Méd. Pat. Clín.

ROCÍO CÓRDOVA VICERREL

 INTRODUCCIÓN

 Incremento de enfermedades micóticas:
OPORTUNISTA:
 INFECCIONES EMERGENTES
100 000 ESPECIES

 300-400 ESPECIES DE HONGOS CAUSANTES DE

MICOSIS SISTÉMICAS
 

FASE PREANALÍTICA
 Procedimientos para obtención, transporte
y conservación de muestras


orina
 Muestra de Orina para
Hemocultivo: cultivo: 10 a 25 ml
• Asepsia  Retención: 3 horas o primera
• Volumen: de la mañana
• Adultos: 2 a 3 muestras de 8 a 9 ml, y
 Chorro medio o punción
separadas por 30 minutos o una hora entre sí aséptica de la sonda.
• Niños: 1 sola muestra de 1 a 5 ml
• Lactantes: 1 a 2 ml
 Lactantes: bolsas colectoras
cada 30 minutos o PSP
• Neonatos: 0.5 a 1.
• Inocular de inmediato al sistema de hemocultivo.  Muestra GU: procesar
inmediato.

BIOPSIA
 Rigurosa asepsia
 Muestra: 2 porciones
 Recipiente estéril tapa rosca con SSF: examen micológico
 SS bufferada: histopatología
 Procesar de inmediato o conservar a 4°C por 2 a 4 H
 Procedimientos para obtención, transporte
y conservación de muestras
Secreciones bronquiales
 Adoptar precauciones por TBC
 Hacer higiene bucal, complementar con
 Lavado broncoalveolar por
bicarbonato de sodio fibrobroncoscopía:
 Expectoración espontánea, contaminación con  Reduce contaminación y es
flora de boca y faringe significativo cuando células epiteliales
planas es inferior a 1%, macrófagos
 En personas que no puedan expectorar: NBZ alveolares o células inflamatorias.
con SS hipertónica.
 Procesar de inmediato o congelar
 Utilidad diagnóstica del esputo: De acuerdo a
calidad, ver En aspirado bronquial: con
fibrobroncoscopio, previa colocación de 5
 Enviar a laboratorio no mayor a 2 horas. a 10 ml de SSF
 Procesar de inmediato o conservar a 4°C por 4 a Cepillado bronquial no se recomienda
6 horas. para infecciones fúngicas.
 Tomar de 3 a 5 especímenes de esputo en días
sucesivos.
Procedimientos para obtención, transporte
y conservación de muestras

Catéter IV

 Desinfectar con alcohol la zona cutánea alrededor del catéter
 Retirar el catéter
 Asépticamente cortar 5cm del extremo distal e introducir en un
recipiente estéril
 Rotular y enviar de inmediato para procesamiento en 15 min. Si no a
4°C por 24 horas sumergiendo con SSF estéril.

Peri catéter
 Obtener la muestra con torunda en una zona de 2cm alrededor de la inserción del
catéter.
 Introducir la torunda e un medio de transporte (SSF estéril)
 Rotular y enviar de inmediato para procesamiento en 15 min. Si no a 4°C por 24
horas sumergiendo con SSF estéril.
 

FASE ANALÍTICA
 EXAMEN DIRECTO • No sustituye el cultivo
• Brinda información preliminar y a veces
puede ser diagnósticas

 KOH

 Su efecto de clarificar puede incrementarse con calentamiento.
 Adicionalmente se pueden emplear colorantes
 Hifas: invasión micótica
 EXAMEN DIRECTO
 Tinta China

 Método de contraste. Visualiza la cápsula de C. n.
 Interferentes: hematíes, burbujas, leucocitos, gotas de grasa, talco
 S: 50% sin VIH, 88%: con VIH
 EXAMEN DIRECTO
 Coloración Giemsa


 Útil para el diagnóstico de histoplasmosis, neumocistosis y
otras micosis.
 Permite visualizar blastoconidias intracelulares al PMN como
la fase tisular de H. capsulatum
 EXAMEN DIRECTO
 Coloración Gram

 Útil para blastoconidias y pseudomicelios de las especies del
género Candida, Malassezia y Cryptococcus G(+)
 CULTIVOS:
SANGRE
 Lab. Pequeños: 0.5ml de
 
sangre heparinizada sobre
el medio de cultivo bifásico
(60 ml de caldo y agar BHI
 Inocular 10 ml de sangre,
ventilar con aguja con
tapón de algodón. Incubar
a 30° por 30 días.
 Examinar diariamente
disolviendo
 Sistema de lisis
centrifugación
 Técnicas automatizadas:
seguir las recomendaciones
del fabricante: 7 DIAS
EL VOLUMEN DE SANGRE ES
IMPORTANTE.
ORINA

Urocultivo convencional: Candida
Inocular 1 ó 10ul de orina no
centrifugada en placa con ASD
 Incubar 35-37° por 48 H de aerobiosis
 Recuento: no está bien establecido:
 Candiduria inferior a 1.000
UFC/mL: ausencia de
infección, excepción: PSP.
 Candiduria entre 1.000 y 10.000
UFC/mL: dudoso , VER
CONTAMINACIÓN.
VALORAR: ciertos pacientes
(niños, diabéticos,
cateterizados)ƒ
 Candiduria entre 10.000 y
50.000 UFC/mL: SOSPECHA
DE ITU
 ƒCandiduria superior a 50.000
UFC/mL: indica infección. „
 CULTIVO DE BIOPSIA

 En placa petri lavar con SSF


estéril con cloranfenicol al
0.05%
 Triturar la muestra en trozos de
1 a 2mm
 Flamear al mechero 4 láminas y
hacer improntas: examen
directo, Gram y giemsa.
 Inocular la muestra en ASD.
Incubar uno a temperatura
ambiente y otro a 37°C.
 Controlar diariamente en un
lapso de 8 semanas.
 CULTIVO DE CATÉTER Y
EXUDADO PERICATÉTER
 La técnica semicuantitativa de
Maki, consiste en: ƒRodar cuatro
veces con la ayuda de una
pinza estéril 5 cm del segmento
distal del catéter sobre la
superficie de las placas Petri
conteniendo agar sangre y
ASD.



La técnica cuantitativa de Brum–Buisson:
ƒIntroducir el extremo distal del catéter, en un
medio de cultivo líquido. ƒ
 Agitar en un vórtex durante un minuto. ƒ
 Sembrar 50 mL en placas de agar sangre y ASD.
 Incubación: ‚
 Agar sangre: a 35–37°C, x 72 h ‚
 ASD: a 30°C, para detectar el crecimiento de
Rhodoturula spp., por 15 días ‚
 Agar Sabouraud Dextrosa-palmitico 3%: a
35–37°C, para permitir el crecimiento de
Malassezia spp., por 15 días.
hongos filamentosos:
incubación 30 días.
 CULTIVO DE ESPUTO Y
SECRECIONES BRONQUIALES

 Colocar la muestra en tubos con ASD y BHI con

 Cicloheximida inhibe el desarrollo de mohos:
cloranfenicol 0.5g/L. Mínimo 6 tubos por muestra. Aspergillus, Penicilium y Cryptococcus.

 Incubar 3 a T° amb. Y los otros 3 a 37°C.

 LBA: Centrifugar a 1500 g o 3000 rpm x 30 min.
Sembrar el sedimento.
 El valor Dx es variable:
 Importante: Paracoccidioides brasiliensis e
Histoplasma capsulatum
 Aspergillus spp. y Fusarium spp: examen directo y
cultivos seriados.
 Candida spp. Sólo si son observados por
histopatología de biopsias o piezas quirúrgicas
 Cryptococcus neoformans puede causar micosis
pulmonar principalmente en pacientes VIH

Los cultivos se deben controlar hasta 45 días.

 CULTIVO DE LCR
La proporción de resultados
positivos aumenta en forma


directamente proporcional al
volúmen de muestra.

 Volumen requerido: 5ml

 Centrifugar la muestra a 1500g o 3500 rpm x15 min. Usar el sobrenadante para
pruebas serológicas de detección de Ag de C. neoformans
 Sembrar el sedimento sobre ASD o BHI o Agar semilla de girasol. Emplear de
cuatro a seis tubos conteniendo el medio de cultivo por muestra. Incubar t° amb.
y 37°C por 4 semanas.

DURANTE :
la primera semana de incubación
realizar las lecturas a diario de los
medios de cultivo,
luego puede realizarse dos veces por
semana hasta completar el tiempo de
incubación establecida.
 Identificación de especies del género
Candida
 Se observan células redondas u ovaladas de tres a


siete micras de diámetro, que se reproducen por
blastoconidias y forman pseudomicelio en la
mayoría de las especies.
 Identificación de especies del género
Candida


 Pruebas fisiológicas para identificación
 Tubo germinativo: Diferencia las especies de Candida
albicans de las no albicans.
 Procedimiento: Suspender un inóculo 0,5 mL de suero
humano o de conejo. Incubar a 35–37°C por 2h y 30 min.
 Identificación de especies del
género Candida
 Desarrollo a 42°C :

 C. albicans y C. dubliniensis tienen comportamiento
fisiológico y morfológico similar y la prueba que los va
a diferenciar en el laboratorio de microbiología es el
desarrollo a 42°C en agar papa dextrosa a las 48 H.

 Interpretación:
 Positivo: C. albicans. con desarrollo óptimo.
 Negativo: C. dubliniensis sin desarrollo.
 Producción de clamidosporas,
blastoconidias y artrosporas:

 Sembrar la colonia con estrías
en paralelo sobre el medio de
cultivo (agar harina de maíz,
agar arroz, agar clamidospora).
 Para la lectura colocar una
lámina cubreobjeto estéril
sobre el área sembrada e
incubar a t°. Amb. por 3-5 días.
 Lectura:
 Control positivo: C. albicans
 Control negativo: C. glabrata.
 Identificación de Rhodotorula
rubra
 
Se caracterizan por ser de color rojo anaranjado
o naranja, de aspecto cremoso o rugoso, brillante
y de superficie lisa
 Examen microscópico Se observan levaduras
redondas, ovoides de 2-6,5 micras de diámetro,
en ocasiones forman pseudomicelio
rudimentario, al examen directo con tinta china
se visualiza una fina cápsula
 Identificación de Trichosporon spp.
 Son de rápido desarrollo, liso, plegado,
aterciopelado, ceroso, de color blanco-
amarillento-crema.

 Examen microscópico : artroconidias y

blastoconidias.

 Las blastoconidias son unicelulares y de forma
variable y nacen en brotes en los ángulos de las
artroconidias.
 La principal característica es la de presentar
artroconidias usualmente en forma cúbica o de
barril.
 Identificación de Geotrichum spp

 De crecimiento rápido, en el período

de una semana presentan un color
blanco-grisáceo, que posteriormente

cambia a un color amarillento con
aspecto ceroso, polvoriento a rugoso.

 La t° óptima de crecimiento es 25°C,

no desarrollan o lo hacen débilmente
a 37°C.

 Examen microscópico: Se observa

artroconidias unicelulares, en
cadena, hialinas que resultan de la
fragmentación de hifas Gram: palos de
hockey
(blastoconidias
a partir de los
ángulos de
artroconidias)
 IDENTIFICACIÓN DE PRINCIPALES
HONGOS FILAMENTOSOS


Son hongos formados ramas tubulares: hifas
El conjunto de hifas: micelio, colonia o talo.

 Se reproducen por la formación de esporas o
conidias, las cuales pueden ser pigmentadas y le
dan el color al hongo. Al centro de la colonia:
hifas fértiles : más color.

 Se caracterizan por presentar crecimiento rápido,

tener reservorios naturales en el suelo, plantas,
animales y vegetales muertos, crecen a
temperaturas de 25 – 30°C y sus esporas o
conidios son transportados por el aire, son
normalmente inhalados y presentan gran
resistencia en el medio ambiente.

 2 formas de reproducción:
 sexuada (telomorfa)
 Asexual (anamórfica) : casi siempre produce las
enfermedades y es observada en las muestras.
 Microconidios: unicelulares
 Macroconidios: multicelulares, con tabiques transversales
 Aspergillus
fumigatus

 Las colonias desarrollan con rapidez
sobre ASD Czapek a 25 ºC.
 La textura de las colonias es
aterciopelada, afelpada, vellosa o algo
plegada, con margen blanquecino o
beige.
 El color inicialmente es blanco virando
en aproximadamente siete días a un
verde azulado por la producción de
conidias. El reverso de la colonia es
incoloro.
 Aspergillus flavus
 Las colonias desarrollan rápidamente sobre
ASD o agar Czapek a 25 y 37 ºC 5-7d.


 El color es verde – amarillo.
 La textura de las colonias es pulverulenta con
surcos radiales, rugosas o granulosas,
ocasionalmente algodonosas en el centro o
margen de la colonia.
 El reverso de la colonia es incoloro.

 Los conidióforos no ramificados de pared gruesa,

hialinos, rugosos, de ≥ 1 mm de longitud y de 10 a 20
μm de diámetro.
 Las vesículas son globosas o subglobosas de 10 a 65
μm de diámetro produciendo fiálides uni o biseriadas
alrededor de la vesícula.
 Los conidios son de color verde amarillentos, lisos o
finamente rugosos, esféricos o subesféricos con un
diámetro de 3,5 a 4,5 μm de diámetro.
 Los esclerotes pueden estar presentes.
 Aspergillus niger
 Colonias de rápido desarrollo sobre
ASD o agar Czapek a 25 y 37 ºC.

 El color de las colonias al principio es
blanco a amarillo, luego es negro. La
textura de las colonias es granular.
 El reverso de la colonia es incoloro o
crema.
 Fusarium solani.
 Las colonias tienen un rápido
desarrollo a 25 y 37 ºC (siete
días).

 El color de las colonias es
blanco, crema, pardo claro o
pardo rojizo mezcladas con
zonas de color púrpura;

 La textura es algodonosa o
lanosa. La colonia puede ser
inhibida por la cicloheximida.
METODOLOGÍA PARA EL ESTUDIO DE
SENSIBILIDAD A ANTIFUNGICOS:

 Método de microdilución para levaduras
 Método de macrodilución para levaduras
 Método de difusión en disco
 Método de microdilución para hongos filamentosos
 Método de macrodilución en caldo
 MÉTODO DE DIFUSIÓN EN DISCO EN EL
ESTUDIO DE SENSIBILIDAD EN
LEVADURAS

 Es el mismo que para las bacterias.
 El procedimiento es similar con algunas modificaciones
Glucosa: Mejor crecimiento
de levaduras
Puede
MEDIO DE CULTIVO: suplementarse en
• MHA suplementado con 2% de el momento de la
glucosa y 0.5ug/ml de azul de preparación del
metileno medio o
• pH: 7.2-7.4 incorporarlas en
placas ya
preparadas
Azul de metileno: mejorar el
Incubación: 24-48H halo de inhibición
 Almacenar x 7
días o tomar
medidas
preventivas
de secado.

Solución madre glucosa-

azul de metileno
 Longitud de onda: 530nm

Incubar 35°C x :
20-24 H para Candida
48 H para Cryptococcus

PREPARACIÓN DEL INÓCULO

CEPAS DE CONTROL DE
CALIDAD
MÉTODO DE MICRODILUCIÓN EN CALDO PARA
HONGOS FILAMENTOSOS


 Se han evaluado especies de:
 Aspergillus
 Fusarium
 Rhizopus
 Pseudallescheria boydii
 Sporothrix schenckii

No se ha usado en Blastomyces dermatitidis o

Histoplasma capsulatum
INOCULO
 Aspergillus (0.41-0.56 McFarland)
 Rhizopus: (0,68-0,77 McFarland)
 Pseudallescheria boydii (0,68-0,77 McFarland)
 Sporothrix schenckii
Agar Papa
dextrosa
35°C x 7 días

 Fusarium (0,68-0,77 McFarland)

Agar Papa
dextrosa
48-72H a 35°C y
luego: 25-28°C hasta
completar 7 días
LECTURA:

Hasta la fecha
no hay puntos PAecilomyces

de corte para
los hongos
filamentosos