 : 465-522
10.
Kimball A.Hatfield KMArons M.James A.Taylor J.Spicer K.et al.Infecciones asintomáticas y
presintomáticas por SARS-CoV-2 en residentes de un centro de enfermería especializada de atención a
largo plazo - King County, Washington, marzo de 2020. Informe Semanal de Morbilidad y Mortalidad
del MMWR 2020; 69 : 377-381
11.
Russell TWHellewell J.Jarvis CIvan Zandvoort K.Abbott S.Ratnayake R.et al. Estimación de la tasa de
infección y letalidad de la enfermedad por coronavirus (COVID-19) utilizando datos ajustados por edad
del brote en el crucero Diamond Princess, febrero de 2020. Euro Surveill. 2020; 25
12.
McMichael T.M.Currie D.W.Clark S.Pogosjans S.Kay M.Schwartz N.G.et al.Epidemiology of Covid-19 in
a long-term care facility in King County, Washington.N Engl J Med. 2020;
13.
Wang D.Hu B.Hu C.Zhu F.Liu X.Zhang J.et al.Clinical characteristics of 138 hospitalized patients with
2019 novel coronavirus-infected pneumonia in Wuhan, China. JAMA. 2020;
14.
Liu Y.Gayle A.A.Wilder-Smith A.Rocklov JThe reproductive number of COVID-19 is higher compared
to SARS coronavirus.J Travel Med. 2020; 27
15.
Chowell G.Castillo-Chavez C.Fenimore P.W.Kribs-Zaleta C.M.Arriola L.Hyman J.MModel parameters
and outbreak control for SARS.
Emerg Infect Dis. 2004; 10: 1258-1263
16.
Huang C.Wang Y.Li X.Ren L.Zhao J.Hu Y.et al.Clinical features of patients infected with 2019
novel coronavirus in Wuhan, China.Lancet. 2020;395: 497-506
17.
Guan W.J.Ni Z.Y.Hu Y.Liang W.H.Ou C.Q.He J.X.et al.Clinical characteristics of coronavirus
disease 2019 in China.N Engl J Med. 2020;382: 1708-1720
18.
Scott S.E.Zabel K Collins J.Hobbs K.C.Kretschmer M.J.Lach M.et al.First Mildly Ill, non-
hospitalized case of coronavirus disease 2019 (COVID-19) without viral transmission in the
United States - Maricopa County, Arizona, 2020.Clin Infect Dis. 2020.
19.
Ding Y.He L.Zhang Q.Huang Z.Che X.Hou J.
et al.Organ distribution of severe acuterespiratory syndrome (SARS) associated coronavirus
(SARS-CoV) in SARS patients: implications for pathogenesis and virus transmission
pathways.J Pathol. 2004; 203: 622-630
20.
Zhou J.Li C.Zhao G.Chu H.Wang D.Yan H H.et al. Human intestinal tract serves as an
alternative infection route for Middle East respiratory syndrome coronavirus. Sci Adv. 2017; 3