REPLICACIÓN DEL MATERIAL

GENÉTICO

Replicación ADN
El ADN es la macromolécula depositaria de la información
genética.
Transcripció
Metabolismo de la información: procesos que intervienen
en el almacenamiento, recuperación, procesamiento y
transmisión de la información genética (Figura 1). Los
principales procesos de este metabolismo son: la
replicación (el ADN, o ARN en algunos virus, actúa de
molde para su propia síntesis), la transcripción (la ARN
información codificada en el ADN determina la estructura de
los ARNs) y la traducción (el ARN actúa como molde para la
síntesis de una proteína). Estos 3 procesos tienen en
común la necesidad de un molde y el desarrollarse en 3
etapas centrales: iniciación, elongación y terminación. Traducción
Tomaremos como modelo E. coli.

Proteína
CARACTERÍSTICAS DEL PROCESO DE
REPLICACIÓN DEL ADN
1)LA REPLICACIÓN DEL ADN ESTÁ
COORDINADA CON EL CICLO DE
CRECIMIENTO Y DIVISIÓN CELULAR.
2)LA REPLICACIÓN ES SEMICONSERVATIVA
 Según Watson y Crick las dos cadenas del ADN son
complementarias y cada una actúa como molde para
la síntesis de la hebra complementaria, da lugar a dos
moléculas de ADN duplohelicoidal idénticas al ADN
original, de modo que cada ADN contiene una hebra
vieja y una nueva.
 Este postulado fue confirmado por Stahl en 1957:
cultivaron durante varias generaciones E. colicon
N15, de modo que todos los componentes
nitrogenados de la célula contendrían N15 y por tanto
al centrifugar en gradiente con cloruro de cesio
tendrían mayor densidad de sedimentación el ADN
marcado con N15 y no con N 14. Posteriormente
transfieren las bacterias al ADN con un medio con
N14, se extrae el ADN, se centrifuga en gradiente de
cesio y se obtiene una banda con densidad de
centrifugación intermEdia que corresponde al ADN
híbrido. Tras una segunda generación se repitió el
experimento y se aisló el ADN y se centrifugó en
gradiente de clouro de cesio obteniéndose una banda
a medio caminno y una banda a elevado nivel o ADN
ligero.
3) LA REPLICACIÓN COMIENZA EN UN PUNTO
DE ORIGEN Y ES BIDIRECCIONAL:
Se plantean a nivel de replicación una serie de
interrogantes:
- ¿Se desenrrollan totalmente las cadenas de
ADN parental para que cada una sea replicada?
- ¿Dónde comienza la replicación: en sitios al
azar o en un punto único?
- Si se inicia en un punto ¿se da en una
dirección o en ambas?
- John Cairns proporcionó la primero indicación de que
la preplicación es un proceso altamente coordinado en
el que las dos hebras parentales se desenrrollan y se
replican simultáneamente.
- Esta hipótesis se confirmó aislando y examinando el
cromosoma de E. coli (bacteria que vive en nuestro
intestino grueso y contienen un cromosoma circular y
puede contener otros ADN en forma de plásmidos, que
pueden contener más de una copia de 3 a 100 genes
y pueden contener más de una copia una misma
célula.
- Cairns cultivó E. coli durante una generación o 1,5
generaciones en un medio con timidina tritiada. En la
primera generación originó una progenie que contenía
una hebra marcada radioactivamente y otra hebra no.
La primera generación obtuvo bacterias y mediante
autorradiografía examinó el ADN, su radioactividad
reveló el cromosoma entero y la segunda revelaba
ADN incorporado de novo. Al analizar la película
fotográfica observó un nuevo lazo en forma de letra
griega tedta. La zona de intersección entre las dos
zonas responsables y no replicadas se llama horquilla
de replicación.
- Para explicar si era mono o bidireccional se observó
que la mayor radioactividad se sitaba en las dos
horquillas de replicación, lo que indicaba que la
replicación era bidireccional.
- Otros experimentos indicaron que la replicación se
iniciaba en un punto único denominado OriC u origen
de repliación. Es un gen de 245 pb con cuatro
secuencias repetidas.
4) La síntesis de ADN transcurre en dirección
5´  3´ y es semidiscontinua
Las cadenas de ADN siempre son sintetizadas en la dirección
5´  3´, siendo el 3´OH libre el punto de elongación del ADN.
Debido a que las cadenas de ADN son antiparalelas, la
cadena que actúa de molde es leída del extremo 3´ al 5´.
Si la síntesis transcurre siempre en la dirección 5´  3´,
¿cómo pueden sintetizarse simultáneamente las dos
cadenas? Si las dos cadenas fuesen sintetizadas
continuamente a medida que avanza la horquilla de
replicación, una tendría que se sintetizada en dirección 3´  5
´. Este problema fue resuelto por Reiji Okazaki y col en la
década de 1960, al descubrir que una de las cadenas es
sintetizada en forma de trozos cortos, denominados
fragmentos de Okazaki. Este trabajo condujo a la conclusión
de que una de las cadenas es sintetizada de forma continua y
la otra discontinua (Figura 4). La cadena continua o cadena
conductora es aquella cuya síntesis en dirección 5´  3´
transcurre en la misma dirección que el movimiento de la
horquilla de replicación. La cadena discontinua o cadena
rezagada es aquella cuya síntesis en dirección 5´  3´
transcurre en dirección opuesta a la dirección del movimiento
de la horquilla. Como veremos más adelante, la síntesis de la
hebra conductora y rezagada están estrechamente
coordinadas.
5) EL ADN ES SINTETIZADO POR LAS
ADN POLIMERASAS
PROCESO GLOBAL DE REPLICACIÓN EN
PROCARIOTAS

La síntesis de una molécula de ADN es un

proceso muy complejo en el que participan,
además de las ADNp, 20 o más enzimas y
proteínas diferentes y que se puede dividir en
tres fases: iniciación, elongación y terminación.
Estas fases se distinguen por las reacciones
que tienen lugar y por las enzimas implicadas y
reflejan la información obtenida de experimentos
en E. coli.
 1. Iniciación
La replicación del cromosoma de E. coli se inicia en
una secuencia de origen denominada oriC. oriC. Este origen
consta de 245 pb y contiene secuencias muy
conservadas entre los orígenes de replicación
bacterianos. Las secuencias clave son dos series de
repeticiones cortas: una de las series consta de tres
repeticiones de una secuencia de 13 pb, con una
cantidad abundante de A y T (puede desnaturalizarse
con facilidad) y la otra serie está formada por cuatro
repeticiones de una secuencia de 9 pb. (Figura. 10)
En la fase de iniciación de la replicación participan al
menos ocho enzimas o proteínas diferentes (tabla 2).
Éstas se encargan de abrir la hélice del ADN en el
origen y establecen un complejo precebador para las
reacciones posteriores (Figura 11). El componente
clave en el proceso de iniciación es la proteína DnaA.
Un complejo formado por unas 20 moléculas de
proteína DnaA se une a las cuatro repeticiones de 9 pb
en el origen, a continuación reconoce y sucesivamente
desnaturaliza el ADN en la región de las repeticiones
de 13 pb. Este proceso requiere ATP y la proteína
bacteriana HU, del tipo de las histonas, que facilita que
el ADN se doble y desenrolle. Seguidamente, la
proteína DnaB se une a esta región, en una reacción
que requiere la proteína DnaC. Dos hexámeros de
DnaB, uno en cada horquilla, actúan de helicasa,
desenrollando el ADN de manera bidireccional y
creando dos horquillas de replicación potenciales.
Simultáneamente muchas moléculas de la proteína de
unión al ADN de cadena sencilla (SSB) se fijan de
manera cooperativa al ADN, estabilizando las cadenas
separadas e impidiendo su renaturalización. Otra
enzima, la ADN girasa (una ADN topoisomerasa) alivia
la tensión topológica creada por la DnaB helicasa.
La iniciación es la única fase de la replicación que está regulada, de
modo que sólo tenga lugar una vez cada ciclo celular.
Incluso con el molde de ADN expuesto, no se puede sintetizar un
nuevo ADN a menos que se construya un cebador. Recordemos
que todas las ADNp conocidas necesitan un cebador con un grupo
OH libre en el extremo 3´ para sintetizar ADN en dirección 5´  3´.
Kornberg descubrió que durante la replicación había sobre el ADN
pequeñas cantidades de ARN. Este ARN, de entre 10 y 60
nucleótidos, es precisamente el que hace de cebador y es
sintetizado por la enzima primasa (proteína DnaG, que es una ARN
polimerasa, las cuales, como veremos después, no necesitan
cebador) y sobre el que la ADNp III añade desoxirribonucleótidos en
la fase de elongación.
 2. Elongación

La fase de elongación consiste en dos operaciones

distintas pero relacionadas: la síntesis de la hebra
conductora y la síntesis de la hebra rezagada.
La síntesis de la hebra conductora empieza con la
síntesis del cebador de ARN por la primasa en el
origen de replicación. A continuación la ADNp III
adiciona desoxirribonucleótidos a este cebador.
Una vez iniciada, la síntesis de la hebra conductora
transcurre de manera continua, al mismo ritmo que
el desenrollamiento del ADN en la horquilla de
replicación.
La síntesis de la hebra rezagada se realiza a
trozos. Primero, un cebador de ARN es sintetizado
por la primasa y, como en la síntesis de la hebra
conductora, la ADNp III se une al cebador de ARN
y añade desoxirribonucleótidos. A este nivel, la
síntesis de los fragmentos de Okazaki parece
sencilla, pero es en realidad muy compleja. Esta
complejidad reside en la coordinación de la síntesis
de las hebras conductora y rezagada, puesto que
ambas hebras son producidas por un único dímero
asimétrico de ADNp III. Para ello la hebra molde de
la cadena rezagada forma un bucle para aproximar
los dos puntos de polimerización y conseguir que
las dos cadenas en síntesis tengan la misma
polaridad.
La síntesis de los fragmentos de Okazaki pone en
juego complejas actividades enzimáticas (Figura 13).
La helicasa DnaB y la primasa constituyen una
unidad funcional dentro del complejo de replicación,
denominada primosoma. La ADNp III usa un juego de
subunidades núcleo (polimerasa núcleo) para la
síntesis continua de la hebra conductora, mientras
que el otro juego de subunidades núcleo circula entre
un fragmento de Okazaki y el siguiente sobre el
bucle. A medida que el ADN es desenrollado por la
helicasa DnaB en la horquilla de replicación, la
primasa ocasionalmente se asocia con la helicasa
DnaB y sintetiza un corto cebador de ARN. Una
nueva abrazadera deslizante β es entonces
posicionada en el cebador por el complejo cargador
de la abrazadera de la ADNp III. Cuando se ha
completado la síntesis de un fragmento de Okazaki,
la replicación se detiene y las subunidades núcleo de
la ADNp III se disocian de su abrazadera deslizante y
se asocian con la siguiente. Ello inicia la síntesis de
un nuevo fragmento de Okazaki.
EL proceso permite la síntesis de unos 1000
nucleótidos por segundo en cada hebra. Una vez
finalizada la síntesis de un fragmento de Okazaki, su
cebador es eliminado y reemplazado con ADN por la
ADNp I (actividad exonucleasa 5´  3´ y polimerasa,
respectivamente) y la mella restante es sellada por
una ADN ligasa (Figuras 14 y 15).
La ADN ligasa cataliza la formación de un enlace
fosfodiéster entre un OH 3´, al final de un fragmento,
y un fosfato 5´ al final de otro fragmento. La energía
necesaria se obtiene acoplando la reacción a la
escisión de NAD+ (E. coli y otras bacterias) o de ATP
(eucariotas y algunos virus).
 3. Terminación

Finalmente, las dos horquillas de replicación del

cromosoma circular de E. coli se encuentran en
una región terminal que contiene múltiples copias
de una secuencia de 20 pb denominada Ter (por
terminal).
terminal). Las secuencias Ter actúan en el
cromosoma como una especie de trampa donde
una horquilla de replicación puede entrar pero no
salir (Figura 16). Las secuencias Ter son lugares de
unión para una proteína denominada Tus (por
sustancia de utilización del terminal en inglés). El
complejo Ter-Tus
Ter-Tus puede detener la replicación
desde una sola dirección. Sólo actúa un complejo
Ter-Tus
Ter-Tus por ciclo de replicación. Cuando una
horquilla de replicación topa con un complejo Ter-
Ter-
Tus se detiene; la otra horquilla se detiene cuando
encuentra a la primera ya detenida. Los pocos
centenares de pares de bases finales entre estos
grandes complejos proteicos son replicados a
continuación mediante un mecanismo aún
desconocido. El resultado son dos cromosomas
circulares ligados en el espacio. Los círculos de
ADN unidos de este modo se denominan
concatenados; su separación requiere, en E. coli,
una topoisomerasa. Los cromosomas separados
son segregados en las células hijas en la división
celular.