PROTOCOLO mirVana™ RecoverAll™ Total Nucleic

Acid Isolation Kit

Extracción ácidos nucleicos totales (ARN, miARN y ADN) de formaldehído o Tejidos

fijados con paraformaldehído, embebidos en parafina (FFPE).
Materiales provistos con el kit y condiciones de almacenamiento
 Máximo de cuatro rodajas de
20 μm, ocho de 10 μm o
dieciséis de 5 μm) en un

Resumen del procedimiento

tubo de microcentrífuga de
1,5 ml.

Corte secciones de 5–20

• 1. Desparafinización μm de bloques de tejido
FFPE usando un
Ensamble secciones de FFPE equivalentes microtomo
a ≤ 80 μm o ≤ 35 mg de núcleo no
seccionado
Centrifugue brevemente
para llevar el tejido
adherido a los lados del Añadir 1 ml de xileno al 100%, mezclar e incubar durante 3
tubo hacia el xileno. minutos a 50 ° C Vórtice brevemente para mezclar
Calentar la muestra
durante 3 minutos a 50 ° C
para derretir la parafina. Centrifugar durante 2 minutos a la velocidad máxima y desechar el
xileno, a temperatura ambiente, hasta formar un granulado o
precipitado, retírelo sin dañar el sedimento
 Resumen del procedimiento
Paso 1: Añadir 1 ml de
etanol al 100%
(temperatura ambiente)
a la muestra y
• 1. Desparafinización vórtice para mezclar.

Lave el sedimento dos veces con 1 ml de etanol al 100%, a

temperatura ambiente , Vórtice brevemente para mezclar, tejido debe Paso 2 Centrifugue la
tornarse opaco muestra durante 2 minutos a
temperatura ambiente y
velocidad máxima para
sedimentar el tejido

Repetir paso 1
y2

Secado Durante 15–45 min a temperatura ambiente

 1. Adicione el Buffer de digestión

Resumen del procedimiento según el tamaño de las muestras

( tamaño > 40 μm , buffer 100 μL)
(tamaño 40–80 μm buffer 200 μL)

2. Digestión de proteasas
2. Agregue 4 μL de
proteasa a cada
A. Añadir Buffer de digestión y proteasa muestra. Agite el tubo
suavemente para
mezclar

1. Para el aislamiento de ARN,

incube la muestra en bloques de
calor durante 15 minutos a 50 ° C,
luego 15 minutos a 80 ° C.

B. Incubar a 50 ° C / 80 ° C (ARN) oa 50 ° C (ADN

2. Para el aislamiento
del ADN, incubar la
muestra durante 16
horas a 50 ° C.
 Resumen del procedimiento
2. Aislamiento de ácido nucleico
A. Prepare la mezcla de aditivo de aislamiento / etanol, , Según
la cantidad de buffer colocado en la muestra

B. Agregue el aditivo de aislamiento / etanol y mezcle, Mezcle Para cada muestra, coloque un
pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Algunas muestras pueden cartucho de filtro en uno de los
tubos de recolección
aparecer blancas y turbias después de mezclar.
suministrados.

Pase la mezcla a través de un cartucho de filtro y Para cada muestra, si. Pipetee hasta 700 μl de la
coloque un cartucho de filtro en uno de los tubos de recolección mezcla de muestra / etanol (del
paso B) en el cartucho del filtro y
suministrados. Centrifugar a 10.000 x g (típicamente 10.000 rpm) durante cierre la tapa.
30 segundos para pasar la mezcla a través del filtro.
 Resumen del procedimiento Deseche el flujo y vuelva a
insertar el cartucho del filtro en
el mismo tubo de recolección.
2. Aislamiento de ácido nucleico
Lavado 1 : Lavar con 700 μl, con el cartucho del filtro, y
Centrifugar durante 30 segundos a 10.000 x g para pasar la
mezcla a través del filtro Deseche el flujo y vuelva a
insertar el cartucho del filtro
en el mismo tubo de
recolección, Gire el conjunto
durante 30 segundos
Lavado 2/3 : Lave con 500 μl de y luego centrifugue para adicionales para eliminar el
eliminar el líquido residual, i. Centrifugar durante 30 segundos fluido residual del filtro..
a 10.000 x g para pasar la mezcla a través del filtro..
Resumen del procedimiento Combine las siguientes
soluciones para hacer la
mezcla de DNasa (se puede
usar una mezcla maestra si
3. Digestión de nucleasa y purificación final hay más de una muestra).
Agregue mezcla de DNasa o RNasa a cada cartucho de filtro e
incube durante 30 minutos

RNA Agregue 60 μL de la mezcla de DNasa al centro de cada cartucho de filtro.

Tape el tubo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente (22–25 ° C).

Resumen del procedimiento Combine las siguientes
soluciones para hacer la
mezcla RNase (se puede usar
una mezcla maestra si hay
3. Digestión de nucleasa y purificación final más de una muestra).
Agregue mezcla de DNasa o RNasa a cada cartucho de filtro e
incube durante 30 minutos

DNA sAgregue 60 μL de la mezcla de RNasa al centro de cada cartucho de filtro

.
C. Tape el tubo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
(22–25 ° C).
 Resumen del procedimiento Deseche el flujo y vuelva a
insertar el cartucho del filtro en
el mismo tubo de recolección.
3. Digestión de nucleasa y purificación final
Lavado 1 : Lavar con 700 μl, con el cartucho del filtro, y
Centrifugar durante 30 segundos a 10.000 x g para pasar la
mezcla a través del filtro Deseche el flujo y vuelva a
insertar el cartucho del filtro
en el mismo tubo de
recolección, Gire el conjunto
durante 30 segundos
Lavado 2/3 : Lave con 500 μl de y luego centrifugue para adicionales para eliminar el
eliminar el líquido residual, i. Centrifugar durante 30 segundos fluido residual del filtro..
a 10.000 x g para pasar la mezcla a través del filtro..
Resumen del procedimiento Combine las siguientes
soluciones para hacer la
mezcla RNase (se puede usar
una mezcla maestra si hay
3. Digestión de nucleasa y purificación final más de una muestra).
Agregue mezcla de DNasa o RNasa a cada cartucho de filtro e
incube durante 30 minutos

DNA sAgregue 60 μL de la mezcla de RNasa al centro de cada cartucho de filtro

.
C. Tape el tubo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
(22–25 ° C).
 Resumen del procedimiento Deseche el flujo y vuelva a
insertar el cartucho del filtro en
el mismo tubo de recolección.
3. Digestión de nucleasa y purificación final
Lavado 1 : Lavar con 700 μl, con el cartucho del filtro, y
Centrifugar durante 30 segundos a 10.000 x g para pasar la
mezcla a través del filtro Deseche el flujo y vuelva a
insertar el cartucho del filtro
en el mismo tubo de
recolección, Gire el conjunto
durante 30 segundos
Lavado 2/3 : Lave con 500 μl de y luego centrifugue para adicionales para eliminar el
eliminar el líquido residual, i. Centrifugar durante 30 segundos fluido residual del filtro..
a 10.000 x g para pasar la mezcla a través del filtro..
 Transfiera el cartucho del filtro a

Resumen del procedimiento un tubo de recolección nuevo.

Aplique 60 μL de solución de
elución o agua libre de nucleasas al
centro del filtro y cierre la tapa.

3. Digestión de nucleasa y purificación final

Para el aislamiento de ARN, use

Eluir con 60 μL de solución de elución o agua libre de nucleasas eluyente a temperatura ambiente (22–
a temperatura ambiente (ARN) o 95 ° C (ADN) 25 ° C).

Para el aislamiento del ADN, use

eluyente precalentado a 95 ° C.
Centrifugar durante 1 minuto a la velocidad máxima para pasar
la mezcla a través del filtro.
Transfiera el cartucho del
El eluato contiene el ARN o el ADN. Permita que la muestra
repose a temperatura
Almacene el ácido nucleico a –20 ° C o más frío. ambiente durante 1 minuto.