DETERMINACIÓN DE

PROTEÍNAS
Comparación de métodos
BIURET
 La presencia de proteínas en una mezcla se
puede determinar mediante la reacción del
Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4
en solución acuosa alcalina (gracias a la
presencia de NaOH o KOH).
 La reacción se basa en la formación de un
compuesto de color violeta, debido a la
formación de un complejo de coordinación
entre los iones Cu2+ y los pares de electrones
no compartidos del nitrógeno que forma
parte de los enlaces peptídicos.
REACCIÓN DE BIURET
 La reacción debe su
nombre al biuret, una
molécula formada a
partir de dos de urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2),
que es la más sencilla
que da positiva esta
reacción, común a
todos los compuestos
que tengan dos o más
enlaces peptídicos
consecutivos en sus
moléculas.
VALORACION DE PROTEÍNAS POR
EL MÉTODO DE LOWRY
 El método de Lowry (1951) es un método
colorimétrico de valoración cuantitativa de
las proteínas. A la muestra se añade un
reactivo que forma un complejo coloreado
con las proteínas, siendo la intensidad de
color de la disolución resultante proporcional
a la concentración de proteínas, según la ley
de Lambert‑Beer (ver apartado de
fotometría).
ESTE MÉTODO CONSTA DE DOS
ETAPAS:

 Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las

proteínas formando complejos con los átomos de
nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos
Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además,
provocan el desdoblamiento de la estructura
tridimensional de la proteína, exponiéndose los
residuos de tirosina que van a participar en la
segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en
solución alcalina en forma de su complejo con
tartrato.
 La reducción, también en medio básico, del reactivo
de Folin-Ciocalteau por los grupos fenólicos de los
residuos de tirosina presentes en la mayoría de las
proteínas, actuando el cobre como catalizador.
 El principal constituyente del reactivo de
Folin‑Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de
color amarillo, que al ser reducido por los grupos
fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.
REACCIÓN ENTRE LA PROTEÍNA Y LO
REACTIVOS

BIBLIOGRAFÍA
 O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)
BRADFORD
 El ensayo de Bradford es un ensayo
colorimético para la medición de proteína
total en una solución dada.
 Involucra la unión de un colorante el
Coomassie ® Brilliant Blue a las proteínas en
un medio ácido y su conmitante cambio de
absorbancia de 465 a 595 nm.
 Debido a que el reactivo causa la
precipitación de la proteína con el tiempo, la
linearidad de la reacción se encuentra
comprometida. Las mediciones hay que
concluirlas rápidamente.
DIFERENTES
 El azul de Coomassie se une
aproximadamente estequiométrica, entonces
el método de detección tanto en solución
como en PAGE-SDS, gel u otras matrices es el
método preferido, cuando las
concentraciones de proteínas se deben
determinar por densitometría.
CAMBIO DE ABSORBANCIA DEL
COOMASIE BLUE
 Los aminoácidos que
son reconocidos por el
colorante son
arginina, fenilalanina,
triptofano y prolina.
 El azul de Coomasie
libre se detecta a 470
nm mientras que la
forma unida a
proteínas a 595 nm.
Lo anterior debido a
que el Coomassie se
une preferencialmente
a los aa mencionados
y cambio de un estado
catiónico a uno iónico
EL AZUL DE COOMASIE Y LOS
AMINOÁCIDOS QUE RECONOCE
RESUMEN