Chapter 9

Técnicas de Biología
molecular
Profesora Patricia Campos
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Sentido de la Ciencia

• Extracto de entrevista a Bruce Alberts:

“….todas las personas deberían saber de ciencia, no para ser científicos
sino para forjar sus propios criterios, tomar decisiones, y ser capaces
de discernir entre argumentaciones falsas y verdaderas. “Si no hay una
comprensión general del mundo a nuestro alrededor, es muy difícil que
uno no tenga miedo de todo. Todo puede verse como peligroso”,
afirma, y ofrece como ejemplo el de los cultivos transgénicos: “Las
personas tienen miedo de los cultivos modificados genéticamente, y
los gobiernos tienen muchas dificultades a la hora de tomar decisiones
sobre el tema. Para los científicos, todos los cultivos están modificados
y ha sido así por años. Los métodos no son lo importante, el problema
es que lo que hay que testear es la planta, lo importante es eso y no
cómo fue construida”.
 INGENIERÍA GENÉTICA
Un poco de historia…
TODO COMENZÓ CON
•Luria (1950) - bacterias resistentes a las infecciones por fagos.

•Arber (1960’s) - enzimas que degradan virus bacterianos en

fragmentos.

•Kathleen Danna y Daniels Nathans (1971) estudiaron la forma en que

la bacteria Haemophilus influenzae se defiende del ataque de los virus.
Descubrieron que la bacteria tiene una enzima que corta el ADN viral,
este tipo de enzimas fueron llamadas de restricción.

•Smith, Nathans y Arber (1970’s) utilizaron enzimas de restricción y

otras técnicas para generar, replicar y analizar moléculas de DNA
recombinante.
•NOBEL de Fisiología y Medicina 1978.
 Manipulación del DNA
Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse
en un conjunto heterogéneo de secuencias.
Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento
de DNA específico
Esta tecnología se denomina:
Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o ingeniería genética

Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica

Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria

especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases
complementarias constituye un poderoso instrumento para la
identificación, aislamiento, clonación,...
 Tecnología del DNA recombinante,
clonación génica o ingeniería genética
•Se basa en la modificación del genotipo de
los organismos.
•Involucra la obtención de un gen de interés
y su introducción en un organismo
huésped.
•Sus objetivos son:
- Obtener individuos que sinteticen
productos de interés comercial.
- Individuos mejor adaptados a ciertas
condiciones ambientales.
 Tecnología del DNA recombinante,
clonación génica o ingeniería genética
• Depende de un conjunto de técnicas que involucran:
- Clonamiento de genes (obtención de múltiples copias
de un gen)
- Generación de moléculas de DNA recombinante.
- Introducción a una célula huésped.
- Síntesis del nuevo producto en la célula huésped.
- En síntesis, manipulación del DNA y de proteínas.
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Concepto de clonamiento

(i) Individuos (ii) Molecular: Genes

Professor Ian Wilmut and Dolly (Source: Roslin Institute)

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i- Clonamiento de individuos

1: eliminación de núcleo de
oocito

1 2: obtención de núcleo de
célula somática (2n) e

2
Incorporación a oocito
3 anucleado

3: formación de cigoto
clonal
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i- Clonamiento de individuos

1: eliminación de núcleo de
oocito

2 2: obtención de núcleo de
célula somática (2n) e
Incorporación a oocito
enucleado
1 3
3: formación de cigoto clonal

4: desarrollo del cigoto clonal;

5 4 formación de embrión

Dolly 5: embrión se deposita en

útero de oveja adoptiva
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ii- Clonamiento molecular
Obtención RNAm

+ enzima transcriptasa inversa

obtención heteroduplex
RNA.DNA
+ enzima Rnasa H (se elimina hebra de RNA)

+ enzima DNApolimerasa I y nucleasa S1

Obtención de DNA de doble hebra

+ secuencias reconocimiento EcoRI

(enzima restricción)

Unión a vector

Obtención gen a clonar como cDNA

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Alimentos transgénicos
De un organismo (animal, planta, bacteria o virus) se obtiene un gen que
codifique una proteína. Como una enzima que intervenga en la maduración
de los frutos o en la producción de un compuesto inhibidor de
multiplicación viral o de una característica estructural u organoléptica,
confiriéndole un aumento del contenido de un nutriente o una mayor
tolerancia a un herbicida. Este gen se introduce en el material genético del
alimento que se desea mejorar o modificar. Con esto se obtienen las
características finales deseadas, sin tener que pasar por lentos procesos
de selección y cruces.
 Tabla: ejemplos de OMG resultantes 12
de la biotecnología agrícola
Rasgo Genéticamente Ejemplo de Cambio genético
Conferido organismo

PRODUCTOS COMERCIALES APROBADOS

Tolerancia a herbicidas Poroto de soya Tolerancia al herbicida glifosato (Roundup) conferida

por la expresión de una forma tolerante al glifosato de la
enzima vegetal 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa
(EPSPS) aislada de la bacteria del suelo Agrobacterium
tumefaciens, cepa CP4

Resistencia a insectos Maíz Resistencia a las plagas de insectos, específicamente al

barrenador europeo del maíz, a través de la expresión
de la proteína insecticida Cry1Ab de Bacillus
thuringiensis

Resistencia a virus Ciruela Resistencia al virus de la ciruela pox conferida por la

inserción de un gen de la proteína de la cubierta (CP)
del virus
 1.- Enzimas de Restricción
• Las enzimas de restricción, o endonucleasas, son enzimas que cortan
los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia
que reconocen (4 a 8 pb), cortan en el DNA ds (doble hebra).

• Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias).

• Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de

reconocimiento (al azar)

• Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son
repeticiones invertidas o palíndromes
5´-GGATCC- 3´

3´-CCTAGG- 5´
 1.- Enzimas de Restricción
• Las endonucleasas se nombran a
partir de las bacterias de las que
son extraídas, por ejemplo EcoRI
proviene de E. coli; BamHI de
Bacillus amyloliquefaciens; etc.

• Aplicaciones de las
enzimas de restricción:
 1.- Enzimas de Restricción
- Generación de fragmentos de restriccióin para ser usados
como sondas marcadas.
- Generación de fragmentos de restricción para ser
clonados en vectores apropiados, creación de DNA
recombinante.
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Enzimas de restricción que generan extremos romos o ciegos

(1) y extremos cohesivos (2,3,4)

Las endonucleasas de restricción pueden generar fragmentos cohesivos o

fragmentos de extremos romos con extremos salientes de 5 'o 3'
 2.- Electroforesis
• Técnica que consiste en la
separación de biomoléculas a
través de un campo eléctrico
basándose en su tamaño y carga
eléctrica.
• Se realiza en una matriz
gelatinosa denominada gel, cuya
función es semejante a la de un
tamiz.
• Las moléculas migran hacia un
polo positivo al final del gel.
• Electroforesis de proteínas:
- Se realizan en geles de poliacrilamida (SDS PAGE).
- Contienen SDS como denaturante, además, le otorga
carga negativa a las proteínas.
- Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización
de la acrilamida, por la acción de un agente entrecruzador
la bis-acrilamida en presencia de un iniciador (APS) y un
catalizador (TEMED).
- La velocidad de polimerización viene determinada por la
concentración de Persulfato de amonio y TEMED.
- Se realiza en cámaras verticales.
Geles de Tris-Glicina
SDS (SDS-PAGE)
- Tinciones más comunes:
a) Azul de Coomassie (R-250 y G-250).

R-250

G-250
b) Nitrato de Plata

c) SYPRO® ORANGE

RED
• Electroforesis de DNA:
- Se realiza en geles de agarosa.
- El porcentaje de agarosa del gel depende del tamaño
(pb) de las muestras.
- Se realiza en cámaras horizontales.
 - Para el revelado se puede
- Tinciones más utilizadas: utilizar:
a) Bromuro de etidio a) Equipo de Foto-captura

b) SYBR Green

b) Transiluminador.
 3.- PCR (Polimerase Chain Reaction)
• La PCR es una técnica in vitro,
que se basa en la
amplificación repetitiva de una
región o secuencia específica
de DNA o RNA, permitiendo la
producción de un alto número
de copias.
• Para la reacción se necesita la
secuencia patrón (DNA o
cDNA), Primers, DNA
polimerasa, dNTPs, Buffer de
PCR, Cloruro de Magnesio y
agua.
 Fases del PCR
- Denaturación Inicial a 94ºC.
- Alineamiento a 54º C.
-Extensión final a 72ºC.
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PCR
 • La PCR se realiza en un
equipo llamado
termociclador.

• La visualización se realiza
por electroforesis en geles
de agarosa 2%, tiñéndolos
con bromuro de etidio.
El número de copias depende de la
cantidad de ciclos que se dé a la
reacción
 Usos de la PCR:

- Clonamiento de genes o fragmentos de genes.

- Diagnóstico genético
- Diferencias cuantitativas en la expresión génica
(RT-PCR).
- Detección de agentes patógenos bacterianos,
virales y fúngicos.
- Análisis de paternidad.
- Análisis forense.
- Control de Calidad, etc..
 Tipos Principales de PCR:
- RT-PCR: Utiliza ARNm como templado para
producir cDNA. Se utiliza, en general, para
determinar expresión génica. La enzima
utilizada es la retrotranscriptasa.

- PCR en Tiempo Real: Los procesos de

amplificación y detección (visualización) se
realizan de manera simultánea. No requiere
electroforesis.
Visualización
de resultados
en PCR en
tiempo real

Equipo de PCR en
Tiempo Real