IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN

DE LA RESPUESTA INMUNE
 RESPUESTA INMUNE HUMORAL

SEROLOGÍA
suero estudio

“Ciencia de la detección de anticuerpos”

Medición de las interacciones Ag - Ac, con fines

diagnósticos, a partir del suero de un animal.
Sensibilidad

Capacidad de una prueba para detectar animales “enfermos”

(VERDADEROS POSITIVOS) en una población “enferma”.

Ejs. BPA-ELISA-WESTERN BLOTTING-INMUNOFLUORESCENCIA

Especificidad

Capacidad de una prueba para detectar animales “sanos”

(VERDADEROS NEGATIVOS) en una población “sana”.

Ejs. IDGA- WESTERN BLOTTING

 Animal

ENFERMO SANO

+ Positivo Falso positivo

verdadero
Prueba

- Falso negativo Negativo

verdadero
CLASIFICACIÓN DE PRUEBAS PARA MEDIR LA RESPUESTA INMUNE
HUMORAL

1. PRIMARIAS Miden la cantidad de complejo Ag-Ac formado

Miden las consecuencias de la unión Ag-Ac in

2. SECUNDARIAS
vitro

3. TERCIARIAS Miden las consecuencias o el efecto

protector de anticuerpos en el animal (in
vivo)
 Evolución de los anticuerpos contra Brucella abortus

1800
1600
1400 Ig M
1200 Post-infección
1000
800
Natural
600 Ig G
400
200
0
0 30 60 90 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12 15 18 21 24 27 30 33 36

1800
1600
1400
1200
Ig M
Post- Vacunación 1000
B. abortus cepa 19 800
600
400
200
Ig G
0
0 15 30 45 60 75 90 5 0 5 0 5 0
10 12 13 15 16 18
 Respuesta inmune humoral
Brucella abortus

Isotipo Cantidad Presencia Características

IgM Abundante Temporaria Inespecífica ?

IgG1 Abundante Continua Específica
IgG2 Escasa Discontinua Específica
IgA Abundante Discontinua Específica
 APLICACIONES EN R. A.
BRUCELOSIS BOVINA
Resolución 438/2006 del SENASA.

Prueba
TAMIZ BPA – ELISA I

COMPLEMENTARIAS SAT + 2-ME – FPA

ELISA C
DEFINITORIA FC

VIGILANCIA PAL - ELISA I

EPIDEMIOLÓGICA
PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS

ELISA

Fundamento: visualización de la cantidad de Ag-Ac formado a

través de marcadores ligados a enzimas, que en presencia del
sustrato específico, producen una reacción colorimétrica.

ENZIMAS UTILIZADAS SUSTRATO

• PEROXIDASA • ortofenildiamina
• Fosfatasa alcalina • paranitrofenilfosfato
 ELISA
Tipos de pruebas

INDIRECTA SANDWICH COMPETICIÓN

detección de detección de detección de

ANTICUERPO ANTÍGENO ANTICUERPO
 ELISA INDIRECTO

Lavado Lavado Lavado

ANTÍGENO Suero ANTIGLOBULINA

adsorbido PROBLEMA marcada con SUSTRATO de la
(reactivo) ENZIMA (reactivo) enzima (reactivo)

Detección de ANTICUERPOS CAMBIO DE COLOR

 ELISA COMPETICIÓN
COLOR
N
E
G
A
T
I Lavado Lavado Lavado Lavado
V
O
Suero Ac Conj. con Sustrato
Antígeno Problema monoclonal enzima cromógeno
peroxidasa
P
O
S
I Y Y Y Y
T
I Lavado Lavado Lavado Lavado
V
O
AUSENCIA DE COLOR
 VENTAJAS DESVENTAJAS

 Alta sensibilidad y especificidad

ELISA
 Costo microplacas
 Rápido
 Reactivos estables  Costo equipo automatización
 Resultado visual

APLICACIONES EN VETERINARIA

 Brucelosis Bia  Babesia  Cuantificación de

inmunoglobulinas
 IBR Leucemia felina  Trichinella
 BVD Salmonella  Toxoplasma
 Peste porcina Aftosa  Toxocara
 Aujesky Estreptococos  Hormonas
 Newcastle TBC  Micotoxinas
PRUEBAS SECUNDARIAS
 La prueba a realizar depende de las
características del Ag

 SOLUBLE PRECIPITACIÓN

 PARTICULADO AGLUTINACIÓN

 SUPERFICIE + COMPLEMENTO FIJACIÓN DE

COMPLEMENTO
 Comparación precipitación - aglutinación

Antígeno Anticuerpo Antígeno

SOLUBLE PARTICULADO

Formación de “retículo” “Amontonamiento”

PRECIPITACIÓN AGLUTINACIÓN
 AGLUTINACIÓN

Fundamento: un antígeno particulado (ejemplo:

bacterias, eritrocitos), al ser puesto en contacto con su
anticuerpo específico en proporciones óptimas, se une
por medio de enlaces cruzados. Este complejo de unión
agruma, produciendo una reacción de aglutinación.
FENÓMENO DE ZONA O PROZONA

Se produce cuando existe un marcado exceso de Ac con

respecto a los determinantes antigénicos de la partícula, de
tal manera que es poco probable que los dos sitios de unión
de la Ig puedan unirse a dos determinantes antigénicos de
dos partículas distintas, inhibiéndose de este modo la
aglutinación. Generalmente ocurre en las diluciones bajas de
sueros muy positivos.
 Y
Proporción
YY
+ YY Y Y
Antígeno
particulado Suero problema AGLUTINACIÓN
(reactivo)
Medio
 AGLUTINACIÓN

En PLACA En TUBO

Salmonella Brucella Micoplasma Brucella

BPA
SAT+2-ME PAL
 Aglutinación en placa: BPA
Prueba del Antígeno Brucélico Acidificado

1. Suero problema 2. Antígeno específico

(reactivo)

Aglutinoscopio + placa de
vidrio
 8 MINUTOS

3. Mezclar LECTURA E
INTERPRETACIÓN

Con GRUMOS Sin GRUMOS

AGLUTINACIÓN POSITIVA Negativa

Aglutinación en tubo: SAT + 2-ME

SAT (Seroaglutinación en Tubo)

Se realizan en
Ig M Ig G simultáneo

2- ME (2- Mercaptoetanol)
 En TUBO: SAT + 2- ME

2. Solución fisiológica fenicada (SFF)

1. Suero problema 3. Antígeno

60 MINUTOS
SUERO
BPA (+) SAT

1/25 1/50 1/100 1/200 Título 37ºC-48 hs

2-ME
2. Solución 2-ME
 LECTURA e INTERPRETACIÓN

37ºC-48 hs

POSITIVA INCOMPLETA NEGATIVA

 FIJACIÓN DE COMPLEMENTO

Fundamento: la activación (“fijación”) del complemento

por el anticuerpo unido al antígeno hace que se generen
complejos de ataque de membrana. Si el anticuerpo se
une a eritrocitos, éstos se destruyen y sobreviene
hemólisis.
 FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
2 sistemas

Sistema de PRUEBA Sistema INDICADOR

• Suero problema • Eritrocitos

• Antígeno específico
• Hemolisina (Ac. anti eritrocitos)
• Complemento
 FIJACIÓN DE COMPLEMENTO

SIN
Antígeno Eritrocitos
HEMÓLISIS

Y YY C
Y POSITIVO
Suero problema Complemento Ac antieritrocitos

Con
HEMÓLISIS

- C Y
Suero problema
Negativo
APLICACIONES EN VETERINARIA

BRUCELOSIS
 IBR
 DVB
 AFTOSA
 MOQUILLO CANINO
 TOXOPLASMOSIS
POLARIZACIÓN FLUORESCENTE
(FPA)
 Fundamento:
Se produce in vitro una reacción antígeno-anticuerpo,
enfrentando el suero de un animal enfermo de
brucelosis con una fracción de del antígeno de
bruecella (cadena O), este complejo forma una masa
grande que en suspensión gira mas lentamente .
Además ese antígeno se conjuga con isotiocianato de
fluoresceína (IFTC) y se hacen incidir distintos haces
de luz. El complejo emitirá luz con distintos grados
de despolarización en función de su velocidad de
rotación.
 Aglutinación en tubo: PAL
PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE

Fundamento: si en una muestra de leche se encuentra

un anticuerpo específico, y se le agrega un antígeno
particulado coloreado, ambos se unirán, formando un
complejo Ag-Ac que se adhiere a los glóbulos de grasa y
asciende con la nata
PAL

2. Antígeno (reactivo)

1. Leche problema

LECTURA e INTERPRETACIÓN

37ºC-1 hora

+ ++ +++ ++++
PRUEBAS MOLECULARES

REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA

HIBRIDOMA
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)

Multiplicación de una secuencia de ADN

específica y conservada de la especie a
identificar, que puede ser visualizada y
cuantificada
 NUCLÉOTIDO

Base nitrogenada
Fosfato

Azúcar
 ADN

AZÚCAR

FOSFATO

CADENA DE AZÚCAR
Y FOSFATO
BASE
 ADN

 OLIGONUCLEÓTIDOS (PRIMERS)

A T
 NUCLEÓTIDOS
G C

 POLIMERASA
 Polimerasa

Primers

Primers
Polimerasa
 ADN
100
Desnaturalización 94º C
90 1 min

80 Primers

Extensión 72º C
70 1 min
35 ciclos
60
Hibridación 56º C

50 1 min

40 Polimerasa
30
dNTP
20
Detección
Producto de PCR para identificar Brucella spp en
muestras de leche
Producto de PCR para caracterizar cepas de
Brucella abortus en muestras de leche
 n=223
ID PCR Cultivo FC ELISA-C ELISA-I
11 B. abortus silv. - + + +
17 B. abortus silv. - + + +
33 B. abortus silv. - + + +
58 B. abortus silv. - + + +
61 B. abortus silv. - + + +
113 B. abortus silv. - + + +
168 B. abortus silv. - + + +
172 37B.%abortus
con B.silv.
abortus silvestre
- se +infectó con RB51
+ +
189 0,8B.%abortus
de lassilv.
sanas se infectó
- con+B. abortus +RB51 +
242 B. abortus silv. (p<0,0001)
- + + +
255 B. abortus silv. - + + +
1487 B. abortus silv. - + + +
151 B. abortus silv – RB51 - + + +
157 B. abortus silv – RB51 + + + +
179 B. abortus silv – RB51 - + + +
228 B. abortus silv – RB51 - + + +
260 B. abortus silv – RB51 - + + +
1380 B. abortus silv – RB51 - + + +
124 B. abortus RB51 - - - -
Tipos de
PCR
 CON PRIMERS ANIDADOS

 ASIMÉTRICA

 INVERSA

 MULTIPLEX

 NESTED
VENTAJAS

 FIDELIDAD

 SENSIBILIDAD

 ESPECIFICIDAD

 AUTOMATIZACIÓN
 APLICACIONES

 Diagnóstico (virales- bacterianas- parasitarias- micóticas)

 Enfermedades hereditarias

 Enfermedades autoinmunes

 OncologÍa

 Medicina forense

 Arqueología
HIBRIDOMA
Selección
in vitro
en el medio
HAT