UNIVERSIDAD SAN PEDRO

FARMACIA Y BIOQUIMICA

AN ÁL I S IS C L Í N ICO I
SEMESTRE 2017- II
VIII CICLO

Docentes: MsC. Lic. Javier Solar Anticona

MsC. Mblgo. Diana Morillos Carrasco
 TEMA 11

MÉTODOS INMUNOLÓGICOS
Métodos inmunológicos

- La reacción antígeno-anticuerpo se puede utilizar para detectar

antígenos (si se dispone de anticuerpos específicos) o anticuerpos (si se
dispone de antígeno purificados)

- Estas dos afirmaciones constituyen la base de las pruebas

inmunológicas para la detección de los antígenos microbianos y para la
detección de anticuerpos sintetizados frente a ellos (diágnostico
serológico)
Métodos inmunológicos

- Las reacciones inmunológicas pueden realizarse en tubos

convencionales, membranas, portaobjetos o en micropocillos de placas
de microtitulación

Placas de microtitulación
1. Detección de antígenos

Pretenden detectar el microorganismo utilizando anticuerpos

específicos marcados
- Algunas técnicas tienen valor diagnóstico, en algunos casos son
confirmadas por otras, o incluso como técnicas de referencia por su
elevada eficacia

- Muchas de estas técnicas son más rápidas, sencillas, económicas e

incluso más sensibles que el cultivo, como en el caso de las clamidias o
los virus

- Junto con la PCR, estas técnicas constituyen los métodos más

utilizados en la actualidad en los laboratorios de virología

- Como se investiga un único microorganismo en cada prueba y al

tratarse de pruebas caras y laboriosas, debe establecerse una cuidadosa
evaluación clínica del paciente para solicitar la prueba adecuada
1.1. Obtención de anticuerpos

- Los anticuerpos utilizados pueden ser policlonales (obtenidos a

partir de animales inmunizados con el antígeno) o monoclonales
(producidos in vitro)

Anticuerpos policlonales

Anticuerpos monoclonales
1.2. Marcado de las inmunoglobulinas

- Al fragmento Fc de una Ig pueden unirse químicamente diversas

sustancias:

- Enzimas: al actuar sobre un sustrato lo transforman en un

producto de diferente color

- β-galactosidasa sustrato producto coloreado

- fosfatasa alcalina enzima

- peroxidasa de rábano

anticuerpo

antígeno
1.1.2. Marcado de las inmunoglobulinas

- Sustancias fluorescentes: producen luz cuando son excitadas por una

radiación incidente

- isotiocianato de fluoresceína
- rodamina
- umbeliferona
- lantánidos
- Sustancias lumínicas: producen luz por medio de una reacción
química, generalmente una oxidación (quimioluminiscencia)

- luminol

- isoluminol

- ésteres de acridina

- adamantil dioxietano
- Partículas inertes: Todos los anticuerpos pueden fijarse a través de
su fragmento Fc a la superficie de una membrana o de partículas
inertes (látex, gelatina, oro coloidal)

Las inmunoglobulinas marcadas sirven para detectar tanto antígenos

como otros anticuerpos
Técnicas de detección de antígenos

- Si en una muestra clínica (LCR, orina, esputo) está presente un

determinado microorganismo, al añadirle los anticuerpos marcados
específicos contra él se fijarán al microorganismo y se producirá el
efecto o la señal correspondiente:

- aglutinación
- cambio de color de un sustrato
- fluorescencia
- emisión de luz

- Por el contrario, si el microorganismo buscado no está presente en la

muestra, los anticuerpos no podrán unirse a él y no se producirá la
señal
Aglutinación

- Se utilizan anticuerpos adheridos por

su región Fc a partículas grandes de
látex que facilitan la observación de la
aglutinación al formarse grumos de
gran tamaño

- Permiten la detección de antígenos

solubles (polisacárido); se pueden
realizar sobre un portaobjetos y se
llevan a cabo en tan sólo unos minutos
Inmunofluorescencia

- Se utilizan anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes que se

fijan a los microorganismos (inmunofluorescencia directa, IFD)

- La visualización se realiza con un microscopio de fluorescencia

observándose el microorganismo brillante (fluorescente) sobre un
fondo oscuro
Inmunofluorescencia directa (IFD)

- Aunque los virus no pueden ser observados por su pequeño

tamaño en un microscopio óptico, se pueden detectar las proteínas
víricas que producen cuando se están multiplicando en una célula,
mediante anticuerpos específicos para esas proteínas
 Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

ELISA: enzyme linked immunosorbent assay

1 - En la placa de microtitulación se fijan anticuerpos específicos
contra el antígeno que se quiere detectar

2 -Se añade la muestra al pocillo y si el antígeno del

microorganismo buscado está presente, los anticuerpos lo
fijan (se unen a él)

3 - Se añade un anticuerpo dirigido contra el antígeno (igual al

del pocillo, pero marcado con una enzima que se fija al
antígeno)

4 - Se añade el sustrato (incoloro) sobre el que actúa la enzima

5 - Aparece un color (producto coloreado) cuya intensidad se

puede medir en un colorímetro. Cuando en la muestra no
existe el antígeno buscado, no se produce color
1.1.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
Muestra

Unión Lavado Marcado Lectura

Enzima Sustrato
Anticuerpo sin color
Sitio de
unión Anticuerpo Producto
secundario coloreado
Antígeno viral
anti-anticuerpo
del paciente
1.2. Detección de anticuerpos
(pruebas serológicas)

- Las pruebas serológicas constituyen un método indirecto de diagnóstico

al detectar en el suero del paciente los anticuerpos formados frente al
microorganismo causante de la infección

- Necesitan que haya una buena respuesta de anticuerpos

- Sólo pueden utilizarse cuando una infección está plenamente instaurada

- Las técnicas permiten calcular la cantidad de anticuerpos (título de

anticuerpos)
Muestras de suero

- Deben extraerse entre 5 y 10 mL de sangre, dejar que coagule a

temperatura ambiente (20 minutos) y separar el suero por
centrifugación (1.000-1.200 g durante 10 minutos)

- Una vez separado el suero, puede mantenerse a 4-6ºC durante una

semana, pero es preferible congelarlo a -20ºC (se conserva años si se
evita la descongelación y congelación repetidas)

Pruebas serológicas

- La reacción antígeno-anticuerpo puede evidenciarse por técnicas

semejantes a las descritas para la detección de antígenos

-Las más utilizadas son: aglutinación directa, inmunofluorescencia y

enzimoinmunoanálisis
Aglutinación

- Puede realizarse sobre un portaobjetos, en tubos de ensayo o en placas

de microtitulación

- Se prepara una suspensión del microorganismo (antígeno )

- Al enfrentar la suspensión al suero del paciente, si hay anticuerpos, las

partículas microbianas aglutinan: sobrenadante transparente y la
formación de muchos grumos cuando se resuspende el sedimento

Se hacen diluciones del suero

para ver la cantidad (el título)
de anticuerpos

- El título de anticuerpos es la dilución

más alta del suero en la que se
detecta aglutinación
 Inmunofluorescencia

- En tres zonas de un portaobjetos se deposita una suspensión de un

microorganismo (antígeno)

- Cada zona se baña con una dilución

diferente de suero de un paciente (1/10,
1/100 y 1/500)

- Lavado

-Después de lavar el portaobjetos, se

añade una solución de anticuerpos de
conejo anti-Ig humana marcados con
un producto fluorescente

- Se observa con el microscopio de

fluorescencia: en los lugares donde
se ha producido una reacción
antígeno-anticuerpo, se observará señal
Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

- El antígeno microbiano se fija en el fondo de un pocillo, se añade el

suero de un paciente y se incuba

- Si el suero poseía anticuerpos contra ese antígeno, éstos se habrán

fijado a él, arrastrándose mediante el lavado el resto de
inmunoglobulinas presentes

- A continuación se añaden anticuerpos dirigidos contra la Ig humana,

obtenidos en conejos y marcados con una enzima

- Al añadir el sustrato incoloro, si se ha producido la reacción antígeno-

anticuerpo, aparecerá color
Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

Si falta este anticuerpo, es decir, si en el

suero del paciente no hay anticuerpos
no se detecta color al final